UNIVERSIDADE FEDERAL DE PELOTAS Programa de Pós-Graduação em Veterinária
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- Salvador Madeira Silva
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1 UNIVERSIDADE FEDERAL DE PELOTAS Programa de Pós-Graduação em Veterinária Dissertação Perfil protéico do plasma seminal de suínos e sua associação com a qualidade do sêmen congelado C A R I N E D A H L C O R C I N I Pelotas, 2008
2 CARINE DAHL CORCINI Perfil protéico do plasma seminal de suínos e sua associação com a qualidade do sêmen congelado Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Veterinária da Universidade Federal de Pelotas, como requisito parcial à obtenção do título de Mestre em Ciências (Área do conhecimento: Reprodução Animal). Orientador: Thomaz Lucia Junior Co-Orientadores: Denise Calisto Bongalhardo João Carlos Deschamps
3 Pelotas, 2008
4 Banca examinadora: Dr. Thomaz Lucia Junior Dra. Denise Calisto Bongalhardo Dr. Fernando Pandolfo Bortolozzo Dr. João Carlos Deschamps
5 Dedico este trabalho ao meus pais, Maria e Pedro, minha irmã Renata e ao meu namorado Sergio que sempre me apoiaram, me motivaram e vibraram a cada conquista, consolaram-me frente as dificuldades, deram-me a força necessária para continuar em busca do meu sonho, fornecendo-me a segurança e a paz do mais sublime amor, sendo fundamentais nos momentos da minha vida... AMO MUITO VOCÊS!!!
6 AGRADECIMENTOS Inicialmente, agradeço a Deus por me permitir chegar até aqui e colocar pessoas tão especiais no meu caminho. Aos meus pais, Maria Delci Dahl Corcini e Pedro Renato Bochi Corcini, por ser hoje o que sou, pela confiança dedicada a mim, por tudo que conquistei e que ainda vou conquistar; por nunca medirem esforços e fazerem tudo que estava ao alcance, abdicando dos seus sonhos para que eu realizasse o meu. À minha irmã, Renata, pela amizade, pelo carinho, pelo auxílio na busca do conhecimento na hora do desespero. Ao meu namorado, Antonio Sergio, pelo amor, compreensão, amizade, apoio, por me incentivar a ir em busca dos meus ideais. Ao meu orientador e amigo, Professor Dr. Thomaz Lucia Junior, minha admiração pelo profissional de tão elevada capacidade, a quem devo a oportunidade de grandes ensinamentos como, principalmente, questionar, duvidar, pensar e até sonhar. Agradeço pela confiança depositada em mim e pelas oportunidades de crescimento profissional e pessoal. Ao Professor Dr. João Carlos Deschamps, agradeço pela orientação, pelos conselhos, pelo exemplo de dedicação à pesquisa e pelo carinho com que zela por seus alunos. À amiga e Professora Dra. Denise Bongalhardo, pela amizade, carinho, incentivo e auxílio em todos os momentos. Aos amigos e colegas de Pós-graduação Gissele Rambo, Karina Goularte, Elisa Santos e Priscila de Leon, cujo convívio me proporcionou momentos de alegria, mas também de aprendizado para o crescimento pessoal, assim como auxílio na execução deste trabalho. Aos estagiários do grupo PigPel, Rudy, Fernando, Kérlim e Éder, pelo auxílio durante o desenvolvimento experimental e, acima disso, por existirem! Agradeço por terem me permitido participar do convívio e da amizade de vocês. Aos colaboradores do Centro Agropecuário da PALMA, local de alojamento dos animais utilizados nos experimentos.
7 Aos colegas e amigos do Laboratório de Bioténicas da Reprodução Animal, Raquel, Gustavo, Cristian e Vinicius, pela valiosa ajuda no experimento. Aos laboratórios do Centro de Biotecnologia (CENBIOT), pela disponibilidade da infra-estrutura e materiais na realização do trabalho. À Professora Dra. Célia Carlini e sua equipe do Laboratório de Proteínas Tóxicas e ao Dr. Fabiano Severo Rodembusch e sua equipe do Laboratório de lnmolaboratório de novos materiais orgânicos da Universidade Federal do Rio Grande do Sul, pela importante ajuda na interpretação dos géis de poliacrilamida. A todos os professores e funcionários do Centro de Biotecnologia e da Faculdade de Veterinária, pelo apoio e por sempre se dedicarem, dando o melhor de si e preocupando-se com a minha formação. À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES), pela concessão da bolsa de estudos. A todos que direta ou indiretamente contribuíram de alguma forma para a realização deste trabalho... MUITO OBRIGADA
8 Resumo CORCINI, Carine Dahl. Perfil protéico do plasma seminal de suínos e sua associação com a qualidade do sêmen congelado f. Dissertação (Mestrado) Programa de Pós-Graduação em Medicina Veterinária. Universidade Federal de Pelotas. A inseminação artificial (IA) em suínos com sêmen congelado apresenta índices de desempenho reprodutivo insatisfatórios, em comparação com a IA com sêmen resfriado. Entre outros fatores, esta ineficiência pode ser atribuída aos diluentes e à variação entre os machos doadores de sêmen, que podem apresentar diferente conteúdo de proteínas no plasma seminal. O objetivo deste trabalho foi avaliar o conteúdo protéico de diferentes porções do ejaculado de suínos, antes destas serem submetidas ao congelamento, e a associação entre a presença de proteínas identificadas no plasma seminal e indicadores de qualidade seminal pósdescongelamento, visando a identificação de marcadores bioquímicos associados com a congelabilidade do sêmen de diferentes machos e frações do ejaculado. A porção do ejaculado rica em espermatozóides foi fracionada em duas amostras, as quais foram congeladas em diluente contendo 5% de dimetilacetamida como crioprotetor interno. O conteúdo protéico do plasma seminal foi avaliado por eletroforese unidimensional e associado com motilidade e integridade da membrana espermática pré e pós-congelamento, e morfologia espermática e integridade de acrossoma pós-congelamento. Foram conduzidas análises inter-machos, nas quais o efeito individual foi ajustado, e intra-machos, nas quais as análises foram estratificadas para cada macho. A primeira porção do ejaculado, consistindo dos primeiros 10 ml coletados, apresentou melhores indicadores de qualidade seminal pós-descongelamento, em comparação com a segunda porção do ejaculado. Nove proteínas presentes no plasma seminal apresentaram associação significativa com parâmetros de qualidade do sêmen congelado, tanto na análise inter-machos, como na intra-machos. Dentre estas nove proteínas, duas dela, que possuem peso molecular de 28 e 100 kda foram associadas, respectivamente, com a motilidade pós-descongelamento e com a integridade da membrana espermática précongelamento e pós-descongelamento (P < 0,05), sendo, portanto, potenciais candidatas a marcadores bioquímicos para qualidade de sêmen de suínos. Palavras-chaves: Congelamento, proteínas, plasma seminal, suínos.
9 Abstract CORCINI, Carine Dahl. Protein profile of swine seminal plasma and its association with quality of frozen semen p. Master s Dissertation Programa de Pós-Graduação em Medicina Veterinária. Universidade Federal de Pelotas Artificial insemination (AI) in swine with frozen semen presents lower reproductive performance than AI with cooled semen. Such inefficiency can be attributed to many factors, especially to the semen extenders and individual boar effects, since boars may have different protein content in their seminal plasma. The objective of this study was to evaluate the protein content of distinct portions of the ejaculate of boars, prior to freezing, and the association between the presence of the proteins in the seminal plasma and parameters of semen quality post-thawing, to identify biochemical markers potentially associated with semen freezability in different boars and portions of the ejaculate. The sperm-rich portion of the ejaculate was fractioned in two samples, which were frozen in an extender containing 5% dimethylacetamide as a penetrating cryoprotectant. The protein content of the seminal plasma was evaluated through unidimensional electrophoresis and associated with sperm motility and membrane integrity, pre-freezing and post-thawing, and to sperm morphology and acrossome integrity post-thawing. Inter-boar analyses were conducted, adjusting for individual effects, as well as intra-boar analyses, which were stratified by boar. The first portion of the ejaculate, consisting of the first collected 10 ml, presented better post-thawing semen quality than the second portion. Nine proteins present in the seminal plasma presented significant association with parameters of semen quality (P < 0.05), in both inter and intra-boar analyses. Among them, two proteins, having molecular weight of 28 and 100 kda were associated, respectively, with post-thawing sperm motility and both pre-freezing and post-thawing sperm membrane integrity. Thus, such proteins are potential biochemical markers for boar semen quality. Key-words: Freezing, proteins, seminal plasma, boars.
10 Lista de Figuras Figura 1 Motilidade pós-descongelamento de espermatozóides suínos em função da presença ou ausência da proteína com 28 kda no plasma seminal de diferentes machos Figura 2 Integridade da membrana pré-congelamento de espermatozóides suínos em função da presença ou ausência da proteína com 100 kda no plasma seminal de diferentes machos 64 65
11 Lista de Tabelas Tabela 1 Motilidade e integridade de membrana de espermatozóides suínos após a coleta, por macho e em diferentes porções do ejaculado (4 machos x 6 coletas) Tabela 2 Motilidade, integridade da membrana espermática e do acrossoma e percentual de morfologia normal para espermatozóides suínos pós-descongelamento, por macho e por porção do ejaculado (4 machos x 6 coletas) Tabela 3 Motilidade, integridade da membrana espermática e do acrossoma e percentual de morfologia normal para espermatozóides suínos pós-descongelamento, por macho em cada porção do ejaculado (4 machos x 6 coletas) Tabela 4 Freqüência e peso molecular de proteínas identificadas em distintas porções do plasma seminal de diferentes machos suínos Tabela 5 Motilidade e integridade de membrana, pré-congelamento e pósdescongelamento, e integridade de acrossoma pósdescongelamento, em função da presença ou ausência de proteínas no plasma seminal de machos suínos (4 machos x 6 coletas) Tabela 6 Motilidade e integridade de membrana, pré-congelamento e pósdescongelamento, e integridade de acrossoma pósdescongelamento, em função do incremento destas variáveis segundo a presença ou ausência de proteínas no plasma seminal de machos suínos (4 machos x 6 coletas)
12 Sumário Banca examinadora... 2 Dedicatória... 3 Agradecimentos... 4 Resumo... 6 Abstract... 7 Lista de Figuras... 8 Lista de tabelas Introdução Geral Revisão: Conteúdo protéico do plasma seminal de machos suínos: associação com estimativas de fertilidade com sêmen congelado Resumo Abstract Introdução Criopreservação de sêmen suíno Associações entre o conteúdo protéico do plasma seminal e estimativas de fertilidade Conclusões Agradecimentos Referências bibliográficas Artigo: Perfil protéico do plasma seminal de suínos e sua associação com a qualidade do sêmen congelado Resumo Introdução Materiais e métodos Coleta de sêmen Processamento do ejaculado e criopreservação Avaliação da motilidade espermática... 40
13 2.4 Avaliação da integridade da membrana espermática Avaliação da integridade do acrossoma Avaliação da morfologia espermática Caracterização das proteínas do plasma seminal Análise estatística Resultados Discussão Conclusão Referências Considerações finais Referências Gerais... 68
14 1. Introdução Geral Nos sistemas tecnificados de produção de suínos, a maioria das inseminações artificiais (IA) é conduzida através da utilização de doses inseminantes (DI) à temperatura em torno de C, que são acondicionadas por, no máximo, cinco dias, com diluentes (JOHNSON et al., 2000). Em comparação com o uso do sêmen resfriado, a IA com sêmen congelado necessita uma DI com número de espermatozóides duas ou três vezes maior (JOHNSON et al., 2000), apresentando índices reprodutivos insatisfatórios, com redução na taxa de parição de 20 30% e no tamanho da leitegada de 1 a 2 leitões por parto (ALMID; HOFMO, 1996; HOFMO; GRELVE, 2000; JOHNSON et al., 2000). Portanto, o uso da IA com sêmen congelado ainda é restrito a programas de melhoramento genético, formação de bancos genéticos e pesquisas científicas (HOFMO; GRELVE, 2000), pois seus resultados insatisfatórios inviabilizam economicamente seu uso nos sistemas de produção (JOHNSON, 1985). Portanto, a técnica de criopreservação de sêmen suíno ainda não atingiu uma padronização que proporcione resultados satisfatórios e consistentes, como ocorre na espécie bovina (WATSON, 2000). Durante o processo de criopreservação, os espermatozóides são expostos a situações adversas à sua homeostase, como choque térmico e estresse osmótico, que podem promover alterações estruturais e funcionais na célula espermática, diminuindo sua capacidade fertilizante (BUHR et al., 1994; BLACH et al., 1989; WATSON, 2000). O choque térmico é definido como um conjunto de alterações ocorridas nos espermatozóides dos mamíferos quando expostos rapidamente a uma temperatura inferior à fisiológica, mesmo antes de ocorrer o congelamento, ou seja, durante o processo de estabilização celular (WATSON, 2000). Nesse processo, ocorre alteração do meio extracelular pela ação dos crioprotetores, bem como modificação no metabolismo celular dos espermatozóides (WATSON, 2000; PETRUNKINA et al., 2007), evitando que a célula espermática sofra a formação de cristais de gelo intra e extracelulares durante o congelamento (MAZUR, 1984). Em
15 função dessas crioinjúrias celulares, ocorre redução na motilidade espermática (BAILEY et al., 2000) e na produção de energia, comprometimento nos processos de capacitação espermática e fertilização (HOFMO; ALMLID, 1991; NARDID et al., 1997) ou mesmo a morte celular (DE LEEUW et al., 1990). Para a proteção contra os efeitos danosos provocados pela criopreservação, é essencial a utilização de crioprotetores intra e extracelulares (HOLT, 2000). Segundo Bianchi et al. (2008), a dimetil acetamida mostrou-se mais eficaz que o glicerol como crioprotetor interno para criopreservação de espermatozóide suíno. Porém, ainda que o crioprotetor seja eficiente, existem outros fatores que influenciam a eficiência do processo de congelamento de sêmen, como a grande variabilidade entre a qualidade do sêmen de diferentes machos (ROCA et al., 2006) e entre diferentes porções do ejaculado e suas interações com o crioprotetor (PEÑA et al., 2003, 2006). A adição de 5 a 10% do plasma seminal como componente do diluidor de congelamento apresenta efeito positivo sobre a qualidade do sêmen após o descongelamento (CABALLERO et al., 2004; HERNÁNDEZ et al., 2007). Esse efeito pode ser atribuído à presença de proteínas no plasma seminal que sejam associadas com o grau de congelabilidade do sêmen, conforme já demonstrado em búfalos (ASADPOUR et al., 2007), eqüinos (FRAZER & BUCCi, 1996), cães (SOUZA et al. 2007) e bovinos (JOBIM et al., 2004). Entretanto, a associação de proteínas à congelabilidade do sêmen suíno não foi estudada. Adicionalmente, associações entre o conteúdo protéico do plasma seminal e a congelabilidade de diferentes porções do ejaculado ainda não são conhecidas. O objetivo deste trabalho foi avaliar o conteúdo protéico de diferentes porções do ejaculado suíno antes destas serem submetidas ao congelamento e a associação entre a presença de proteínas identificadas no plasma seminal e indicadores de qualidade seminal pós-descongelamento, visando à identificação de marcadores bioquímicos em condições de predizer o potencial de congelabilidade de sêmen em diferentes machos e em diferentes frações do ejaculado.
16 Conteúdo protéico do plasma seminal de machos suínos: associação com estimativas de fertilidade com sêmen congelado (Trabalho nas normas da revista Ciência Rural)
17 Conteúdo protéico do plasma seminal de machos suínos: associação com estimativas de fertilidade com sêmen congelado Protein content of boar seminal plasma: association with fertility estimates with frozen semen Carine Dahl Corcini 1 Antonio Sergio Varela Junior 2 João Carlos Deschamps 1 Thomaz Lucia Jr 1 * REVISÃO BIBLIOGRÁFICA RESUMO Em função de apresentar alta sensibilidade ao choque térmico que ocorre durante o processo de criopreservação, o uso de sêmen congelado apresenta índices de desempenho insatisfatórios, o que limita o seu uso na inseminação artificial (IA) como rotina. Outros fatores limitantes seriam a ineficiências dos diluentes e crioprotetores disponíveis no mercado e as diferenças individuais entre machos quanto à congelabilidade de amostras de sêmen. Avanços tecnológicos na área de proteômica vêm permitindo o estudo das proteínas presentes no plasma seminal, no sentido de mapear fatores protéicos que possam ser usados como marcadores bioquímicos para identificar machos com distintos níveis de fertilidade e capacidade de atingir melhores índices de desempenho com IA com sêmen congelado. Esta revisão bibliográfica discute aspectos relacionados ao processo de congelamento do sêmen suíno e possíveis associações entre a composição protéica do plasma seminal e parâmetros de fertilidade e congelabilidade de sêmen. 1 PIGPEL Centro de Biotecnologia Faculdade de Veterinária, Universidade Federal de Pelotas (UFPel) , Pelotas, RS, Brasil. 2 Fundação Universidade Federal do Rio Grande (FURG). * Autor para correspondência E.mail: tomjr2004@yahoo.com.br.
18 Palavras chave: Congelamento, sêmen suíno, proteínas, plasma seminal ABSTRACT Due to its high sensitivity to the cold shock that occurs during cryopreservation, which leads to suboptimal performance, frozen semen is not routinely used in artificial insemination programs in swine commercial farms. Other limiting factors would be the inefficiency in the available extenders and cryoprotectants and individual differences across boars as far as freezability of semen samples. Advances in proteomics allow the study of the protein content of the seminal plasma, to find protein factors that could be biochemical markers able to identify boars having distinct fertility and potentially superior performance with AI with frozen semen. This review discusses the current status of the use of frozen boar semen and possible associations between the protein content of the seminal plasma and parameters of fertility and semen freezability Key words: Freezing, swine semen, proteins, seminal plasma INTRODUÇÃO A inseminação artificial (IA), na espécie suína, vem sendo utilizada de forma crescente, devido aos benefícios econômicos e sanitários e ao melhoramento genético (CORRÊA et al., 2001). No Brasil, estimativas indicam que em torno de 50% das fêmeas alojadas em granjas tecnificadas são submetidas à IA (BORTOLOZZO & WENTZ, 2005). Aproximadamente 99% das IA conduzidas na rotina do sistema de produção utilizam doses inseminantes (DI) à temperatura entre C, que são armazenadas por, no máximo, cinco dias (JOHNSON et al, 2000). O emprego da IA com sêmen congelado ainda é restrito a
19 programas de melhoramento genético, pesquisas científicas ou para a formação de bancos de germoplasma, uma vez que o seu desempenho é inferior ao obtido com sêmen resfriado (HOFMO & GRELVE, 2000; JOHNSON et al., 2000). Essa redução é caracterizada por taxas de parição reduzidas em 20-30% e por um tamanho de leitegada reduzido em 1 a 2 leitões (JOHNSON et al., 2000). A queda no desempenho obtido com sêmen congelado é atribuída ao processo de criopreservação, ocorrendo em função da composição da bicamada lipídica da membrana do espermatozóide suíno, que é diferente da observada em outros mamíferos (WATSON, 1995; BUHR & PETTITT, 1996). Essa composição seria associada a uma maior susceptibilidade às mudanças ultra-estruturais, bioquímicas e funcionais que ocorrem no espermatozóide durante a sua exposição a diversos processos decorrentes da criopreservação, como: choque térmico; estresse osmótico; estresse tóxico pela adição e remoção de crioprotetores; desidratação; e formação de cristais de gelo (MAZUR, 1984; BLACH et al., 1989; WATSON, 2000). Além da estrutura da membrana do espermatozóide, outros fatores também influenciam a qualidade do sêmen criopreservado, tais como: a fração do ejaculado usada na criopreservação; a raça, a nutrição, época do ano e a idade do macho doador do sêmen; e o efeito individual de cada macho (ROCA et al., 2006; PEÑA et al., 2006). Em função desses fatores, os protocolos disponíveis para o congelamento de sêmen suíno ainda não são eficientes para produzir resultados consistentes, como ocorre na espécie bovina (WATSON, 2000). Considerando que o efeito individual do macho seja o fator com maior influência sobre a variação na eficiência do processo de congelamento do sêmen suíno (ROCA et al., 2006), torna-se importante estudar técnicas que identifiquem variações na resposta ao congelamento entre diferentes machos e que permitam desenvolver testes para detectar o seu potencial de congelabilidade. Nesse contexto, a composição protéica do plasma seminal deve ser considerada como um fator importante a influenciar a fertilidade masculina (AUTIERO et
20 al., 1991; STRZEŻEK et al., 2002), uma vez que já foram identificadas associações entre essas proteínas e alguns importantes processos fisiológicos, como a reação acrossômica (SILICIANO et al., 2008). Algumas dessas proteínas poderão se constituir em marcadores bioquímicos que permitam identificar indivíduos com maior ou menor potencial de fertilidade e congelabilidade do sêmen (AUTIERO et al., 1991; STRZEŻEK et al., 2002; JOBIM et al., 2004; ZILLI et al., 2005; ASADPOUR et al., 2007). O objetivo desta revisão bibliográfica é discutir os fatores relacionados com a ineficiência no processo de congelamento de sêmen suíno e as influências potenciais do conteúdo protéico do plasma seminal de diferentes machos sobre a qualidade do sêmen suíno congelado CRIOPRESERVAÇÃO DE SÊMEN SUÍNO O processo de criopreservação busca uma diminuição do metabolismo e a desidratação celular. No entanto, durante esse processo, a célula espermática é exposta ao choque térmico, que é definido como um conjunto de alterações que ocorrem nos espermatozóides quando expostos rapidamente a uma temperatura inferior à fisiológica, durante o processo de estabilização, ou seja, antes do congelamento (GRAHAM, 1996). Como conseqüências do choque térmico ocorrem: perda rápida na motilidade ou presença de movimento circular ou retrógrado; danos no metabolismo da célula espermática; e danos nas membranas plasmáticas e acrossomal. Durante o congelamento do sêmen, é importante que haja a remoção da maior parte da água das células, antes que ocorra o congelamento (BLACH et al., 1989; WATSON, 2000). Do contrário, formam-se grandes cristais de gelo intracelulares, entre as temperaturas de 5º a 10ºC, que podem resultar em vários danos e, freqüentemente, em morte celular. Por outro lado, a desidratação celular extrema também é prejudicial. Esta ocorre quando a solução
21 crioprotetora com hiperosmolaridade não está ajustada adequadamente ou quando o tempo de exposição é muito alto. Segundo DE LEEUW et al. (1993), os crioprotetores devem apresentar hiperosmolaridade para que interajam e estabilizem as membranas celulares, atuando como tampão salino no combate aos efeitos deletérios das altas concentrações de eletrólitos nas células desidratadas. Dessa maneira, a curva de congelamento deve ser lenta a ponto de evitar o congelamento da água intracelular, mas rápida o suficiente para impedir o contato da célula desidratada com o meio hiperosmótico, o que pode levar ao estresse osmótico (MAZUR, 1984), fazendo com que haja redução na motilidade e na produção de energia e perda na capacidade fecundante (HOFMO; ALMLID, 1991; BUHR et al., 1994). O processo de resfriamento é responsável pela mudança na estrutura bidimensional dos lipídios componentes da membrana da célula espermática, estando associado a mudanças na sua fluidez (WATSON, 1995), o que diminui a longevidade dos espermatozóides após o descongelamento (BUHR et al., 1994; HOLT, 2000). A severidade dos efeitos do resfriamento durante o processo de criopreservação depende da sua velocidade e também dos intervalos de temperatura (WATSON, 1981). A sensibilidade do espermatozóide suíno à temperaturas inferiores a 15 C e à mudanças abruptas de temperatura estaria relacionada com a relação colesterol:fosfolipídio de 0,26, que é mais baixa do que a observada em outras espécies (PARKS & GRAHAM, 1992). Também foi constatado que o sêmen deve permanecer por um determinado período de tempo a uma temperatura de equilíbrio (acima de 15 C), supostamente para que ocorra uma diminuição lenta no metabolismo espermático e para que os componentes do meio diluente possam interagir com a célula, antes do estresse do congelamento; com isso, busca-se diminuir os efeitos deletérios do choque térmico e aumentar a viabilidade do sêmen pós-descongelamento (ERIKSSON et al., 2001). Além de todos os fatores citados acima, ainda é necessário considerar o impacto das variações entre diferentes machos, entre raças e entre porções do ejaculado em termos de
22 qualidade seminal após a criopreservação, conforme constatado por PEÑA et al. (2003; 2006), POPWELL e FLOWERS (2004) e ROCA et al. (2006). POPWELL & FLOWERS (2004) identificaram diferenças entre três machos cruzados utilizando sêmen resfriado, em termos de taxa de parição e tamanho da leitegada, porém avaliações in vitro de motilidade progressiva, percentual de morfologia normal e morfologia do acrossoma não demonstraram diferença entre esses machos. Dessa forma, características de qualidade seminal in vitro não são necessariamente associadas com fertilidade in vivo. Além disso, diferentes machos respondem de maneira distinta a diferentes testes de fertilidade, podendo ser considerados mais eficientes quando avaliados por um teste ou menos quando avaliados em outros testes (POPWELL & FLOWERS, 2004). ROCA et al. (2006) descreveram que o efeito individual do macho seria o fator com maior influência sobre a variabilidade na qualidade do sêmen pósdescongelamento, após avaliar 15 machos das raças Pietrain e Landrace, tendo classificado esses machos em três níveis de qualidade de sêmen pós-descongelamento (bom, moderado ou ruim). O congelamento de duas porções diferentes do ejaculado indicou que, em três machos, os 10 ml iniciais da porção rica em espermatozóides apresentou menor motilidade pósdescongelamento quando comparados ao restante da porção rica em espermatozóides (PEÑA et al., 2006). Porém, para um dos machos, o percentual de células com integridade da membrana foi maior para os primeiros 10 ml da porção rica em espermatozóides. Mesmo que a origem dessas diferenças ainda não esteja totalmente esclarecida, existe a hipótese de que elas possam ser conseqüência da composição protéica do plasma seminal ASSOCIAÇÕES ENTRE O CONTEÚDO PROTÉICO DO PLASMA SEMINAL E ESTIMATIVAS DE FERTILIDADE O potencial reprodutivo, em geral, é estimado a partir de parâmetros de qualidade de
23 sêmen após avaliações in vitro. Essas avaliações incluem métodos convencionais, como estimativas de motilidade, vigor e morfologia espermática, ou aspectos ligados à atividade funcional da célula, tais como a capacitação, a reação acrossômica e a capacidade de ligação e penetração no oócito (HAMMERSTEDT et al. 1990; MEDEIROS et al., 2002; MACEDO et al., 2006). Durante muitos anos, o plasma seminal foi considerado apenas como um meio de transporte e sustentação dos espermatozóides, desde a ejaculação até a fertilização (KRAUS et al., 2005; TROEDSSON et al., 2005). Porém, WOLFE et al. (1993), baseando-se nas diferenças apresentadas na qualidade seminal, com o uso de bovinos férteis e com degeneração testicular experimental, sugeriram que os conteúdos do plasma seminal influenciavam na fertilidade masculina. Na verdade, as interações entre os espermatozóides e o plasma seminal iniciam-se desde a espermatogênese, mas é durante a passagem pelo epidídimo que acontece a maturação da célula espermática, ocorrendo extensivas alterações biológicas em sua membrana plasmática devido à interação com o meio (NAABY-HANSEN et al., 1997; TULSIANI et al., 1997; GATTI et al., 2004). Conforme descrito por SYNTIN et al. (1996), durante o transporte epididimário, os espermatozóides adquirem proteínas selecionadas, secretadas por células epiteliais da cabeça e da porção proximal do corpo do epidídimo. Nos suínos, essas regiões seriam responsáveis pela secreção de 70 a 80% de todas as proteínas secretadas no epidídimo. Porém, as glândulas vesiculares dos suínos são responsáveis pela secreção de 80 a 90 % das proteínas contidas no plasma seminal, enquanto que o restante seria proveniente da próstata e do epidídimo (STRZEŻEK, 2002). Em um estudo utilizando suínos-miniatura, observou-se que o plasma seminal contém fatores que modificam a célula espermática antes do congelamento e reduzem a capacidade de penetração no oócito após o descongelamento (KAWANO et al., 2004). Na avaliação das proteínas presentes no plasma seminal (PSP) pela técnica de eletroforese unidimensional, as proteínas são separadas pelo seu ponto isoelétrico, enquanto
24 que, na avaliação pela técnica de eletroforese bidimensional, as proteínas são separadas pela sua massa molecular. Portanto, a técnica bidimensional possui a vantagem de separar proteínas em maior quantidade e com uma alta resolução, facilitando a identificação de potenciais marcadores ligados à fertilidade e congelabilidade de sêmen em machos de diferentes espécies, como bovinos (WOLFE et al., 1993; RONCOLETA et al., 1999; JOBIM et al., 2004), humanos (AUTIERO et al., 1991), eqüinos (FRAZER & BUCCI, 1996; BRANDON et al., 1999) e suínos (STRZEŻEK et al., 2002). Após avaliarem a composição protéica do plasma seminal de bovinos da raça holandesa de fertilidade conhecida, KILLIAN et al. (1993) sugeriram que duas PSP, uma com 26 kda (pi 6,2) e outra com 55 kda (pi 4,5), seriam freqüentes em touros com alta fertilidade, enquanto duas PSPs com peso molecular de 16 kda (pi 4,1 e 6,7) seriam freqüentes em touros de baixa fertilidade. Estudos subseqüentes identificaram a osteopontina como a PSP com 55 kda (pi 4,5) (CANCEL et al., 1997) e a prostaglandina D sintetase tipo-lipocalina como a PSP com 26 kda (GENERA et al., 1998). Em eqüinos, a presença de PSPs com peso molecular aparente de 19,6 e 15,3 kda estaria ligada a aumento da motilidade progressiva do sêmen, tanto in natura, quanto após incubação pós-congelamento (FRAZER & BUCCI, 1996). Também em eqüinos, a proteína SP-1 (72 kda, pi 5.6) seria positivamente associada com a fertilidade, enquanto as proteínas SP-2 (75 kda, pi 6.0), SP-3 (18 kda, pi 4.3) e SP-4 (16 kda, pi 6.5) seriam negativamente associadas com a fertilidade (BRANDON et al., 1999). Em cães, SOUZA et al. (2007) verificaram a presença de 37 bandas no plasma seminal, com os pesos moleculares entre 100,6 a 3,6 kda, com 13 bandas repetidas em todos os 20 animais do experimento. Esses autores descreveram uma associação positiva entre a densidade óptica integrada das bandas com 67 e 58,6 kda e parâmetros relacionados com fertilidade in vitro. No que diz respeito à congelabilidade do sêmen, o perfil eletroforético unidimensional das proteínas do plasma seminal de touros da raça Gir identificou uma associação entre a
25 presença de uma PSP com peso molecular aproximado de Da e alta congelabilidade do sêmen (RONCOLETA et al., 1999). Em um estudo com eletroforese bidimensional do conteúdo protéico do plasma seminal de touros Bos taurus taurus e Bos taurus indicus, JOBIM et al. (2004) sugerem que as proteínas 3 (15 16 kda, pi 4,7 5,2), 7 (11 12 kda, pi 4,8 4,9), 11 (13 14 kda, pi 6,0 6,5) e 23 (18 20 kda, pi 4,8 5,2) poderiam ser marcadoras para alta congelabilidade, enquanto a proteína 25 (25 26 kda, pi 6,0 6,5) seria uma marcadora para baixa congelabilidade. Em búfalos, ASADPOUR et al. (2007) descreveram variação semelhante no conteúdo protéico do plasma seminal, relatando que uma proteína com peso molecular de 24,5 kda seria relacionada com maior motilidade progressiva, que uma proteína com 45 kda seria associada com morfologia espermática anormal após o descongelamento e que uma proteína com 55 kda seria associada com a viabilidade do sêmen in natura. Na espécie suína, uma proteína associada ao choque térmico aumenta em freqüência no plasma seminal durante o inverno, em comparação com o verão, o que conferiria ao ejaculado maior capacidade de suportar o processo de resfriamento ou de congelamento (HUANG et al., 2000). MURASE et al. (2007) confirmaram que existe uma variação na qualidade seminal de suínos da raça Large White, pois, no verão, características como motilidade, morfologia espermática normal e integridade do acrossoma seriam reduzidas, o que seria influenciado pela redução no conteúdo total de proteínas no plasma seminal, em comparação com o inverno, ainda que, nesse estudo, as proteínas não tenham sido identificadas. Variação estacional foi também observada em elefantes, havendo redução tanto na viabilidade espermática, quanto no conteúdo total de PSPs durante o verão (THONGTIP et al., 2008). Existem evidências de que, na espécie ovina, a incubação no plasma seminal de amostras de sêmen anteriormente submetidas a choque térmico poderia levar à reversão de
26 danos causados pelo choque térmico na membrana plasmática dos espermatozóides (BARRIOS et al., 2000). Dessa forma, as PSPs seriam absorvidas pela membrana, modificando as características funcionais e estruturais da célula lesada. CABALLERO et al. (2004) relataram que espermatozóides suínos, quando colocados em meio contendo plasma seminal de outros machos suínos, mantêm sua viabilidade por mais tempo ou mesmo a aumentam, sugerindo que um conteúdo de 10% de plasma seminal de outro macho suíno seja adicionado à porção do ejaculado rica em espermatozóides. Esses achados foram confirmados por HERNÁNDEZ et al. (2007), que utilizaram alíquotas de 5% de plasma seminal de diferentes machos com congelabilidade classificada como: baixa (viabilidade pósdescongelamento < 40%); moderada (40 a 60 %); e alta (> 60%). No estudo, concluiu-se que a adição de plasma seminal proveniente de machos com congelabilidade alta ou baixa foi capaz de melhorar a viabilidade pós-descongelamento de amostras de sêmen de outros machos, mesmo naqueles indivíduos previamente classificados como tendo alta viabilidade espermática pós-descongelamento. As proteínas presentes no plasma seminal de suínos (PSP I e PSP II) seriam secretadas não somente nas glândulas vesiculares ou na próstata, como também no epidídimo de machos adultos (MAŇÁSKOVÁ & JONÁKOVA, 2007). A adição das PSP I e PSP II a um meio de fertilização in vitro foi associada a efeitos negativos sobre as taxas de penetração oocitária in vitro e sobre o número de espermatozóides penetrando por oócito (CABALLERO et al., 2005). No entanto, ainda não se sabe se o efeito inibitório dessas proteínas é diretamente associado aos espermatozóides ou à obstrução de receptores na zona pelúcida do oócito. Duas PSPs, com 26 kda (pi 6,2) e 55 kda (pi 4,5), foram descritas como potenciais marcadores para fertilidade em suínos, pois sua presença estaria associada com maiores taxas de parição e tamanho total da leitegada (FLOWERS, 2001). Dados recentes identificaram um fator com peso molecular de 26 kda relacionado com menor integridade de membrana plasmática de
27 espermatozóides suínos após o descongelamento (BIANCHI et al., 2008). Após verificação em um banco de dados in silico (BioThesaurus), constatou-se que essa proteína pertence ao grupo das Sialoproteínas. Ao estudarem machos com diferentes graus de congelabilidade de sêmen, HERNÁNDEZ et al. (2007) descrevem que os machos com alta congelabilidade apresentavam plasma seminal com menor quantidade das proteínas PSP-I e AWN2. Ainda, a congelabilidade do sêmen também pode estar associada à presença da proteína PSP-II em baixas concentrações (1,5 mg/ml), que seria associada com preservação da motilidade, integridade de membrana plasmática e ação da mitocôndria (CENTURIÓN et al., 2003). Essas proteínas foram classificadas como Espermadesinas, representando aproximadamente 50% do conteúdo protéico do plasma seminal e desempenhando funções relacionadas com a capacitação espermática, auxiliando a interação entre espermatozóide e oócito (SANZ et al. 1992; CALVETE et al. 1993; EKHLASI-HUNDRIESER et al. 2005; CABALLERO et al. 2006). A PSP-II é importante para o processo de fertilização, pois previne a ocorrência prematura da reação acrossômica e de modificações na membrana espermática, além de facilitar a ligação com o oócito (CABALLERO et al. 2006). Estudos mais detalhados sobre a função das PSPs ainda são necessários, para elucidar não apenas as implicações dos efeitos individuais, como também a influência de outros fatores, como estação do ano, nutrição e idade. A identificação de potenciais marcadores relacionados a parâmetros de fertilidade seria importante na seleção de reprodutores para programas de inseminação artificial com sêmen congelado CONCLUSÕES A utilização do sêmen suíno congelado em nível comercial ainda não é viável em função dos índices de desempenho insatisfatórios, geralmente atribuídos ao choque térmico que ocorre durante o processo de criopreservação. No entanto, os avanços na pesquisa do
28 conteúdo protéico do plasma seminal já possibilitaram a identificação de alguns fatores que podem ser futuros marcadores para fertilidade e congelabilidade do sêmen, no sentido de desenvolver protocolos eficientes para o congelamento de sêmen suíno AGRADECIMENTO (S) Agradecimentos à Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES), pela bolsa de mestrado do primeiro autor REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ASADPOUR, R. et al. SDS-polyacrylamide gel electrophoresis of buffalo bulls seminal plasma proteins and their relation with semen freezability. Animal Reproduction Science, suppl. v.102, p , AUTIERO, M. et al. Relative ratios of lactoferrin, albumin, and acid phosphatase seminal levels as sperm quality markers in fertile and infertile men. Journal of Andrology v. 12, p , BARRIOS, B. et al. Seminal plasmaproteins revert the cold-shock damage on ram sperm membrana. Biology of Reproduction v. 63, p , BIANCHI, I. et al Fator do plasma seminal associado à integridade de membrana de espermatozóides suínos pós-descongelamento. Arquivo Brasileiro de Veterinária e Zootecnia. Aceito para publicação BioThesaurus. PROTEIN INFORMATION RESOURCE, Georgetown University Medical Center, USA. Disponível em: Acesso em 28 de março de 2008, Brasil. BLACH, E.L. et al. Change in quality of stallion spermatozoa during cryopreservation: plasma membrane integrity and motion characteristics. Theriogenology v. 31, p , 1989.
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34 Perfil protéico do plasma seminal de suínos e sua associação com a qualidade do sêmen congelado (Trabalho nas normas da revista Animal Reproduction Science) 34
35 35 Perfil protéico do plasma seminal de suínos e sua associação com a qualidade do sêmen congelado C.D. CORCINI 1, R. PIGOZZO 1, A.S. VARELA JUNIOR 2, G. RAMBO 1, E.F. MASCHIO 1 ; P.M.M., LEON 1 ; E.C.S. SANTOS 1 ; F.J.K. REMPEL 1, K.L GOULARTE 1, K. CALDERAM 1, V. F. CAMPOS 1, D.C. BONGALHARDO 1, J.C. DESCHAMPS 1, T. LUCIA, Jr 1, 3 1 Laboratório de Biotécnicas da Reprodução, Centro de biotecnologia, Faculdade de Veterinária. 2 Departamento de Ciências Morfo-biológicas - FURG Campus Universitário s/n Caixa Postal 354 CEP Universidade Federal de Pelotas, Pelotas/RS. 3 Correspondência autor. thomaz@ufpel.edu.br Resumo A inseminação artificial (IA) em suínos com sêmen congelado apresenta índices de desempenho reprodutivo insatisfatórios, em comparação com a IA com sêmen resfriado. Entre outros fatores, esta ineficiência pode ser atribuída aos diluentes e variação entre os machos doadores de sêmen, que podem apresentar diferente conteúdo de proteínas no plasma seminal. O objetivo deste trabalho foi avaliar o conteúdo protéico de diferentes porções do ejaculado de suínos, antes destas serem submetidas ao congelamento, e a associação entre a presença de proteínas identificadas no plasma seminal e indicadores de qualidade seminal pósdescongelamento, visando a identificação de marcadores bioquímicos associados com a congelabilidade do sêmen de diferentes machos e frações do ejaculado. A porção do ejaculado rica em espermatozóides foi fracionado em duas amostras, as quais foram congeladas em diluente contendo 5% de dimetilacetamida como crioprotetor interno. O conteúdo protéico do plasma seminal foi avaliado por eletroforese unidimensional e associado com motilidade e integridade da membrana espermática pré e pós-congelamento, e morfologia espermática e integridade de acrossoma pós-congelamento. Foram conduzidas análises inter-machos, nas quais o efeito individual foi ajustado, e intra-machos, nas quais as análises foram estratificadas para cada macho. A primeira porção do ejaculado, consistindo dos primeiros 10 ml coletados, apresentou melhores indicadores de qualidade seminal pós-descongelamento, em comparação com a segunda porção do ejaculado. Nove proteínas presentes no plasma seminal apresentaram associação significativa com parâmetros de qualidade do sêmen congelado, tanto na análise inter-machos, como na intra-machos (P < 0,05). Dentre estas nove proteínas, duas dela, que possuem peso molecular de 28 e 100 kda foram associadas, respectivamente, com a motilidade pós-descongelamento e com a integridade da membrana espermática pré-congelamento e pós-descongelamento, sendo, portanto, potenciais candidatas a marcadores bioquímicos para qualidade de sêmen de suínos. Palavras-chaves: Congelamento, proteínas, plasma seminal, suínos
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