HIV test Pág. 1 de 5
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- Vergílio Correia Corte-Real
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1 HIV test ELISA Ensaio imunoenzimático (ELISA) para a determinação de anticorpos contra os vírus da imunodeficiência humana HIV-1 (grupos M e O) e HIV-2 SIGNIFICADO CLÍNICO Os vírus da imunodeficiência humana (HIV-1 e HIV-2) causadores da AIDS, são transmitidos principalmente por contato sexual ou através de sangue ou produtos derivados do sangue contaminados. Em indivíduos infectados com estes vírus, aparecem anticorpos como resposta do sistema imunológico à invasão viral. Estes anticorpos não são protetores e não conferem imunidade, mas constituem atualmente a base do estudo da patologia. O presente kit foi desenvolvido para detectar conjuntamente a presença dos anticorpos anti-hiv-1 (do HIV, grupos M e O) e anti-hiv-2. A seqüênciação dos vírus HIV-1 e HIV-2 demonstrou que possuem cerca de 60% de homologia nos genes pol e gag, que descende em torno de 30-40% nos demais genes e na região LTR. O presente método emprega antígenos sintéticos com seqüências correspondentes a regiões antigênicas codificadas por estes genes, que, adicionalmente cumprem com a condição de gerar anticorpos de aparição inicial na soroconversão. Esta condição e sua grande imunoreatividade outorgam uma maior sensibilidade à determinação. FUNDAMENTOS DO MÉTODO A amostra é diluída no suporte no qual se encontra o antígeno imobilizado. Se a mesma contiver os anticorpos específicos, estes formarão um complexo com os antígenos e permanecerão unidos ao suporte. A fração não unida é eliminada por lavagem após da qual agregam-se anticorpos anti-imunoglobulina humana conjugados com peroxidase. Se ocorrer a reação na primeira etapa do processo, o conjugado se unirá. Após uma nova lavagem, agrega-se o substrato enzimático. Nos casos onde o conjugado tiver se unido, haverá surgimento de coloração celeste. A reação se detém com ácido sulfúrico, com o que a coloração celeste torna-se amarela. REAGENTES FORNECIDOS Microplaca sensibilizada: microplaca de tiras removíveis com cubetas que contém antígenos sintéticos de HIV-1 e HIV-2 imobilizados. Conjugado: anti-imunoglobulinas humanas (cabra) conjugadas com peroxidase. Revelador A: peróxido de hidrogênio 60 mmol/l em tampão citrato 50 mmol/l ph 3,2. Revelador B: tetrametilbenzidina (TMB) 0,01 mmol/l em ácido clorídrico 0,1 N. Stopper: ácido sulfúrico 2 N Tampão de Lavagem concentrado: cloreto de sódio 1,4 mol/l em tampão fosfato 100 mmol/l e tensioativo não iônico 0,1 g/l. Diluente de Amostras: albumina bovina em solução fisiológica tamponada com tampão fosfato ph 7,2. Controle Positivo: diluição de soro inativo, contendo anticorpos contra HIV-1 e HIV-2. Controle Negativo: diluição de soro não-reativo, inativo. INSTRUÇÕES PARA USO Tampão de Lavagem: para usar, diluir 1+4 com água destilada (1 parte de Tampão de Lavagem concentrado + 4 partes de água destilada). A baixa temperatura os componentes do reagente podem precipitar. Neste caso, colocar em banhomaria 37 o C por alguns minutos, misturando a seguir por inversão. Microplaca sensibilizada: pronta para uso. Conjugado: pronto para uso. Revelador A: pronto para uso. Revelador B: pronto para uso. Stopper: pronto para uso. Diluente de Amostras: pronto para uso. A cor do Diluente de Amostras pode variar de lote a lote sem que seja afetada sua capacidade reacional. Controle Positivo e Controle Negativo: prontos para uso. PRECAUÇÕES - Todas as amostras de pacientes devem ser manipuladas como se fossem capazes de transmitir a infecção. Os controles encontram-se inativos, porém devem ser empregados como se tratando de material infectado. - Os soros controles foram examinados para HBsAg, encontrando-se não-reativos. - A microplaca encontra-se recoberta com antígenos sintéticos de HIV-1 e HIV-2. Qualquer possibilidade de contaminação com a mesma pode ser descartada com absoluta certeza. - Todos os materiais utilizados no ensaio devem ser destruídos a fim de assegurar a inativação de agentes patogênicos. O método recomendado para este procedimento é autoclavar durante 1 hora a 121 o C. Os líquidos descartados podem ser desinfetados com hipoclorito de sódio, (concentração final de 5%) durante pelo menos 60 minutos. - Não intercambiar reagentes de kits e lotes diferentes. - Não utilizar reagentes de outra origem. - As microplacas devem ser incubadas em estufa. Não usar banho-maria. Evitar abrir a estufa durante a incubação. - Evitar que vapores de hipoclorito provenientes dos recipientes de descarte biológicos ou outras formas entrem em contato com a microplaca, pois o hipoclorito afeta a reação. - Os reagentes são para uso in vitro. - Evitar o contato do ácido sulfúrico com a pele e mucosas. - Evitar o derrame de líquidos e a formação de aerosóis Pág. 1 de 5
2 ESTABILIDADE E INSTRUÇÕES DE ARMAZENAMENTO Os Reagentes Fornecidos são estáveis sob refrigeração (2-10 o C) até a data de vencimento indicada na embalagem. Não congelar. Tampão de Lavagem: estável 3 mêses a temperatura ambiente. Microplaca sensibilizada: as tiras de cubetas com antígenos imobilizados são fornecidos em embalagem fechada à vácuo e com dessecante. Não abrir a embalagem até o momento de uso, e esperar atingir a temperatura ambiente, pois ao contrário se favorecerá a humectação do conteúdo. As tiras de cubetas não utilizadas devem ser conservadas dentro do envelope com o dessecante, e perfeitamente fechado com uma fita adesiva e mantida entre 2-10 o C. As tiras conservadas nestas condições, são estáveis por 3 meses, desde que não ultrapasse o vencimento do kit. AMOSTRA Soro ou plasma a) Coleta: obter soro da maneira usual. Não devem ser usadas amostras inativadas pelo calor. Vide LIMITAÇÕES DO PROCEDIMENTO. b) Aditivos: não são necessários para soro. Ao empregar plasma poderá ser utilizado qualquer anticoagulante de uso corrente na prática transfusional. c) Substâncias interferentes conhecidas: a hemólise, hiperlipemia e outras causas de turbidez podem ser causa de resultados errôneos. Estas amostras devem ser clarificadas por centrifugação. d) Estabilidade e instruções de armazenamento: as amostras não diluídas podem ser conservadas durante 7 dias entre 2-10 o C. Para conservação por períodos mais prolongados devem ser congelados a -20 o C ou temperaturas menores. Evitar os congelamentos e descongelamentos reiterados. Existem evidências que mostram que os congelamentos sucessivos podem ser causa de resultados errôneos. Se as amostras precisam ser transportadas, embalar de acordo com as especificações legais relativas ao envio de materiais infecciosos. MATERIAL NECESSÁRIO (não fornecido) - Micropipetas para medir os volumes indicados. - Relógio alarme ou cronômetro. - Estufa a 37 o C. - Espectrofotômetro para leitura de microplacas. - Lavadora de microplacas. CONDIÇÕES DE REAÇÃO - Longitude de onda primária: 450 nm - Longitude de onda secundária (bicromática): 620 nm - Calibração do instrumento: zerar o espectrofotômetro com Branco de Reagente, processando da mesma forma que uma determinação, mas omitindo colocar a amostra. - Tempo de reação: variável, conforme a técnica selecionada. - Temperatura de reação: 37 ± 2 o C e temperatura ambiente (18-25 o C). - Volume de amostra: 10 ul PROCEDIMENTO I- TÉCNICA COM REVELADORES SEPARADOS Levar os reagentes e amostras a temperatura ambiente antes de iniciar a prova. Uma vez iniciada a análise deve ser completada sem interrupção. Processar simultaneamente 2 Controles Positivos (CP), 3 Negativos (CN) e os Desconhecidos (D). Ao dispensar as amostras e/ou Controles sobre o Diluente de Amostras, deve assegurar-se de colocar os mesmos no centro do líquido e não sobre as paredes ou o fundo da cubeta. Enxaguar a pipeta com o Diluente dispensado na cubeta, para assegurar a correta homogeneização. Nas cubetas a utilizar da microplaca colocar: D CP CN Diluente de Amostras 200 ul 200 ul 200 ul Controle Positivo - 10 ul - Controle Negativo ul Amostra 10 ul - - durante 10 segundos após pipetadas as amostras em cada tira. No procedimento manual, para evitar a evaporação, cobrir a placa e incubar em estufa 30 ± 2 minutos a 37 ± 2 o C. Após, aspirar cuidadosamente o líquido de cada cubeta desprezando-o em um recipiente para dejetos biológicos que contenha hipoclorito de sódio a 5%. Na continuação, lavar 5 vezes com Tampão de Lavagem (preparado conforme as instruções de uso da pág. 1) empregando aproximadamente 300 ul/vez/cubeta. Após cada lavagem o líquido deve ser descartado no recipiente com hipoclorito. Empregar lavador automático. Ao finalizar a última lavagem, eliminar completamente o líquido residual, invertendo a microplaca e batendo-a várias vezes sobre papel absorvente, exercendo uma leve pressão com a mão nas laterais maiores do suporte, para evitar a caída das tiras de cubetas. Após adicionar em cada cubeta: Conjugado 50 ul 50 ul 50 ul durante 10 segundos. No procedimento manual, para evitar a evaporação, cobrir a placa e incubar durante 30 ± 2 minutos em estufa a 37 ± 2 o C. Após, aspirar o líquido das cubetas, desprezando-o no recipiente com hipoclorito e lavar conforme se indicou anteriormente. Ao finalizar a última lavagem, eliminar completamente o líquido residual, invertendo a microplaca e batendo-a várias vezes sobre papel absorvente, exercendo uma leve pressão com a mão sobre as laterais maiores do suporte, para evitar a caída das tiras de cubetas. Após adicionar em cada cubeta respeitando a ordem dos reagentes: Revelador A 50 ul 50 ul 50 ul Pág. 2 de 5
3 Revelador B 50 ul 50 ul 50 ul Pode-se colocar 1 gota de cada Revelador, utilizando o frasco gotejador fornecido. durante 10 segundos. Incubar 30 ± 2 minutos a temperatura ambiente (18-25 o C), após adicionar: Stopper 50 ul 50 ul 50 ul durante 10 segundos. Ler em espectrofotômetro a 450 nm ou efetuar leitura bicromática a 450/620 nm. II- TÉCNICA COM REVELADORES PRÉ-MISTURADOS Levar os reagentes e amostras a temperatura ambiente antes de iniciar a prova. Uma vez iniciada a análise deve ser completada sem interrupção. Processar simultaneamente 2 Controles Positivos (CP), 3 Negativos (CN) e os Desconhecidos (D). Ao dispensar as amostras e/ou Controles sobre o Diluente de Amostras, deve assegurar-se de colocar os mesmos no centro do líquido e não sobre as paredes ou o fundo da cubeta. Enxaguar a pipeta com o Diluente dispensado na cubeta, para assegurar a correta homogeneização. Nas cubetas a utilizar da microplaca colocar: D CP CN Diluente de Amostras 200 ul 200 ul 200 ul Controle Positivo - 10 ul - Controle Negativo ul Amostra 10 ul - - durante 10 segundos após pipetadas as amostras em cada tira. No procedimento manual, para evitar a evaporação, cobrir a placa e incubar em estufa minutos a 37 ± 2 o C. Após, aspirar cuidadosamente o líquido de cada cubeta desprezando-o em um recipiente para dejetos biológicos que contenha hipoclorito de sódio a 5%. Na continuação, lavar 5 vezes com Tampão de Lavagem (preparado conforme instruções de uso da pág. 1) empregando aproximadamente 300 ul/vez/cubeta. Após cada lavagem o líquido deve ser descartado no recipiente com hipoclorito. Empregar lavador automático. Ao finalizar a última lavagem, eliminar completamente o líquido residual, invertendo a microplaca e batendo-a várias vezes sobre papel absorvente, exercendo uma leve pressão com a mão sobre as laterais maiores do suporte, para evitar a caída das tiras de cubetas. Após adicionar em cada cubeta: Conjugado 50 ul 50 ul 50 ul durante 10 segundos. No procedimento manual, para evitar a evaporação, cobrir a placa e incubar durante minutos em estufa a 37 ± 2 o C. Após, aspirar o líquido das cubetas, desprezando-o no recipiente com hipoclorito e lavar conforme se indicou anteriormente. Ao finalizar a última lavagem, eliminar completamente o líquido residual, invertendo a microplaca e batendo-a várias vezes sobre papel absorvente, exercendo uma leve pressão com a mão sobre as laterais maiores do suporte, para evitar a caída das tiras de cubetas. Após adicionar uma mistura de partes iguais de Revelador A + Revelador B (estável 24 horas): Reveladores misturados 100 ul 100 ul 100 ul durante 10 segundos. Incubar minutos a temperatura ambiente (18-25 o C), após adicionar: Stopper 50 ul 50 ul 50 ul durante 10 segundos. Ler em espectrofotômetro a 450 nm ou efetuar leitura bicromática a 450/620 nm. ESTABILIDADE DA MISTURA DE REAÇÃO FINAL A cor da reação é estável durante 30 minutos, ler os resultados durante esse intervalo. CRITÉRIOS DE VALIDAÇÃO DA CORRIDA A corrida é considerada válida se cumpridas simultaneamente as seguintes condições: a) As leituras de pelo menos 2 dos 3 Controles Negativos corrigidas contra o Branco de Reagente devem ser menores ou iguais a 0,150 D.O. b) A leitura média dos Controles Positivos corrigida deve ser maior ou igual a 0,600 D.O. Se uma ou ambas as condições não se cumprirem, repetir a corrida. Para ambos os casos lembrar que as leituras obtidas dependerão da sensibilidade do aparelho empregado. INTERPRETAÇÃO DOS RESULTADOS A presença ou ausência de anticorpos anti-hiv se determina relacionando a absorbância da amostra com o valor Cut-off. Cut-off = CN + 0,150 D.O. onde CN é a média das leituras do Controle Negativo. Zona de indeterminação: Cut-off ± 10% Amostras Não Reativas: consideram-se aquelas com absorbâncias menores que o limite inferior da zona de indeterminação. Amostras Reativas: consideram-se aquelas com absorbâncias maiores que o limite superior da zona de indeterminação. Estas amostras devem ser analisadas novamente por duplicata com o mesmo método antes de sua interpretação definitiva. Se uma ou ambas duplicatas resultam reativas, devese realizar uma prova confirmatória como o Western Blot Pág. 3 de 5
4 Leitura < que o limite inferior da zona de indeterminação Não reativa Esquema de interpretação Amostra Original Leitura > que o limite superior da zona de indeterminação Inicialmente reativa (repetir sobre a amostra original por duplicata) Ambas leituras < 1 ou ambas leituras > que o limite inferior que o limite superior da zona de da zona de indeterminação indeterminação Não reativa Reativa Ensaiar usando método de referência (Western Blot) e diferenciar HIV-1 e HIV-2 LIMITAÇÕES DO PROCEDIMENTO Vide Substâncias interferentes conhecidas em AMOSTRA. - Constituem causas de resultados errôneos: Lavagem incorreta das cubetas de reação. Contaminação cruzada de amostras Não Reativas com anticorpos procedentes de uma amostra Reativa. Contaminação da solução cromogênica com agentes oxidantes (cloro, etc.). Contaminação do Stopper. Conservação inadequada das tiras de cubetas não utilizadas. Contaminação do Tampão de Lavagem diluído: recomendase conferir a limpeza dos frascos onde é preparado e armazenado. Se for observada turbidez ou precipitação na preparação, despreza-lo. - Deve-se recordar que a presença de anticorpos anti-hiv no soro NÃO é diagnóstico de AIDS. Os resultados repetidamente reativos devem conferir-se por métodos de referência como Western Blot. - Um resultado negativo não exclui a possibilidade de exposição ou infecção pelo HIV-1 ou HIV-2. Não utilizar banhomaria para a incubação. - Podem-se obter resultados falsos positivos nas seguintes situações: doenças autoimunes, tuberculose, lúpus eritematoso sistêmico, gravidez, vacinação contra a hepatite B e outras imunizações, hemodiálise, doença hepática e outras doenças. - Ocasionalmente, ao realizar leituras bicromáticas, podem obter-se absorbâncias negativas que não interferem a determinação, devido que algumas amostras resultam com leituras por baixo do Branco de Reagente. - Não utilizar banho-maria para a incubação. - Não utilizar amostras inativadas pelo calor já que podem obter-se resultados falsos positivos. - Certifique-se que o sistema de lavagem automático que está utilizando aspire totalmente o conteúdo e que o volume da solução lavadora fique em níveis iguais. PERFORMANCE a) Sensibilidade: em un estudo realizado com diferentes paneis comerciais internacionais, obtiveram-se os seguintes resultados: - Anti-HIV-1/2 Combo Performance Panel (PRZ 203), Boston Biomedica, Inc.: detectaram-se 14 das 14 amostras positivas. - Anti-HIV-1 Mixed Titer Performance Panel (PRB 203), Boston Biomedica, Inc.: detectaram-se 22 das 23 amostras positivas. - Anti-HIV-1 Low Titer Performance Panel (PRB 106), Boston Biomedica, Inc.: detectaram-se 13 das 14 amostras positivas. Em outro estudo realizado sobre 48 amostras com sorologia positiva segundo outros métodos ELISA utilizados como referência, foram detectadas as 48 amostras. - Amostras HIV-1 grupo O, B e JP da Boston Biomedica Inc.: detectaram-se as duas. b) Especificidade: em um estudo realizado sobre 212 amostras de soros e plasmas provenintes de bancos de sangue e consultórios externos, a especificidade estimou-se em 99,5%. Em outro estudo realizado sobre 311 amostras provenintes de pessoas hospitalizadas e ambulatórias, encontrou-se uma especificidade de 99,3%. Em uma população de 94 plasmas provenintes do laboratório de um hospital, encontrou-se uma especificidade de 100%. PARÂMETROS PARA ANALISADORES AUTOMÁTICOS Vide as adaptações específicas para cada tipo de analisador, que deverão ser solicitadas ao setor Marketing da Wiener lab. APRESENTAÇÃO Kit para 96 determinações (Cód ). REFERÊNCIA - Gallo, R.C. y cols. Science 224:500 (1984). - Centers for Disease Control - Morbidity and Mortality Weekly Report 36/31 (1987). - Lossa, G.R. - Acta Bioq. Clín. Latinoam. XXI/1:47-65 (1987). - Fernández, E.; Taborda, M.; Lorenzo, L.; Rojkín, F.; Fernández, A.; Fay, A. - Proceedings of the VIII International Conference on AIDS/III STD World Congress, pág Amsterdam (1992). - Rojkín, F.; Takeda, A.K.; Gariglio, R.C.; Lorenzo, L. - Proceedings of the VIII International Conference on AIDS/III STD World Congress - Pag Amsterdam (1992). - Rojkín, F.; Takeda, A.; Gariglio, R.; Lorenzo, L. - Proceedings of the 5 th National Forum on AIDS, Hepatitis and other Blood Borne Diseases, pág. 90 (Atlanta, Georgia - USA), (1992). - Montagnier, L. - Ann. Inst. Pasteur/Virol., 138:3-11 (1987) Pág. 4 de 5
5 - NotiWiener Nº 76, pág. 1, abril Clae, F y cols, - Science 233:334 (1986). -Schujman, L.; Suita, G.; Albrecht, A. - Acta Bioq. Clín. Latinoam. XXIX/4:513, Rojkín, L.F. - Libro de resúmenes del VII Congreso Argentino de Farmacia y Bioquímica, Buenos Aires, pág. 28, Clin. Latinoam. XXIX/4:513m Importador exclusivo Labinbraz Comercial Ltda. C.G.C / Av. Pedroso de Morais, 613, 3º andar CEP São Paulo - SP - Brasil Resp. Técnico: Dra. Augusta Takeda CRF/SP nº 3891 SETOR DE APOIO AO CLIENTE ASSESSORIA TÉCNICA EM PRODUTOS E MÉTODOS: Fone: (011) Fax: (011) Wiener lab Rosario - Argentina Pág. 5 de
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