Protocolos de metodologias Laboratoriais Clássicas para o diagnóstico de hemoglobinopatias

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1 UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA Câmpus de São José do Rio Preto Instituto de Biociências, Letras e Ciências Exatas CEP R. CRISTÓVÃO COLOMBO, J. NAZARETH PABX (017) FAX (017) TELEX (011) SÃO JOSÉ DO RIO PRETO - SP. Protocolos de metodologias Laboratoriais Clássicas para o diagnóstico de hemoglobinopatias Julho 2003

2 Detalhamento Técnico -1- Deixo registrado nesta página meu imenso agradecimento a todos os meus alunos que participaram em algum momento da padronização e ajuste destas metodologias, e ao Prof Naoum, responsável pela minha paixão pelas Hemoglobinas.

3 Detalhamento Técnico -2- Índice Preparação de Hemolisados...03 Hemolisado Rápido...03 Solução de hemoglobina com clorofórmio...03 Solução de hemoglobina com KCN 0,05%...04 Testes Seletivos...04 Resistência globular osmótica...04 Análise à fresco da morfologia eritrocitária...05 Eletroforese em ph alcalino...06 Densitometria...08 Transparentização...08 Técnicas Específicas...09 Eletroforese em acetato de celulose ph neutro...09 Dosagem de Hb H...10 Pesquisa de corpúsculos de Heinz e agregados de Hb H...10 Eletroforese quantitativa em acetato de celulose Dosagem de Hb A Eletroforese de diferenciação em Agar-fosfato ph 6, Dosagem de hemoglobina fetal...13 Testes de precipitação de Hb instáveis - Desnaturação pelo Calor...14 Precipitação por Isopropanol...15 Coloração intra-eritrocitária de Hb Fetal...16 Dosagem e Curva espectrofotométrica de Metahemoglobina...17 Dosagem de Metahemoglobina...17 Curva de Metahemoglobina...18 Eletroforese de cadeias polipeptídicas...19 ph alcalino...19 ph ácido...20 Focalização isoelétrica...22 HPLC...25 Referências Bibliográficas...27

4 Detalhamento Técnico -3- Devido à expectativa de que muitos serviços poderão se utilizar desses métodos para realizarem com segurança o diagnóstico laboratorial das hemoglobinopatias, estão relacionados aqui aqueles que foram caracterizados pela sua eficiência técnica em nosso laboratório ao longo destes anos, no estudo de hemoglobinas anormais. PREPARAÇÃO DE HEMOLISADOS: Para que as amostras fossem submetidas a procedimentos eletroforéticos e testes bioquímicos para caracterizar as hemoglobinopatias, é necessário lisar as células para a obtenção da solução de hemoglobinas, que pode ser: Hemolisado Rápido - com saponina, (Naoum, 1998) Solução de Hemoglobina - com clorofórmio, (Naoum, 1998) Solução de Hemoglobina - com KCN 0,05%, (Moreira et al., 1999) Hemolisado Rápido: com saponina Esse procedimento técnico é recomendável para estudo populacional, nas suspeitas de hemoglobinas instáveis e talassemias do tipo alfa. Não é aconselhável utilizá-lo para dosagens bioquímicas de hemoglobinas, especialmente de Hb Fetal. Reativo hemolisante: Saponina P.A. Água destilada 1 g 100 ml - Em placa de Kline colocar 1 volume de sangue com 1 volume de reativo hemolisante; - A homogeneização deve se processar até a hemólise completa da mistura; - Utilizar o hemolisado após 5 minutos, e no máximo 24 horas depois da sua preparação. Solução de Hemoglobina: com Clorofórmio A obtenção de hemolisado entre 10 e 15 g/dl de hemoglobina, tal qual o método descrito a seguir, é importante para a dosagem de Hb Fetal, Hb A 2 e metahemoglobina. Para eletroforese qualitativa de hemoglobina é aconselhável usar hemolisados com concentrações de hemoglobina variáveis entre 4 e 6 g/dl. - Centrifugar 1mL de sangue colhido com anticoagulante, com solução salina a 0,85%, a rpm, durante 5 minutos e desprezar o sobrenadante para lavar os eritrócitos de 2 a 3 vezes, com solução salina. - Ao volume de eritrócitos lavados, adicionar outro de água destilada. Homogeneizar, e a seguir adicionar um volume de clorofórmio, idêntico ao do hemolisado formado. Agitar vigorosamente e centrifugar a rpm, por 15 minutos. - A solução de hemoglobina sobrenadante, ou hemolisado, é retirada por meio de pipeta Pasteur e transferida para um tubo limpo com identificação da amostra. A concentração do hemolisado, preparado conforme a metodologia apresentada, é variável entre 10 e 15 g/dl.

5 Detalhamento Técnico -4- Solução hemolisante: KCN Água destilada Solução de Hemoglobina: com KCN 0,05 g 100 ml Este procedimento é utilizado para eluir as amostras colhidas em papel de filtro. Picotar o círculo de papel de filtro (1/8) com a amostra, e colocar em placa de Kline ou tubo de ensaio com 50 µl de solução fisiológica a 0,85% aquecida a 37ºC e 100 µl desta solução hemolisante. Deixar eluir por no mínimo 15 minutos. O procedimento auxilia na diminuição dos resíduos de metahb gerados pela coleta em papel. TESTES SELETIVOS: RESISTÊNCIA GLOBULAR OSMÓTICA EM CLORETO DE SÓDIO A 0,36% (Silvestroni & Bianco, 1975) Princípio: Técnica utilizada para detectar talassemias do tipo beta principalmente na forma heterozigota, pois nesses casos os eritrócitos microcíticos são mais resistentes à hemólise nesta solução. A resistência globular não é específica para talassemia beta heterozigota, já que resultados positivos são encontrados também em anemias carenciais e outras hemoglobinopatias, como nos heterozigotos para hemoglobina C. No entanto cerca de 97% dos portadores de talassemia beta heterozigota apresentam positividade para esse teste. Solução estoque - NaCl a 10% - ph 7,4 NaCl 9,0 g Na 2 HPO 4 1,36g NaH 2 PO 4.H 2 O 0,28g Água destilada q.s.p 100mL Solução trabalho NaCl 10% Água destilada q.s.p 36 ml 1000mL Procedimento Em tubo de hemólise colocar 2,0 ml de solução de NaCl a 0,36% e 10 µl de sangue total. Agitar por inversão, suavemente e aguardar 10 minutos para leitura. Interpretação Colocar o tubo de hemólise com a amostra na solução de NaCl a 0,36% a 2,0 cm de uma folha branca com linhas negras. A resistência aumentada à hemólise do eritrócito torna a amostra opaca e não se visualiza as linhas negras. Em amostras com resistência normal à hemólise visualiza-se facilmente as linhas através da solução. Submeter as amostras com resistência aumentada a exames posteriores para o diagnóstico da talassemia beta heterozigota. Figura 1.

6 Detalhamento Técnico -5- ANÁLISE, À FRESCO, DA MORFOLOGIA ERITROCITÁRIA. (Bonini-Domingos, 1993) Em esfregaço sanguíneo a fresco analisa-se o tamanho, a forma e a quantidade de Hb nos eritrócitos. Os indivíduos portadores de talassemia beta heterozigota apresentam moderada anisopoiquilocitose com prevalência de microcitose e hipocromia facilmente visualizadas ao microscópio óptico. Os resultados podem ser divulgados da seguinte maneira, segundo padronização do LHGDH para cada um dos parâmetros avaliados. Figura 2. - alterações discretas: (+) - alterações moderadas: (++) - alterações acentuadas: (+++) - células normais: (N) Figura 1. Resistência globular osmótica em NaCl a 0,36%. Teste positivo à direita. Figura 2. Esfregaço sangüíneo com alterações moderadas.

7 Detalhamento Técnico -6- ELETROFORESE EM ph ALCALINO EM ACETATO DE CELULOSE (Marengo & Rowe, 1965, com modificações) Princípio: É uma técnica utilizada para qualificação e quantificação de hemoglobinas normais e grande parte das anormais. As diferentes mobilidades eletroforéticas das hemoglobinas anormais são originadas por alteração de carga elétrica, causada por substituições de aminoácidos diferentes nas cadeias formadoras das moléculas. As hemoglobinas anormais que se originam de mutações onde não ocorre mudança de carga elétrica, migram na posição de Hb A. Nestes casos para a caracterização dessas hemoglobinas, usam-se outros processos eletroforéticos. Tampão TRIS-EDTA-BORATO (TEB) ph 8,6 Tris hidroximetil aminometano Ácido etilenodiaminotetracético Ácido Bórico Água destilada q.s.p Conservar em geladeira Corantes: Negro de amido Negro de amido 10B Álcool metílico Ácido acético glacial Água destilada Ponceau Ponceau S Ácido tricloroacético Água destilada q.s.p Solução descorante: Ácido acético glacial. Metanol Água destilada q.s.p 10,2 g 0,6 g 3,2 g 1000 ml 0,5 g 45,0 ml 5,0 ml 45,0 ml 0,5 g 5,0 g 100 ml 100 ml 50 ml 1000 ml - Embeber as fitas de acetato de celulose por 15 minutos no mínimo e no máximo por 6 horas, em tampão TEB. - Secar as fitas entre duas folhas de papel absorvente e colocá-las na cuba de eletroforese, conectando-as com os compartimentos eletrolíticos através de tiras de papel mata-borrão, papel filtro ou perfex. - Aplicar as amostras de solução de hemoglobinas a 1,0 cm da extremidade da fita que está em contato com o pólo negativo. - Passar 300 volts por 30 minutos. - Analisar as frações sem coloração e posteriormente corar com Negro de amido ou Ponceau, embebendo as fitas em um dos corantes por 5 minutos, e posteriormente em solução descorante por 30 minutos, com agitação da vasilha. A identificação segue mapa de migração de Hemoglobinopatias. Figura 3. Em gel de Agarose (CELM) - obedece ao mesmo princípio acima descrito, porém o gel vem pronto para aplicação e com tampão de corrida específico. Fornece boa separação das frações de Hemoglobinas variantes. Figura 4

8 Detalhamento Técnico -7- Figura 3. Traçado eletroforético em ph alcalino e ácido das principais hemoglobinopatias. (Helena Laboratories)

9 Detalhamento Técnico -8- AS CC A? AF AS AA2 A? AS Figura 4. Gel de agarose da CELM com padrão eletroforético de hemoglobinas normais e anormais. Densitometria A quantificação das frações hemoglobínicas obtidas por eletroforese, através da densitometria, pode ser realizada em Densitômetro Digital DS-35 (CELM), após a transparentização da fita corada. A leitura é realizada em 520 nm. Após leitura das bandas, os resultados do mostrador digital são apresentados em concentrações e porcentagens individuais, e podem ser impressos em cartões em forma de gráfico, com os respectivos valores. Transparentização Este procedimento é realizado para possibilitar a leitura das frações de hemoglobina pelo densitômetro. Permite a conservação das fitas de acetato para registros. Metanol P. A. Solução de Transparentização: Ácido acético Metanol Glicerina 50 ml 14 ml 85 ml 1,0 ml - Utilizando uma pinça mergulhar as fitas de acetato de celulose, após descoradas, no metanol por no máximo 60 segundos. - Em seguida transferi-las para a solução ácido acético:metanol:glicerina por 40 segundos. - Colocar a fita de acetato em lâmina de vidro e leva-la a estufa à 60ºC, para secar a fita, por um tempo aproximado de 2 minutos.

10 Detalhamento Técnico -9- TÉCNICAS ESPECÍFICAS ELETROFORESE EM ACETATO DE CELULOSE ph NEUTRO (Dacie & Lewis, 1985) Princípio: É uma técnica utilizada para identificação e quantificação das hemoglobinas H e Bart s, que apresentam perfil de migração em ph alcalino similar a proteínas plasmáticas. Tampão ph neutro KH 2 PO 4 Na 2 HPO 4 Água destilada q.s.p. Conservar em geladeira 3,11 g 1,66 g 1000 ml - Embeber as fitas de acetato de celulose por quinze minutos no mínimo em tampão ph neutro. Colocar o mesmo tampão nos compartimentos eletrolíticos da cuba de eletroforese. - Secar as fitas entre duas folhas de papel absorvente e colocá-las na cuba de eletroforese conectando-as com os compartimentos eletrolíticos através de tiras de papel mata borrão ou perfex. - Aplicar as amostras de hemoglobina a 1,0 cm da extremidade da fita que está em contato com o pólo negativo. - Passar 300 Volts por 30 minutos. - Analisar as frações sem coloração, seguido mapa específico de identificação. Consultar o mapa de traçado de eletroforeses, conforme ilustrado no esquema da figura 5. - Hb H Hb Bart s Outras hemoglobinas + Adulto normal Adulto anormal RN normal RN anormal Orige m Figura 5. Esquema do padrão de migração de hemoglobinas de adultos e recém-nascidos em ph neutro.

11 Detalhamento Técnico -10- DOSAGEM DE HEMOGLOBINA H (Marengo & Rowe,1965, com modificações) São os mesmos utilizados na eletroforese em acetato de celulose ph 7,0. Utilizado como método auxiliar na identificação das formas alfa talassemicas. - Aplicar 20 µl de solução de hemoglobinas com concentração entre 8 e 12%, em fita de acetato de celulose com 5,7 cm de largura. - Passar 300 Volts por 30 minutos. - Após a separação das frações de hemoglobina H e A, recortá-las com tesoura e eluí-las em tubos de ensaio contendo 3 ml de água destilada para hemoglobina H, e 15 ml de água destilada para Hb A. - Deixar eluir de duas a seis horas com agitação periódica. - Ler as densidades ópticas (D.O.) em 415 nm, usando água destilada como branco. Cálculo: D.O. HbH X 100 % Hb H = D.O. Hb H + (D.O. HbA x 5) Valor normal de Hb H é 0%. PESQUISA DE CORPÚSCULOS DE HEINZ E AGREGADOS DE HEMOGLOBINA H (Papayannopoulos & Stamatayannopoulos, 1974) Princípio: Os corpúsculos de inclusão de hemoglobina H são formados por cadeias beta oriundas da desnaturação do tetrâmero. Após coloração esses corpúsculos apresentam-se dispostos homogeneamente no interior dos eritrócitos como pequenos pontos azulados. Solução salina: Cloreto de sódio Água destilada q.s.p. Solução citrato: Citrato de sódio Água destilada q.s.p. Solução de Azul Cresil Brilhante: Azul Cresil brilhante Solução salina Solução citrato 0,9 g 100 ml 2,2 g 100 ml 1,0 g 100 ml 25 ml - Colocar 50 µl de sangue total em tubo de ensaio pequeno e adicionar 50 µl de solução de azul Cresil brilhante. Agitar o tubo suavemente. - Incubar o material a 37ºC por 30 e 60 minutos.

12 Detalhamento Técnico Fazer esfregaços finos e examinar ao microscópio em objetiva de imersão. A presença de Hb H nos eritrócitos aparece como fina granulação distribuída homogeneamente, caracterizando um portador de alfa talassemia (Figura 6). E para Corpos de Heinz precipitação grosseira em portadores de hemoglobinas instáveis. Ret Figura 6. Corpúsculos de inclusão de Hb H e Heinz; Ret: reticulócitos. Adaptação da técnica para estudo neonatal (Mendiburu, 2002) Corpos Célula Corpos de Heinz Normal de Hb H Uma alternativa para melhorar a visualização dos corpos de inclusão é a confecção da lâmina através do seguinte método: - colocar uma gota da solução de sangue com azul cresil brilhante, após incubação, no centro da lâmina e cobrir com uma lamínula, pressionando suavemente para retirar o excesso. - Examinar ao microscópio com objetiva de imersão. Este procedimento melhora a qualidade da lâmina, pois reduz a quantidade de corante precipitado entre as células, facilitando a identificação dos corpos de inclusão. ELETROFORESE QUANTITATIVA EM ACETATO DE CELULOSE Dosagem de Hb A2 ( Marengo & Rowe, 1965) Princípio: O aumento de Hb A2 na grande maioria dos casos está associado às talassemias beta heterozigóticas. Porém em algumas condições patológicas, muitas de origem adquiridas, os níveis dessa hemoglobina estão acima dos normais. São os mesmos utilizados na eletroforese em acetato de celulose ph alcalino para análise qualitativa de hemoglobinas. - Aplicar 20 microlitros de solução de hemoglobinas com concentração entre 8 e 12 g%, em fitas de acetato de celulose com 5,7 cm de largura. - Passar 300 volts por 40 minutos.

13 Detalhamento Técnico Após a separação das frações de Hb A2 e A, recortá-las com tesoura e eluí-las em tubos de ensaio contendo 3 ml de água destilada para Hb A2, e 15 ml de água destilada para Hb A. - Deixar eluir de duas a seis horas, com agitação periódica. - Ler as densidades ópticas (D.O.) em 415 nm, usando água destilada como branco. Cálculo: D.O. HbA2 X 100 % HbA2 = D.O. Hb A2 +(D.O. HbA x 5) Valores normais: 2,5% a 3,5% ELETROFORESE DE DIFERENCIAÇÃO EM ÁGAR-FOSFATO, ph 6,2 (Vella, 1968). Princípio: A eletroforese em gel de ágar-fosfato ph 6,2 é específica para diferenciar alguns tipos de hemoglobinas mais lentas que a Hb A, como por exemplo: Hb S e Hb D; Hb C e Hb E que em eletroforese alcalina, migram em posições semelhantes, dificultando a correta identificação. Por este método, as Hb S e Hb C se separam da Hb A, enquanto as Hb D e Hb E migram na mesma posição da Hb A. Esse método permite também a caracterização semi-quantitativa de hemoglobina fetal. Tampão Fosfato ph 6,2 - Para uso nos compartimentos eletrolíticos e confecção do gel. Na2HPO4 2,02 g NaH2PO4.H2O 7,66 g Água destilada q.s.p 1000 ml Conservar em geladeira Gel de Ágar-Fosfato Ágar-agar Tampão fosfato ph 6,2 500 mg 25 ml - Em um erlenmeyer de 250 ml aquecer os componentes do gel de ágar-fosfato até completa dissolução. - Pipetar 5,0 ml do gel em 5 lâminas de microscópio. Deixar gelificar à temperatura ambiente. - Aplicar as amostras na porção média da lâmina, inserindo o aplicador e com cuidado para não partir totalmente o gel - Para conexão do gel com os compartimentos eletrolíticos usar folha dupla de papel de filtro. - Passar 100 volts por 30 minutos. - Analisar inicialmente sem corar. - Para melhor interpretação das frações corar com Ponceau ou Negro de Amido. Consultar o mapa de diferenciação das disposições de hemoglobinas em eletroforese ph ácido (Figura 3).

14 Detalhamento Técnico -13- Em gel de Agarose da CELM - obedece ao mesmo princípio acima descrito, porém o gel vem pronto para aplicação e com tampão de corrida específico. Fornece boa separação das frações de Hb variantes. Figura 7. Hb F Hb A Hb S Hb C Figura 7. Gel de eletroforese ácida da CELM, com padrões de hemoglobinas normais e anormais. DOSAGEM DE HEMOGLOBINA FETAL (Betke et al., 1959) Princípio: A hemoglobina Fetal é alcali-resistente, enquanto que as Hb A, Hb A2 e os tipos anormais são facilmente desnaturáveis por soluções alcalinas. Esse método é sensível para detectar pequenas quantidades de hemoglobina Fetal. Concentrações acima de 1% refletem aumento de hemoglobina Fetal. Em sangue de cordão umbilical a quantidade da hemoglobina Fetal é aproximadamente 70 a 90% e o método para sua quantificação deve ser readequado. Em indivíduos com talassemia beta homozigota a taxa desta hemoglobina oscila entre 60 a 98%; na interação talassemia beta/hb S, o valor varia entre 0,5 a 21,2%. Na talassemia Beta heterozigota, a hemoglobina Fetal pode estar normal ou discretamente aumentada. Solução de ferricianeto de potássio (Drabkin) Ferricianeto de potássio 0,20 g Cianeto de potássio 0,20 g Água destilada q.s.p 1000 ml Solução de hidróxido de sódio 1,2N Hidróxido de sódio Água destilada q.s.p Solução saturada de sulfato de amônio Sulfato de Amônio Água destilada q.s.p As soluções devem ser conservadas em geladeira. 48,0 g 1000 ml 500 g 500 ml - Diluir 0,3 ml da solução de hemoglobina em tubo contendo 5,0 ml da solução de Drabkin. Homogeneizar por inversão. - Colocar 2,8 ml da solução de hemoglobina diluída em um tubo rotulado como "Hb F". Adicionar 0,2 ml da solução de hidróxido de sódio 1,2N e acionar o cronômetro. Agitar cuidadosamente por 10 segundos.

15 Detalhamento Técnico Após 2 minutos exatos da adição de Solução de hidróxido de sódio 1,2N, adicionar 2,0 ml da solução saturada de sulfato de amônio. Homogeneizar por inversão e deixar em repouso por 5 a 10 minutos, no máximo. - Filtrar o conteúdo do tubo "Hb F" em duplo papel de filtro. - Preparar a solução padrão, colocando em um tubo de ensaio de 0,7 ml da solução de hemoglobina diluída, 0,3 ml de água destilada e 1,0 ml da solução saturada de sulfato de amônio. Transferir 0,5 ml desta solução para outro tubo e juntar 4,5 ml de solução de Drabkin. A solução de hemoglobina total é 10 vezes mais diluída que a solução de hemoglobina alcaliresistente. - Ler a densidade óptica dos tubos padrão e "Hb F" em 540 nm, usando solução de Drabkin como branco. Cálculo: D.O. Hb F % de Hb F = x 100 D.O. Padrão x 10 Adultos normais apresentam valores entre 0,0 e 1,0% de hemoglobina fetal. TESTES DE PRECIPITAÇÃO DE HEMOGLOBINAS INSTÁVEIS Princípio: As cadeias de globina e o tetrâmero normal de Hb são estruturas altamente estáveis e dependem da força coletiva de quatro fatores: um grande conteúdo helicóide que constitui 75% da estrutura de cada cadeia polipeptídica; o firme ligamento entre o grupo heme e o polipeptídio (globina); a localização interna de aminoácidos não-polares e hidrofóbicos, que mantém o "pacote" de proteção ao grupo heme; os contatos alfa1-beta1 que estabilizam a integração entre as cadeias alfa e beta. A diminuição da estabilidade da hemoglobina pode ser resultante da alteração de qualquer um dos quatro fatores, geralmente sensíveis quando expostos ao calor. Em um tampão apropriado, a hemoglobina normal dificilmente se precipita quando submetida à alta temperatura (50 C a 60 C), por determinado período de tempo de exposição; sob as mesmas condições as hemoglobinas instáveis se desnaturam. Teste de Desnaturação pelo Calor (Dacie & Lewis,1985) Solução de fosfato monobásico de sódio 0,1 M NaH 2 PO 4.H 2 O Água destilada q.s.p Solução de hidrogeno-fosfato de di-sódio 0,1 M Na 2 HPO 4 (P.A.) Água destilada q.s.p Solução tampão fosfato ph 7,4 Solução de NaH 2 PO 4.H 2 O 0,1 M Solução de Na 2 HPO 4 0,1 M As soluções devem ser conservadas em geladeira 13,8 g 1000 ml 14,2 g 1000 ml 19,2 ml 80,8 ml NaCl 0,85%

16 Detalhamento Técnico Em um tubo de hemólise colocar 1 ml de sangue fresco, coletado com anticoagulante. Centrifugar a rpm e desprezar o plasma. Lavar os eritrócitos com NaCl 0,85% por duas vezes. Hemolisar os eritrócitos com 5 ml de água destilada. Homogeneizar por seis vezes por inversão. - Transferir o hemolisado para um tubo maior, e adicionar 5 ml do tampão fosfato (ph 7,4), homogeneizar por seis vezes por inversão e centrifugar por 10 minutos a rpm. - Transferir 2 ml do sobrenadante para outro tubo e incubá-lo a 50 C, em banho-maria, por uma hora, ou a 60 o C por trinta minutos. - Observar se houve precipitação a cada 10 minutos Controle: É fundamental o uso de uma amostra controle, obtida nas mesmas condições da amostra teste. Em amostras de sangue com hemoglobinas normais é possível que ocorra discreto grau de precipitação ao final de 60 minutos. O resultado é positivo quando a precipitação é em flocos e em grande quantidade, geralmente após 20 minutos de incubação. Precauções: - As amostras a serem analisadas não devem exceder 72 horas após a coleta. - O diagnóstico da Hb instável deve ser confirmado por outros testes específicos: a) pesquisa de corpos de Heinz; b) eletroforese de hemoglobina; c) dosagem de metahemoglobina. - A temperatura e o ph 7,4 do tampão são pontos críticos nesse teste. Teste de Precipitação por Isopropanol (Carrel & Kay, 1972) Em algumas hemoglobinas instáveis a precipitação ao calor pode ser normal, mas a sensibilidade a produtos químicos, com ação sobre a estabilidade da molécula está alterada. É aconselhável a realização dos dois procedimentos nos casos de suspeita clínica de Hb instáveis. Solução tampão Tris/isopropanol ph 7,4 Tris-hidroximetil-aminometano Isopropanol Água destilada q.s.p 12,11 g 170 ml 1000 ml Ajustar o ph 7,4 com HCl concentrado. Conservar em geladeira. - Colocar 2 ml do tampão Tris/isopropanol em tubo de hemólise e incubar 37 C por 5 minutos. - Adicionar ao tampão incubado, 0,2 ml da solução de hemoglobina que se pretende examinar, preparada com clorofórmio. Agitar o tubo por inversão, arrolhar e deixar por uma hora a 37 C. - Observar se houve precipitação, a cada 10 minutos.

17 Detalhamento Técnico -16- A presença de Hb instável causa floculação nos primeiros 10 minutos, seguida de precipitação. Precauções: - As hemoglobinas normais permanecem estáveis durante o processo. Entretanto, pode ocorrer discreta precipitação em alguns casos, após minutos. A Hb S é mais instável que a Hb A. - É necessário o uso de uma amostra controle, obtida nas mesmas condições que o teste. - A temperatura e o ph do tampão são pontos críticos nesse teste. -O diagnóstico de Hb instável deve ser confirmado por outros testes específicos conforme citado no teste anterior. COLORAÇÃO INTRA-ERITROCITÁRIA DE Hb FETAL (Kleihauer et al.,1957, com modificações) Principio: Esse método é baseado na diferença da capacidade de dissociação existente entre as Hb A e Hb Fetal, em ph abaixo de 4,0. A Hb Fetal é ácido-resistente e por isso não é eluída das células, corando-se facilmente com eritrosina ou similar, enquanto outros tipos de hemoglobinas, por serem eluídas, não fixam o corante. Este teste é utilizado par diferenciar condições herdáveis com presença de Hb F aumentada. Tampão citrato-fosfato ph 3,3 Ácido cítrico 0,1 M Fosfato di-sódio hidratado 0,2 M Deve ser preparado no momento do uso. 100 ml 30 ml Solução aquosa de eritrosina a 0,1%. Solução de etanol a 80%. - Fazer esfregaços finos e fixá-los com etanol a 80%, por cinco minutos. Lavar, a seguir, com água corrente e secar ao ar. - Introduzir os esfregaços em vasilha-suporte de lâminas contendo tampão citrato-fosfato ph 3,3 previamente aquecido a 37ºC, por cinco minutos. Lavar com água corrente e secar ao ar. - Corar com eritrosina por dois minutos. Lavar com água corrente, secar e examinar em microscópio com aumento de 400 vezes. Os eritrócitos contendo Hb Fetal aparecem corados internamente, enquanto os outros que não a contém permanecem sem coloração interna. A coloração é homogênea quando todos os eritrócitos aparecem corados e podem, ser encontrados em sangue de cordão umbilical de recém-nascidos, e portadores de persistência hereditária de Hb Fetal. A coloração é heterogênea quando existem duas populações eritrocitárias distintas, ou seja, uma corada e a outra sem coloração, e esses são os casos das diferentes formas de beta talassemia maior, com exceção dos portadores do genótipo talassêmico β δ/β δ. A figura 8 ilustra uma lâmina de eritrócitos com hemoglobina fetal aumentada.

18 Detalhamento Técnico -17- Figura 8. A amostra ilustra um perfil de coloração para talassemia com os eritrócitos com Hb F mais corados. DOSAGEM E CURVA ESPECTROFOTOMÉTRICA DE METAHEMOGLOBINA Princípio: A presença de metahemoglobina pode ser originada por: excessiva formação de metahemoglobina; diminuição da reconversão de metahemoglobina para globina; anormalidade da porção globínica devido à substituição da histidina proximal ou distal por outro aminoácido. As duas primeiras causas são evidenciadas por aumento de metahemoglobina normal, enquanto a terceira se caracteriza pela elevação quantitativa de metahb anormal - ou Hb M. A excessiva formação de metahemoglobina pode ser induzida por vários tipos de drogas (sulfas, fenacetina, anilina, etc.), bem como por determinados poluentes químicos (óxidos de nitrogênio e enxofre, nitritos, nitratos, nitro-benzeno, etc.). Esses agentes promovem a formação de peróxido de hidrogênio intracelularmente, convertendo a hemoglobina em metahemoglobina. A diminuição da reconversão de metahb para oxihb é causada por deficiência enzimática, durante o ciclo de Embden-Meyerhof, especificamente por funcionamento inadequado do NADH ligado à metahemoglobina-redutase ou diaforase. Essa deficiência enzimática pode ser herdada de forma recessiva. A anormalidade da porção globínica é devido à alteração do gene estrutural que promove a substituição da histidina proximal, ou distal, por outro tipo de aminoácido. A intensidade das alterações fisiopatológica é diferente para Hb M Boston, Hb M Hyde Park, Hb M Iwate, Hb M Milwalkee, Hb M Saskatoon. DOSAGEM DE METAHEMOGLOBINA (Gerald, 1966) Solução tampão fosfato M/15 ph 6,6: Na 2 HPO 4.12H 2 O KH 2 PO 4 Água destilada q.s.p 9,0 g 5,7 g 1000 ml Solução Tampão fosfato M/60 ph 6,6 Diluir 250 ml da solução fosfato M/15 para 1 litro de água destilada (q.s.p.). Solução de ferricianeto de potássio 20% Solução de hidróxido de amônio Cianeto neutralizado - preparar no momento do uso cianeto de sódio (ou potássio) 10% ácido acético 10% misturar 5 gotas de cianeto de sódio 10% com 5 gotas de ácido acético 12%.

19 Detalhamento Técnico Colocar em um tubo de ensaio 10 ml de tampão fosfato M/60, 0,2 ml de sangue. Agitar e deixar em repouso por 2 minutos. Ler a DO em D1: Leitura da metahemoglobina - Adicionar uma gota de cianeto neutralizado. Agitar e deixar em repouso por 2 minutos. Ler a DO em D2: Leitura da cianometahemoglobina. - Adicionar uma gota de ferricianeto de potássio 20% e uma gota de hidróxido de amônio. Deixar em repouso por 2 minutos. Ler a DO em D3: Leitura da sulfohemoglobina. - Transferir 2 ml do tubo, cuja solução foi submetida as três dosagens iniciais, para outro contendo 8 ml de tampão fosfato M/15. Deixar em repouso por 2 minutos. Ler a DO em D4: Leitura da oxihemoglobina. Branco: 10 ml de H 2 O 1 gota de ferricianeto de potássio 20% 1 gota de cianeto neutralizado Cálculo: 1.) Meta Hb = D1 - D x 100 = g% D4 2.) Sulfo Hb = D3 - D4 x 100 = g% Os valores normais para metahemoglobina não ultrapassam 3%, e os de sulfohemoglobina no máximo 1%. Assim, é aconselhável realizar o teste usando uma ou duas amostras de sangue colhidas nas mesmas condições e com Hb normal. Precauções: - Não pipetar as soluções que contenham cianeto. - Obedecer rigorosamente o tempo de repouso. CURVA DE METAHEMOGLOBINA (Gerald, 1966) Solução de ferricianeto de potássio a 5%, preparada na hora do procedimento. Solução tampão fosfato M/15 ph 6,6: Na 2 HPO 4.12H 2 O 9,0 g KH 2 PO 4 5,7 g Água destilada q.s.p 1000 ml - Diluir 0,1 ml de hemolisado preparado com clorofórmio em 10 ml do tampão fosfato ph 6,6. Agitar por inversão. - Acrescentar 0,05 ml de ferricianeto de potássio e deixar em repouso por 10 minutos. Fazer a leitura das densidades ópticas de 480 a 630 nm em espaços de 10 nm. Analisar o resultado após a confecção da curva de absorção. - Usar como branco o tampão fosfato M/15, acertando o zero da absorbância a cada mudança de comprimento de onda. As metahemoglobinas por defeito na globina apresentam picos de absorção diferentes ao da metahb A (normal).

20 Detalhamento Técnico -19- As amostras com metahemoglobinemias induzidas apresentam absorções semelhantes às da metahb A. As metahemoglobinemias causadas por deficiências enzimáticas podem exibir curva semelhante à da metahb A, ou mostrar um platô de absorção uniforme entre 600 e 630 nm. ELETROFORESE DE CADEIAS POLIPEPTÍDICAS Princípio: A caracterização estrutural das hemoglobinas anormais é realizada em condições especiais devido ao alto custo e às dificuldades inerentes aos métodos utilizados. Para dar seqüência ao estudo de uma hemoglobina anormal não identificável pelos métodos de qualificação e quantificação, utiliza-se a eletroforese de cadeias polipeptídicas. A separação eletroforética de cadeias globínicas constitui uma análise pré-molecular, muitas vezes conclusiva para o diagnóstico de hemoglobina anormal, sem que haja necessidade de se aplicar métodos de disposição bidimensional de peptídeos e análises de aminoácidos, ou biologia molecular. Em ph Alcalino (Schineider, 1974, com modificações) Tampão Tris-EDTA-borato ph 8,6 Corante Negro de Amido Uréia 2-mercaptoetanol - No dia anterior ao teste preparar o tampão trabalho, misturando 36 g de uréia e 70 ml de tampão Tris-EDTA-borato ph 8,6 (tampão Tris-uréia), em um "becker". Deixar a solução homogeneizando em agitador magnético, até o momento do uso, em temperatura ambiente. O tempo de dissolução deve ser superior a 12 horas. - Preparar as amostras misturando 50 µl do tampão Tris-uréia, 50 µl de 2- mercaptoetanol e 50 µl de hemolisado preparado com clorofórmio, em um pequeno tubo. Deixar em repouso por 1hora à temperatura ambiente. - Adicionar 6,4 ml de 2-mercaptoetanol ao tampão Tris-uréia restante, misturar bem e colocar a solução tampão Tris-uréia-mercaptoetanol nos compartimentos eletrolíticos, reservar quantidade suficiente dessa solução para embebimento do acetato de celulose por 1 hora. - Retirar o excesso da solução tampão do acetato entre duas folhas de papel de filtro e colocá-lo bem esticado na cuba de eletroforese, fazendo conexões com os compartimentos eletrolíticos com papel filtro duplo. - Aplicar as amostras na porção superior do acetato, próximo ao pólo positivo da cuba. - Passar 110 volts por 40 minutos; após este tempo alterar a Voltagem para 220 volts e deixar por mais 20 minutos. - Corar as fitas com Negro de amido ou outro corante de proteínas. Colocar em solução descorante. Controle: É importante realizar esse processo comparando com cadeias polipeptídicas de hemoglobinas já caracterizadas, como por exemplo: Hb AS, Hb AC, ou Hb SC. A figura 9 ilustra uma fita de acetato de celulose de uma eletroforese de cadeias globínicas conforme descrito para identificação das globinas normais e anormais.

21 Detalhamento Técnico -20- Deve seguir mapas de migração específicos como ilustrado na figura 10. β A β S β C α A Figura 9. Eletroforese de cadeias em ph Alcalino, em acetato de celulose para amostras de Hb AS e Hb AC. Figura 10. Representação esquemática das mobilidades relativas de algumas cadeias globínicas (Modificado de Dacie & Lewis, 1995). ph Ácido (Alter et. al., 1980) Segue o mesmo princípio da eletroforese de cadeias globínicas em ph alcalino, permitindo a separação das frações de globinas por suas afinidades diferenciadas em ph ácido. Permite boa visualização das globinas gama. Metodologia bastante precisa para a separação de globinas, podendo também ser utilizada para quantificação das frações. Solução estoque gel poliacrilamida 60:0,4 Acrilamida Bis- acrilamida H 2 O q.s.p. 15 g 0,1 g 25 ml

22 Detalhamento Técnico -21- Uréia 8M Uréia H 2 O q.s.p. 12 g 25 ml 2 Mercaptoetanol 1M 2 - Mercaptoetanol 35 µl H 2 O q.s.p. 500 µl Tampão para Corrida Ácido acético 5% Ácido acético glacial H 2 O q.s.p. 50 ml 1000 ml Gel de poliacrilamida 12% Solução estoque 2,5 ml Ácido acético 625 µl Uréia 8M 9,375 ml Triton X µl Persulfato de amônio a 25% 30 mg TEMED 100 µl Tampão de amostra Uréia 8M 1,25 ml Ácido acético glacial 125 µl 2- mercaptoetanol 125 µl Pironina Y 1,0 mg Preparação do gel de poliacrilamida: - Misturar a solução estoque de acrilamida-bisacrilamida (60:0,4%), uréia 8M, ácido acético glacial, persulfato de amônio, TEMED. Colocar a solução do gel nas placas, previamente limpas e montadas utilizando espassadores. Após este procedimento introduzir o molde para a formação das canaletas. Aguardar 30 minutos para a polimerização em temperatura aproximada de 30ºC. - Após polimerização do gel, submeter à 200Volts por 1 hora, com tampão ácido acético 5% nos compartimentos eletrolíticos e o pólo positivo no topo. Este procedimento é realizado para homogeneização do ph entre o gel e o tampão. - Trocar o tampão de corrida dos compartimentos eletrolíticos, retirando o excesso de tampão das canaletas, em seguida aplicar 10 µl de 2 mercaptoetanol 1M em cada canaleta e submeter o gel à 150 Volts por 1 hora. Preparação da amostra: - Centrifugar 100 µl de sangue com solução salina a 0,85%, a rpm, durante 5 minutos e desprezar o sobrenadante. Repetir no mínimo por 4 vezes. Ao volume de eritrócitos lavados, adicionar 10x o volume de água destilada para romper os eritrócitos e liberar a hemoglobina. - Preparar as amostras para aplicação misturando 1,5 µl do hemolisado, descrito acima, com 10 µl do tampão de amostra. - Após a realização das pré-corridas trocar novamente o tampão de corrida, aplicar as amostras e submeter a corrente constante de 50mA (200V) por 3 horas.

23 Detalhamento Técnico -22- A interpretação das cadeias polipeptídicas deverá ser feita seguindo o mapa representado na figura 10. Controle: É importante a utilização de uma amostra controle como a Hb AC. A figura 11 ilustra um gel de uma eletroforese de cadeias globínicas em ph ácido. Cadeia γ A Cadeia γ G Cadeia β A Cadeia β Mutante Cadeia δ Cadeia α A Figura 11. Gel de poliacrilamida 12% para eletroforese de cadeias polipeptídicas em ph ácido. FOCALIZAÇÃO ISOELÉTRICA EM GEL DE AGAROSE (Naoum, 1990, com modificações) Princípio: Método específico para o fracionamento de espécies moleculares de Hb que diferem somente nas suas quantidades de cargas. Assim, como a separação não é devida a qualquer efeito seletivo do tamanho da molécula, o seu transporte através do meio se faz com ótima resolução, separando as macromoléculas por seu ponto isoelétrico com diferenças de unidades de ph de até 0,001. (Pharmacia Fine Chemicals) Agarose I.E.F. Anfolinas ph 5-8 Anfolinas ph 3-10 Tampão ácido fosfórico Ácido Fosfórico Água deionizada Tampão hidróxido de sódio NaOH Água deionizada Gel para corrida Agarose Água deionizada 3,8 ml 50,0 ml 4 g 100 ml 22 mg 13,2 ml

24 Detalhamento Técnico -23- Preparação do gel: - Pesar 22 mg de agarose em um erlenmeyer de 25 ou 50 ml, e adicionar 13,2 ml de água deionizada. - Colocar o erlenmeyer dentro de um Becker de 100 ml com água em ebulição e rolhas de borracha no fundo e observar constantemente a dissolução da agarose que deverá ocorrer dentro de 5 a 10 minutos. - Após este período adicionar as anfolinas nas seguintes proporções: 0,6 ml de ph 5-8; 0,4 ml de ph Colocar o gel rapidamente em placas de vidro pois a polimerização é rápida. - Enquanto o gel se solidifica, as amostras devem ser preparadas. Preparação dos hemolisados: - O hemolisado deve ser feito com amostra recente. Os eritrócitos devem ser lavados por 3 vezes com solução salina e ao volume dos eritrócitos lavados, adicionar 3 a 5 volumes de água deionizada. Centrifugar e utilizar o sobrenadante - Pré-focalização: A placa com o gel deverá ser colocada em cuba refrigerada. Na extremidade catódica da placa colocar uma tira de papel de filtro embebido em tampão NaOH. Na extremidade anódica, o papel de filtro deverá estar embebido em tampão ácido fosfórico. A seguir, conectar os eletrodos e aplicar corrente de 5 ma por 10 minutos, para que se forme o gradiente de ph. Após este período, desconectar os eletrodos e remover a placa para aplicação das amostras. - Embeber pequenas tiras de papel de filtro com as amostras e colocar sobre o gel, em sua porção mediana. As tiras de papel filtro devem estar unidas por fita adesiva para facilitar o manuseio. - Focalização: Aplicar corrente de 5 ma até que as amostras sejam transferidas do papel para o gel. Neste momento, retirar as tiras de papel de filtro e aumentar a potência para 8 ma. Acompanhar a migração com ajuste da miliamperagem, que deve se manter constante, até perfeita separação das amostra, o que deverá ocorrer por volta de 40 minutos. Fixação, secagem e coloração: As placas de agarose devem ser fixadas com ácido tricloroacético a 20% por 3 minutos. A seguir, a placa deve ser lavada em água destilada por aproximadamente 1 minuto. Para secagem, deixar à temperatura ambiente por 12 a 15 horas. A coloração pode ser feita com Ponceau ou Negro de Amido por 10 a 15 minutos, e a descoloração, em água destilada, com lavagens sucessivas até descoloração completa do gel. Após o fracionamento é possível visualizar numa amostra normal as Hb A, Hb A2, Hb F e Hb A1c, essa última com migração mais rápida que a Hb A. A resolução dessa técnica é superior à dos métodos eletroforéticos convencionais, permitindo a separação de metahemoglobinas e sulfohemoglobinas dentre outras. A identificação das frações segue mapa específico de migração esquematizado na figura 12.

25 Detalhamento Técnico -24- Figura 12. Representação esquemática das mobilidades relativas de algumas hemoglobinas anormais por focalização isoelétrica (Modificado de Dacie & Lewis, 1995).

26 Detalhamento Técnico -25- CROMATOGRAFIA LIQUIDA DE ALTA PRESSÃO (HPLC) O equipamento utilizado é o VARIANT da BIO-RAD com dois diferentes Kits de análise, Beta Talassemia Heterozigota e Sickle Cell. O Kit para Beta Talassemia Heterozigota além de ser utilizado para o diagnóstico da talassemia beta em amostras de indivíduos adultos, quantificando as Hb A2 e Hb Fetal, permite a caracterização através de janelas específicas para as Hb S, Hb C e Hb D Los Angeles, e também de algumas hemoglobinas variantes pelo padrão cromatográfico, tempos de retenção e porcentagem dos diferentes picos. Para amostras de recém-nascidos o Kit Sickle Cell possibilita a caracterização qualitativa das hemoglobinas variantes, Hb S, Hb C, Hb D e Hb E, além de algumas variantes de migração rápida, sendo bastante empregado no diagnóstico neonatal de hemoglobinopatias. A Cromatografia Líquida de Alta Pressão neste equipamento consiste da cromatografia de troca iônica em um sistema fechado, no qual duas bombas de êmbolo duplo e uma mistura de tampões de diluição com controles de gradientes pré programados passam (415 e 690 nm) monitora a eluição da hemoglobina na coluna, detectando as alterações de absorbância a 415 nm. O filtro secundário corrige a linha de base para efeitos provocados pela mistura de tampões com forças iônicas diferentes. As mudanças na absorbância são monitoradas e exibidas como um cromatograma da absorbância x tempo. Os dados de análise provenientes do detector são processados por um integrador embutido e impressos no relatório da amostra de acordo com o tempo de retenção. O tempo de retenção é o tempo transcorrido entre a injeção da amostra até o ápice do pico da hemoglobina. Cada hemoglobina tem um tempo de retenção característico. No final da análise da amostra, uma cópia do cromatograma e os dados do relatório são automaticamente impressos. A) Para Kit Beta Talassemia Heterozigota: Misturar, em um tubo, 5 µl de sangue total com 1,0 ml de solução hemolisante fornecida no kit de análise. B) Para Kit Sickle Cell: Misturar 5 µl de sangue total com 1 ml de água MiliQ. - Após hemólise total, acondicionar as amostras nos recipientes adequados e aloja-los no equipamento, que irá realizar os procedimentos pré-programados de leitura das amostras. A) Para Kit Beta Talassemia Heterozigota: a quantificação das diferentes frações de hemoglobina em uma amostra é realizada a partir dos valores de porcentagem e tempo de retenção comparados com os valores de calibração específicos fornecidos pelo fabricante. B) Para Kit Sickle Cell: a caracterização das diferentes frações de hemoglobina é realizada comparando-se o tempo de retenção com os valores de calibração específicos fornecidos pelo fabricante A figura 13 ilustra cromatogramas obtidos pelo Variante BIO-RAD, nos dois Kits acima mencionados.

27 Detalhamento Técnico -26- Kit Beta Talassemia Heterozigota Amostra normal Amostra com Hb S Kit Sickle Cell Amostra normal Amostra com Hb S Figura 13. Cromatogramas obtidos pelo equipamento Variant- BIO-RAD. As Setas indicam os picos da Hb S.

28 Detalhamento Técnico -27- REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS ALTER B.P.; GOOF, S.C.; EFREMOV, G.D.; GRAVELY, M.E.; HUISMAN, T.H.J. Globin chain electrophoresis: a new approach to the determination of the Gγ/Aγ ratio in fetal haemoglobin and to the studies of globin synthesis. Br.J.Haematol.v.44, p , BETKE, K.; MARTI, N. R.; SCHLICHT, I. Estimation of small percentages of foetal haemoglobin. Nature, v. 184, p. 1877, BONINI-DOMINGOS, C. R. Hemoglobinopatias no Brasil - Variabilidade genética e metodologia laboratorial f. Tese (Doutorado em Ciências) Intituto de Biociências, Letras e Ciências Exatas, Universidade Esadual Paulista. CARREL, R. W.; KAY, R. A simple method for detectetion of unstables hemoglobins. British Journal of Hematology, v. 23, p , DACIE, J. V.; LEWIS, S.M. In: Practical Haematology 6th ed. Churchill, London, p.516, EASTMAN, J. W., WONG, R., LIAO, C. L., MORALES, D. R. Automated HPLC screening of newborns for sickle cell anemia and other hemoglobinopathies. Clin. Chem., v.42, n.5, p , GERALD, P. G. et al. The methemoglobinemias. In: Metabolic Basis of Inheritede Disease. Mac Graw Hill, N. Y., p. 1069, KLEIHAUER, E., BRAUN, H., BETKE, K. Demostration von fetalem haemoglobin in die erytrozyten lines Blutausstrischs. Klin. Wschr., v.35, p.627, MARENGO-ROWE, A. J. Rapid electrophoresis and quantitation of haemoglobin on cellulose acetate. J. Clin. Path., v. 18, p , MOREIRA, H. W., MONTEIRO, S. C. M., MARQUES, T. C., OLIVEIRA, F. S., BERTHOLO, L. C., GIMENEZ, I. C. Triagem das hemoglobinopatias por isoeletrofocalização. J. Bras. Patol., v.35, n.3, p.141-5, NAOUM, P. C. Eletroforese, técnicas e diagnósticos. São Paulo: Editora Santos, PAPAYANNOPOULOS, R.; STAMATONYANNOPOULOS, G. Stains for inclusions bodies. In: STANDARTIZATION of laboratory reagents and methodos for detection of haemoglobinopathies. Atlanta: Hew publications, SCHNEIDER, R. G. Differentiation of electrophoretically hemoglobins- suchas S, D, G, and P or A2, C, E, and O- by electrophoresis of the globin chains. Clin. Chem., v. 20, p , SILVESTRONI, E.; BIANCO, I. Screening for microcytemia in Italy: analysis of data collected in the past 30 years. Am. J. Hum. Genetic, v. 27, p. 198, 1975.

29 Detalhamento Técnico -28- VELLA, F. Acid agar gel electrophoresis of human hemoglobin. Am. J. Clin. Path., v. 49, n. 3, p , 1968.