Procedimentos Analíticos. Profa. Verônica Rodrigues

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1 Procedimentos Analíticos Gerais em Toxicologia Profa. Verônica Rodrigues FARMACÊUTICA INDUSTRIAL - UFRJ MESTRE EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS - UFRJ EX-DOCENTE - UNIPLI EX-PERITA LEGISTA - TOXICOLOGISTA - PCERJ PESQUISADORA EM PROPRIEDADE INDUSTRIAL - INPI

2 Procedimentos Analíticos em Toxicologia

3 CONSIDERAÇÕES SOBRE A AMOSTRA NA ANÁLISE TOXICOLÓGICA Análises Toxicológicas Forenses: Cadeia de custódia : Quem manuseou a amostra ou aliquota? Quando tal manuseio ocorreu? Onde a amostra ou a aliquota foi obtida? Considerações sobre a amostra: Aspecto da amostra (odor, cor, aparência)

4 CONSIDERAÇÕES SOBRE A AMOSTRA NA ANÁLISE TOXICOLÓGICA O que coletar? - Seleção da matriz biológica adequada: conhecimentos da toxicocinética do analito concentração média do analito no material amostrado Ex.: Intoxicação por paraquat pulmão Identificação de heroína / 6-MAM urina

5 Metabolismo de alguns Fármacos

6 Metabolismo de alguns Fármacos

7 Metabolismo de alguns Fármacos

8 Coleta e Preparo da Amostra Quanto coletar? - representatividade da amostra técnica analítica - quantidades de alíquotas: prova e contra-prova (toxicologia forense, exames de doping) Onde coletar? - uso de recipientes adequados que não contaminem as amostras

9 Coleta e Preparo da Amostra Fonte: Society of Forensic Toxicology, AAFS, 2002 (Fonte: Toxicologia Analítica. Moreaau & Siqueira )

10 Estocagem e Conservação da Amostra Ao abrigo: - luz (fotodegradação) - calor (degradação térmica) refrigeração (~ 4 ºC) congelamento - umidade (degradação microbiana)

11 Estocagem e Conservação da Amostra Adição de conservantes - antimicrobianos (fluoreto de sódio) - anticoagulantes (heparina) - antioxidantes (ácido ascórbico) Inviolabilidade da amostra - Autenticidade da amostra (laudo pericial) - Adulteração intencional ou acidental

12 Seleção de Amostras Biológicas

13 Seleção de Amostras Biológicas 1. Autenticidade Cuidados Gerais Garantia de que uma amostra de material biológico pertence a uma dado indivíduo depende de fatores como: - processo de coleta Garantia de - identificação da amostra cadeia de - adoção de critérios de inviolabilidade custódia segura - transporte e armazenamento adequados Algumas amostras precisam de cuidados especiais para que a autenticidade da mesma possa ser garantida, como no caso da urina.

14 Seleção de Amostras Biológicas Cuidados Gerais 2. Amostra de Tempo Anterior ao Uso Importante garantir que o indivíduo não trará consigo uma amostra autêntica (por exemplo, de urina) previamente coletada, mas em momento anterior ao uso da droga. 3. Adulteração Representada pela adição de produtos químicos à amostra coletada. Qualquer produto adicionado à amostra pode interferir na análise enzimática e/ou cromatográfica. Produtos de limpeza em geral degradam as drogas.

15 Seleção de Amostras Biológicas Cuidados Gerais 4. Seleção Adequada da Amostra Importante selecionar a amostra em função do local onde o analito poderá ser encontrado Amostras como sangue, urina, e tecidos são bastante usadas em análises toxicológicas. Atualmente, amostras alternativas estão sendo utilizadas em análises toxicológicas. Exemplos incluem a saliva, para análise de drogas no local de trabalho e em casos de suspeita de delitos ao volante; o cabelo, que pode ser usado para avaliar o histórico de uso de drogas.

16 Seleção de Amostras Biológicas Cuidados Gerais 5. Critérios de Conformidade da Amostra Todos os critérios de conformidade da amostra para exame devem ser satisfeitos de modo a garantir a autenticidade da amostra e dar maior probabilidade de detecção ao teste. Amostras coletadas sem supervisão, com indícios de adição de produtos químicos e que não foram aprovadas pelos testes de conformidade (ph, aspecto, densidade, creatinina, uréia, etc para urina, por exemplo) devem receber o laudo de NÃO CONFORMIDADE, independente da análise ter sido ou não realizada, ou de resultado positivo ou negativo. Informar no laudo o limite de detecção do método.

17 Amostras Biológicas Convencionais

18 Amostras Biológicas Convencionais Urina A coleta da urina requer cuidados em função do constrangimento que a coleta pode causar ao periciado. A privacidade requerida para a coleta da urina risco para garantia da autenticidade da amostra.

19 Amostras Biológicas Convencionais Critérios de Segurança Atenção no momento da coleta Coleta de Urina Avaliação da temperatura da amostra imediatamente após a coleta Obs.: esse critério pode ser falho. Análise de uréia e creatinina (SAMSHA Substance Abuse and Mental Health Administration) - Creatinina 5mg/mL - Densidade da urina entre 1001 d 1020 Importante: a adição de cloreto de sódio aumenta a densidade da amostra e pode interferir na triagem por ensaio enzimático.

20 Amostras Biológicas Convencionais Coleta de Urina

21 Amostras Biológicas Convencionais Diluição da Amostra Cuidados Gerais Adição intencional x ingestão de grandes quantidades de água O excesso de água provoca uma queda na concentração da urina e pode afetar a detecção na fase de triagem. Como contornar o problema da diluição? Avaliação da creatinina urinária e densidade. Valores (varia entre médios: - creatinina: mg/dl os autores) - densidade: (Fonte: Vigilância Toxicológica. Eliani Spinelli )

22 Amostras Biológicas Convencionais Cuidados Gerais Diluição da Amostra - continuação SAMSHA amostras diluídas - creatinina: < 20 mg/dl - densidade: < 1003 Em casos de não conformidade com os parâmetros estabelecidos, recomenda-se a coleta de uma segunda amostra para exame (se possível) (Fonte: Vigilância Toxicológica. Eliani Spinelli )

23 Amostras Biológicas Convencionais Adulterantes e Ensaios para Detecção dos Mesmos em Urina Table 1 Common Adulterants ADULTERANTS ASSAYS AFFECTED DETECTION MEANS Water (DILUTION) All Creatinine, Specific Gravity Ammonia All Odor, ph Bleach All, esp. THC Odor Glutaraldehyde (URINEAID) All, esp. THC Bizarre data Soap/Detergent All, esp. THC Bizarre data, foams, odor Nitrite (KLEAR) THC Specific Test Chromate (URINE LUCK) THC Specific Test Peroxidase (STEALTH) THC Test under consideration Comment: There are dipsticks available which allow for adulterant testing at the collection site. This has advantage of early detection of unstable adulterants like bleach and STEALTH which can degrade and are harder to detect in the lab. (Fonte:

24 Amostras Biológicas Convencionais Sangue Sangue e seus derivados são amostras de especial importância nas análises toxicológicas Dentre os derivados do sangue, o soro possui como vantagem o fato de que nenhum aditivo (anticoagulante) foi adicionado à amostra, mantendo sua composição inalterada. Em indivíduos vivos, os efeitos fisiológicos da maioria dos fármacos possuem correlação direta com suas concentrações sanguíneas. Atenção em sangue coletados post-mortem (Fonte: Toxicologia Analítica. Moreaau & Siqueira )

25 Amostras Biológicas Convencionais Sangue Post-Mortem A desigual distribuição de drogas nos tecidos leva a alterações na concentração sérica de drogas. após a morte. Isso é chamado de redistribuição post-mortem Ocorre principalmente por difusão da droga do sangue para sítios vizinhos, (tecidos e órgãos), como de conteúdo do estômago. Este processo é particularmente importante para fármacos com alta em liposolubilidade. O sangue coletado do fundo do coração e outros sítios torácica e abdominal deve ser evitado sempre que possível.

26 Amostras Biológicas Convencionais Sangue post-mortem - observações: - punção das veias subclávia (braço) e/ou femoral (perna) - cuidados com a viscosidade do sangue - cuidado com a descontaminação do local - atenção no transporte e manuseio lise das hemácias - uso de conservantes para preservar a amostra

27 Amostras Biológicas Convencionais A desigual distribuição de drogas nos tecidos leva a alterações na concentração sérica de drogas. após a morte. Isso é chamado de redistribuição post-mortem Exemplos de fármacos particularmente sujeitos à redistribuição post-mortem: amfetamines barbitúricos cocaína cloroquina digoxina fenotiazinas dextropropoxifeno propranolol metadona antidepressivos tricíclicos.

28 Amostras Biológicas Convencionais Coleta de sangue post-mortem

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30 Cabelo Um Breve Histórico Os primeiros trabalhos sobre a utilização de cabelo como amostra para exame toxicológico surgiram a partir de 1857 indivíduo morto há 11 anos, vítima de intoxicação por arsênico. Cerca de 100 mais tarde ocorreu a detecção do fenobarbital em pêlos de cobaia após exposição oral ao medicamento. Na década de 1960 e 1970, a análise do cabelo foi impulsionada pelo desenvolvimento da espectroscopia de absorção atômica (análise de metais pesados). (Fonte: Vigilância Toxicológica. Eliani Spinelli )

31 Um Breve Histórico 1979 Primeiro trabalho publicado sobre detecção de drogas em cabelo humano Técnica de radioimunoensaio para detecção de opiáceos em amostras de usuários de heroína Na década de 1980 o desenvolvimento da CG/EM permitiu um crescimento nas pesquisas de substâncias orgânicas em cabelos. Pesquisa envolvendo cocaína, canabinóides e anfetaminas (Fonte: Vigilância Toxicológica. Eliani Spinelli )

32 Vantagens da Técnica Maior janela de detecção (semanas ou meses), contra 2-4 dias para a maioria das drogas na urina e sangue. Para fins práticos, os dois testes se complementam. Urina e sangue: fornecem informações a curto prazo sobre o uso de drogas por parte de um indivíduo, enquanto histórias de longo prazo são acessíveis através da análise do cabelo. A análise do cabelo pode fazer a distinção entre o uso crônico ou única exposição à drogas.

33 Biologia do Cabelo Cabelo é um produto de órgãos diferenciados na pele dos mamíferos. Ela difere em indivíduos apenas em quantidade, cor e textura. O cabelo é basicamente proteínas (65-95%, basicamente de queratina), juntamente com a água (15-35%) e lipídios (1-9%). O conteúdo mineral do cabelo varia de 0,25% a 0,95%. O número total de folículos pilosos em adultos é estimada em cerca de 5 milhões, com um milhão encontrado na cabeça. Os folículos pilosos são implantados no epitélio da epiderme da pele, aproximadamente 3-4 mm abaixo da superfície da pele. (Fonte: Jickells, Clarke s Analytical Forensic Toxicology )

34 Secção longitudinal do folículo piloso (Fonte: Jickells, Clarke s Analytical Forensic Toxicology )

35 Crescimento capilar Cabelo não cresce continuamente, mas em ciclos, alternando períodos de crescimento e de quiescência. 1 - Fase anágena: o cabelo é produzido durante 4 a 8 anos (cabelos da cabeça) e 12 meses (cabelo não-cabeça) com uma taxa de aproximadamente mm / dia ou cem / mês para cabelos da cabeça (taxa de crescimento depende do tipo de cabelo e localização anatômica). 2 - Fase catágena: o folículo entra em um período de transição de cerca de duas semanas, durante o qual deixa de divisão celular e do folículo começa a degenerar.

36 Crescimento capilar 3 - Fase telógena: período de descanso ou repouso, de cerca de 10 semanas, durante o qual o eixo do cabelo pára de crescer completamente e crescimento do cabelo começa a desligar. No couro cabeludo de um adulto, aproximadamente 85% dos cabelos está na fase de crescimento e os restantes 15% estão em uma fase de descansando. (Fonte: Jickells, Clarke s Analytical Forensic Toxicology )

37 Fases do Crescimento Capilar

38 Mecanismos de Incorporação de Drogas em Cabelo Cabelo não cresce continuamente, mas em ciclos, alternando períodos de crescimento e de quiescência. As drogas podem ser incorporadas no cabelo através de 3 mecanismos: a partir do sangue, durante a formação do cabelo a partir de suor e sebo a partir do ambiente externo O cabelo é muito poroso e pode aumentar sua massa em até 18% a partir da absorção de líquidos. Assim, medicamentos podem ser transferidas facilmente para o cabelo através do suor.

39 Mecanismos de Incorporação de Drogas em Cabelo (Fonte: Jickells, Clarke s Analytical Forensic Toxicology )

40 Estabilidade de Drogas em Cabelo O mecanismo exato pelo qual os produtos químicos estão ligados no cabelo não é totalmente conhecido. 1 - Ligação à melanina 2 - Ligação de drogas com os grupos sulfidrilas dos aminoácidos presentes no cabelo. Estudos in vitro demonstraram que fármacos podem permanecer quimicamente estáveis por vários meses. A meia vida da cocaína no cabelo foi determinda em experimento e foi achado ser igual a 6 meses.

41 Procedimentos para Coleta de Amostras Procedimentos de coleta para a análise do cabelo para as drogas não foram padronizados. Na maioria dos estudos publicados, as amostras são obtidas a partir de locais aleatórios no couro cabeludo. O cabelo é melhor coletadas de área na parte de trás da cabeça, chamado de vértice posterior. vértice posterior da cabeça

42 Procedimentos para Coleta de Amostras Fios de cabelo são cortados o mais próximo possível do couro cabeludo, e sua localização no couro cabeludo é anotado. Depois de coletados, amostras de cabelo podem ser armazenadas à temperatura ambiente em papel de alumínio, um envelope ou um tubo de plástico. O tamanho da amostra varia consideravelmente entre os laboratórios e depende da droga para ser analisado e da metodologia de teste a ser aplicada. Exemplo: 100 mg de cabelo são recomendados para análise do fentanil ou buprenorfina.

43 Análise Toxicológica 1 - Processo inicial de descontaminação (lavagem) para a maioria dos métodos Soluções ácidas diluídas, soluções alcoólicas, detergentes ou mesmos solventes orgânicos Condições variáveis de tempo e temperatura 2 Pulverização da amostra e digestão química ácida química alcalina enzimática (Fonte: Vigilância Toxicológica. Eliani Spinelli )

44 Análise Toxicológica 3 Extração com solvente orgânico (ex: metanol) 4 Análise por CG/EM Imunoensaios podem ser utilizados 1- Análise dos resíduos de extração 2- Suspensão do resíduo com solução tampão Considerações importantes: - método deve ser sensível - detecção da forma inalterada (na urina, são os metabólitos)

45 Análise Toxicológica de Drogas em Cabelo (Fonte: Jickells, Clarke s Analytical Forensic Toxicology )

46 Saliva Definições A saliva é o produto da secreção das glândulas salivares presentes na boca. No entanto, os fluidos encontrados na cavidade oral são uma mistura de saliva, predominantemente, com pequenas quantidades de fluido gengival, restos celulares e de sangue. (Fonte: Jickells, Clarke s Analytical Forensic Toxicology )

47 Saliva Definições Em 1993, o encontro do New York Academy of Sciences definiu: - saliva: palavra por secreções glandulares coletados diretamente as glândulas salivares (geralmente as parótidas); - fluido oral: o fluido recolhido na cavidade bucal ou pela expectoração. (Fonte: Jickells, Clarke s Analytical Forensic Toxicology )

48 Um Breve Histórico A passagem de fármacos da corrente sanguínea para a saliva já havia sido sugerida desde a segunda metade da década de A utilização da matriz biológica só veio a aumentar significativamente na última década: - estudos farmacocinéticos - monitorização terapêutica - verificação do uso de substâncias ilícitas Importante na vigilância de motoristas sobre o uso de psicoativos (Fonte: Toxicologia Analítica. Moreaau & Siqueira )

49 Anatomia e Fisiologia da Saliva As glândulas salivares humanas produzem entre 0,5 e 1,5 L de saliva por dia. Durante o repouso, mais saliva misturada é fornecido pelas glândulas submandibular (70%), com uma menor quantidade das glândulas parótidas (25%) e o restante das glândulas sublinguais (5%) A saliva é composta por 99% de água, 0,3% de proteína (principalmente amilase) e 0,3% mucinas.

50 Anatomia das Glândulas Salivares

51 Vantagens e Desvantagens Vantagens: - facilidade de obtenção - coleta assistida (dificulta adulterações) - coleta sem constrangimentos - coleta não-invasiva - É possível traçar paralelos com a concentração sanguínea! Útil em estudos farmacocinéticos e análises forenses

52 Vantagens e Desvantagens Desvantagens: - detecção do fármaco livre no plasma curta janela de detecção! - amostras em pequenas quantidades - estados patológicos e emocionais podem inibir a secreção salivar, diminuindo ainda mais a disponibilidade do material - solubilidade adequada e forma não-ionizada no plasma.

53 Aspectos Farmacocinéticos A maioria dos xenobióticos chega à saliva por difusão simples através das membranas celulares que compõem os túbulos salivares. Para que os xenobióticos cheguem à saliva é necessário: - que estejam na forma livre - que estejam na forma não-ionizada - que possuam solubilidade adequada (Fonte: Toxicologia Analítica. Moreaau & Siqueira )

54 Aspectos Farmacocinéticos ph da saliva mais ácido que ph do sangue Acúmulo na saliva de bases fracas Compostos ionizados não retornam ao plasma

55 Coleta de Amostra A maior vantagem da saliva é a possibilidade de que a amostra pode ser coletada do doador em observação. A amostra pode ser coletada logo após o momento do incidente. Coleta não invasiva e pode ser feito pelos próprios doadores na maioria das situações. Uma série de dispositivos estão disponíveis para a coleta de saliva e de fluido oral.

56 Coleta de Amostra O coletor emprega um rolo de algodão dental (poliéster), que é mastigado pelo doador por segundos, com ou sem estimulação do ácido cítrico. Após ser embebido com fluido oral, o rolo de algodão é colocado em um recipiente que se encaixa em um tubo de centrífuga. O algodão absorve 1-1,5 ml de fluido oral.

57 Coleta de Amostra Dispositivos de coleta mais modernos geralmente usam um material absorvente em uma haste semelhante ao utilizado para testes de álcool na saliva. O dispositivo ao lado consiste em um bloco de papel de filtro impregnado com sais de tampão em uma haste de plástico. O bloco é colocado na boca por 2-5 minutos. Após a coleta, o papel é colocado em um tubo com líquido conservante e enviadas ao laboratório para análise. Absorção de cerca de 0,4 ml de fluido oral.

58 Coleta de Amostra O coletor Cozart Rapiscan usa uma almofada de algodão absorvente destacável em um indicador de punho. Depois que o indicador passou de branco para azul, que indica que 1 ml de saliva foram coletadas, a almofada pode ser destacada e mantida em um tubo de ensaio que contém conservante tampão até a análise.

59 Coleta de Amostra O coletor Finger (utiliza uma propriedade odontológico absorvente (espuma AccuSorb), que absorve a saliva, quando colocado na boca por alguns minutos. A saliva é extraída a partir da pressão do dedo sobre o material absorvente.

60 Coleta de Amostra O teste de saliva DrugWipe tenta limpar a língua com um pino de limpeza e transferir os fluidos orais recolhidos por lavá-lo em uma tira de teste. O DrugWipe testa substâncias como maconha, cocaína e crack, opiáceos como a heroína, morfina e metadona Todos os medicamentos da classe das anfetaminas e ecstasy, bem como os benzodiazepínicos.

61 DrugWipe

62 Testes de Confirmação Quando os imunoensaios são utilizados como testes de triagem para drogas na saliva, testes cromatográficos deve ser utilizada para confirmação. Eles devem ser capazes para detectar os níveis de drogas que aparecem na saliva. Métodos CG/EM foram relatadas para a confirmação de opiáceos, cocaína, canabinóides e benzodiazepínicos.