CARACTERIZAÇÃO DE CROMOSSOMOS DE TARTARUGAS DA ESPÉCIE PHRYNOPS GEOFFROANUS (TESTUDINES: PLEURODIRA)

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1 CARACTERIZAÇÃO DE CROMOSSOMOS DE TARTARUGAS DA ESPÉCIE PHRYNOPS GEOFFROANUS (TESTUDINES: PLEURODIRA) Ivan Botacini Zanon Rua Lourenço Manzano, 218 Neves Paulista - SP (17) ivanzanon@gmail.com Leonardo Francisco de Oliveira Rua Catanduva, 797 (17) leonardo.oliveira84@gmail.com Aguida Aparecida Gava Rua Alexandre Tambury, 390 (17) guidag@gmail.com Aledir Silveira Pereira IBILCE/UNESP Rua Cristóvão Colombo, 2265 (17) aledir@ibilce.unesp.br Abstract A system for preparing images for automatic chromosome karyotyping of turtles (specie Phrynops geoffroanus, family Chelidae, suborder Pleurodira, order Testudines) is proposed. It consists in the segmentation, identification and extraction of the chromosomes from the images obtained from a microscope. 1. Introdução A cariotipagem dos cromossomos de uma célula é um dos processos básicos para o estudo dos genes de qualquer espécie animal ou vegetal. Caracteriza-se pelo processo que visa analisar os pares de cromossomos existentes no núcleo das células e compará-los com determinados padrões, a fim de determinar sua normalidade. Alguns estudos em processamento de imagem já foram realizados, ou se encontram em andamento, para auxiliar o processo de cariotipagem de cromossomos humanos [1], uma vez que o processo, quando executado manualmente, exige tempo e é pouco produtivo. Porém, muito pouco foi desenvolvido para o estudo de outras espécies animais, já que cada espécie possui seu próprio padrão genético, variando, basicamente, em número de pares de cromossomos. Além disso, algumas espécies possuem formatos de cromossomos pouco distinguíveis a olho nu (geralmente muito pequenos), o que dificulta a identificação de certos pares durante o processo. Observando-se a não existência de qualquer trabalho que identifique cromossomos de diferentes espécies animais de maneira automática, é proposto o desenvolvimento de um sistema que automatize o processo de cariotipagem de cromossomos de tartarugas da espécie Phrynops geoffroanus, família Chelidae, subordem Pleurodira, ordem Testudines [2], a partir de imagens de lâminas (obtidas através de microscópio) contendo cromossomos de células cultivadas para estudo, baseando-se em certos padrões inerentes à espécie. O trabalho visa auxiliar os pesquisadores da área em suas pesquisas com esses animais e nos processos envolvidos nas mesmas. Como resultado, pretende-se minimizar o tempo dedicado à montagem de cariótipos e aumentar a precisão da comparação entre os cromossomos para melhor identificação dos pares. Este artigo trata, especificamente, do processo utilizado na segmentação, identificação e extração dos cromossomos das imagens, sendo esse o primeiro passo para a execução do trabalho proposto. 2. Metodologia Todos os testes, algoritmos e desenvolvimento do trabalho foram realizados em MATLAB 7, devido à facilidade na utilização e diversidade de recursos que tal ferramenta oferece. As etapas já desenvolvidas do trabalho consistem, basicamente, na segmentação das imagens, onde é realizada a identificação dos cromossomos e gerado o mapa de bordas da imagem, e na extração dos cromossomos

2 para que, em um próximo passo, seja montado o cariograma, ou seja, determinar os conjuntos de pares dos cromossomos Segmentação As etapas do processo de segmentação foram definidas através de uma série de testes realizados com diferentes métodos e combinações de técnicas para que se atingisse o resultado mais interessante, tanto em termos de generalização buscando atingir-se um bom resultado na maior quantidade possível de imagens quanto em termos de automatização, evitando-se ao máximo a intervenção do usuário no processo. Nessa proposta, dentre os algoritmos básicos atualmente utilizados para detecção de bordas, o que se apresentou mais promissor foi o de Canny [3]. Um dos principais problemas no processo de segmentação é o fato da maioria das imagens disponíveis para o estudo serem ruidosas, ou seja, não homogêneas. Existem diversas partículas que não podem ser consideradas como interessantes, geralmente resultadas da não diluição de algum material no momento da aplicação do contraste nas lâminas. Também existem materiais artefatuais, que não reagiram à solução, que também devem ser ignorados. Para a segmentação, inicialmente, utilizando a imagem convertida em tons de cinza (figura 1), foi realizada uma subtração do nível de cinza de cada pixel da imagem pelo valor de maior incidência na mesma (pico do histograma). Com essa operação, o histograma da imagem foi transferido para uma tonalidade mais escura (figura 2), sendo que os objetos de tom mais claro na imagem original acabaram por serem suprimidos (partículas de ruído), estabelecendo-se um fundo mais homogêneo, o que facilitou a detecção do limiar (threshold). Figura 1 Imagem convertida em tons de cinza Figura 2 Imagem após operação de subtração A partir da imagem obtida da operação de subtração, foi realizada uma suavização através do operador de média num raio de 1 (um) pixel de vizinhança. Logo após, o contraste da imagem foi melhorado através de uma função específica, otimizando a identificação dos objetos em relação ao fundo (figura 3). Em seguida, foi aplicado o detector de bordas segundo o algoritmo de Canny [3], baseando-se na limiarização (threshold). O threshold para utilização do detector de bordas foi obtido através de uma função que detecta o nível do mesmo através do método de Otsu [4]. Assim, obteve-se o mapa de bordas da imagem, onde são claramente identificados os cromossomos e os objetos artefatuais que serão ignorados (figura 4).

3 Figura 3 Imagem após operador de média e melhoria de contraste Figura 4 Mapa de bordas da imagem 2.2. Extração A etapa da extração foi realizada utilizando-se o mapa de bordas da imagem. Para isso, foi aplicada sobre o mapa de bordas uma função responsável por preencher os elementos que possuam as bordas totalmente fechadas. Entretanto, alguns mapas de bordas podem apresentar elementos que não sigam esse requisito, ou seja, alguns cromossomos possuem bordas falhas, não completamente fechadas, fazendo com que os mesmos não sejam considerados (figura 5). Para resolver este problema, foi desenvolvido um algoritmo que percorre o mapa de bordas e preenche os pontos falhos existentes, desde que o número de falhas não ultrapasse a marca de 2 (dois) pixels encadeados. Dessa forma, a função passou a preencher a maior parte dos elementos da imagem detectados no mapa de bordas (figura 6) e, a partir deste resultado, a extração dos elementos foi realizada. Para tal, foi desenvolvido um algoritmo onde os elementos preenchidos são identificados e seus correspondentes na imagem original são separados cada um em uma matriz diferente. Com a separação dos elementos em matrizes diferentes, foi feita uma seleção dos elementos consideráveis (cromossomos) daqueles que não são relevantes ao processo (ruídos, elementos artefatuais). Essa seleção foi realizada através da área dos elementos. Foi definido que elementos com área abaixo da média dos menores cromossomos obtidos na separação são considerados indesejáveis, por serem muito pequenos e não constituírem cromossomos. Figura 5 Elementos do mapa com bordas falhas após função de preenchimento Figura 6 Elementos do mapa após preenchimento das falhas e função de preenchimento Após a separação, foi realizada a rotação dos cromossomos, procurando deixar o maior número possível dos mesmos alinhados em 90º. A rotação é realizada por um algoritmo, que consiste em analisar em qual grau cada imagem possui a maior altura, sendo este o grau considerado para a rotação. No entanto, para alguns cromossomos menores este método gera um resultado inverso, pois a largura

4 dos cromossomos menores é maior que a altura, fazendo com que os mesmos fiquem alinhados em 180º. Porém, este aspecto será melhorado nas etapas futuras do trabalho proposto. 3. Resultados Após o processo de separação e rotação dos elementos, a próxima etapa corresponde à junção dos mesmos em uma única imagem. Tal junção foi realizada por ordem de tamanho, do maior para o menor, também através de um algoritmo desenvolvido. Figuras 7 e 8 Imagens Originais Figura 9 Elementos separados e ordenados da Figura 7 Figura 10 Elementos separados e ordenados da Figura 8 Ao todo, foram analisadas 10 imagens, onde a porcentagem de resultados obtidos com elementos relevantes encontrados (cromossomos), falsos-negativos e falsos-positivos é indicada através da tabela a seguir: Elementos % Cromossomos identificados 96,6 Falsos-Negativos 2,83 Falsos-Positivos 0,57 A partir de tais resultados, evidencia-se que no processo a grande maioria dos cromossomos são considerados, sendo extraídos da imagem original e ordenados para montagem da imagem final (figuras 9 e 10). Observa-se, portanto, que há um número muito pequeno de falsos- negativos dentro da amostragem utilizada na pesquisa, e praticamente nenhum falso-positivo. Isso demonstra como o método é promissor e como ele será útil para a continuidade do projeto. Novos métodos continuarão sendo testados, visando resultados ainda melhores. 4. Conclusão De acordo com os resultados obtidos, pode-se observar que o método proposto mostrou-se satisfatório no que se refere à identificação dos cromossomos nas imagens e na separação dos mesmos. Este último resultado, porém, ainda não corresponde ao cariograma propriamente dito. O processo de cariotipagem

5 em si será realizado em uma etapa futura deste projeto, envolvendo a ajuda de profissionais de biologia, pois a determinação dos pares de cromossomos depende de aspectos específicos de cada espécie e tais profissionais nos fornecerão respaldo para a continuidade do projeto. 5. Agradecimentos Agradecemos ao laboratório de Hemoglobinas, Genética e Doenças Hematológicas do Ibilce/ Unesp de, por terem nos disponibilizado as imagens para o desenvolvimento de nossa pesquisa. Referências [1] Pantaleão, C.H.Z., Contribuição à análise e classificação citogenética baseada no processamento digital de imagens e no enfoque lógico-combinatório. Universidade Federal de Santa Catarina. Florianópolis: Disponível em: (Acesso em 05/08/2006) [2] Bull J. J.; Legler J. M. (1980) Karyotypes of side-necked turtles (Testudines: Pleurodira). Can. J. Zool. 58: [3] Gonzalez, R.C; Woods, R.E Processamento de Imagens Digitais. Edgard Blücher Ltda: São Paulo, [4] N. Otsu, A Threshold Selection Method from Gray-Level Histograms, IEEE Transactions on Systems, Man, and Cybernetics, vol. 9, no. 1, pp , 1979.