# 11 informativo sbm ano 3 / 2010

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1 # 11 informativo sbm ano 3 / 2010 A revista do Microbiologista. ISSN EDIÇÃO ESPECIAL

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5 Editorial Prezado Microbiologista, Para nós da Comissão Organizadora é uma grande satisfação recebêlos em Florianópolis. Procuramos preparar uma programação que permita a revisão das principais rotinas em Microbiologia Clínica, assim como obter uma visão consistente das estratégias para enfrentar os desafios da detecção da resistência aos antimicrobianos e do diagnóstico microbiológico com impacto clínico relevante. Há várias perguntas que precisamos tentar responder ao longo desse evento. A tendência de centralização de laboratórios continuará? A automação plena, à semelhança do que assistimos em Bioquímica, Hematologia e Imunologia, chegará à Microbiologia? As técnicas moleculares já têm ou terão um impacto significativo no manejo clínico das infecções? Qual a norma para testes de sensibilidade mais compatível com as necessidades do Brasil? Os critérios interpretativos são compatíveis com as doses preconizadas nas bulas vigentes no Brasil? Em todas as discussões um dos pontos fundamentais deve ser a segurança dos pacientes. Lembrem-se que o conhecimento e a capacidade de raciocinar diante do novo e do inusitado nos torna melhores que qualquer sistema automatizado. Aproveitem essa chance ímpar de atualização, e interação científica, mas não se esqueçam de reservar um tempo para relaxar. Sejam bem-vindos! Jorge Luiz Mello Sampaio Coordenador Geral Índice Ciência in Foco análise MICROBIOLÓGICA DE ALIMENTOS: IMPORTÂNCIA DO PLANO DE AMOSTRAGEM um CENTRO DE REFERÊNCIA NA uerj(*) PREVENINDO DEMANDAS JUDICIAIS leptospirose: ATUALIZAÇÃO E PERSPECTIVAS selo DE QUALIDADE sbm In Foco Agenda In Foco ii simpósio internacional de microbiologia clínica carta de boas vindas Comissão científica Informaçõs gerais áreas Expediente SBM in Foco Revista da Sociedade Brasileira de Microbiologia Ano 3, nº 11 São Paulo: SBM, 2010 Periodicidade Trimestral Adalberto Pessoa Junior Presidente Editores: Carlos P. Taborda e Marina B. Martinez Tiragem: 2000 exemplares - Circulação Nacional Distribuição gratuita para sócios SBM Impressão: Copypress Tel.: (11) Marina B. Martinez Editora Carlos P. Taborda Editor Programação 2º simc Resumos índice de autores Diagramação: Hermano Serviços de Diagramação hermano@nextis.com Responsabilidade editorial: Todos os artigos assinados são de responsabilidade dos respectivos autores 5

6 Ciência in Foco análise MicroBiolÓgica de alimentos: importância do Plano de amostragem Bernadette D G M Franco Universidade de São Paulo - Faculdade de Ciências Farmacêuticas - Departamento de Alimentos e nutrição Experimental, Laboratório de Microbiologia de Alimentos Entre os vários parâmetros que indicam a qualidade e a inocuidade de alimentos, os mais importantes são aqueles que definem as suas características microbiológicas. É importante lembrar que alimentos crus, como carnes, leite, vegetais, pescados, e muitos outros, têm microrganismos chamados autóctones, ou seja, microrganismos naturalmente presentes, que fazem parte da microbiota natural destes produtos. Sua presença é, portanto, esperada. Entretanto, os alimentos podem ter microrganismos contaminantes que podem causar alterações indesejáveis, reduzindo sua vida útil, e podem ser patogênicos, comprometendo a saúde do consumidor. Para que se faz análise microbiológica de um alimento? Ela é necessária para a obtenção de informações sobre as condições de higiene durante sua produção, processamento, armazenamento e distribuição para o consumo, sobre sua vida de prateleira e sobre o risco que representa à saúde. Quando um alimento é suspeito de ter causado uma enfermidade de origem alimentar, a elucidação do agente etiológico reveste-se da maior importância, para que as medidas corretivas possam ser adotadas. Para que os resultados da análise microbiológica de um alimento reflitam de forma fiel as condições microbiológicas do alimento analisado, vários requisitos devem ser atendidos. Além do uso de métodos analíticos adequados, é necessário assegurar que as amostras analisadas representem o alimento como um todo. Nenhum desses requisitos é fácil de ser seguido, pois os microrganismos contaminantes nos alimentos podem ser inúmeros,não só em quantidade, mas também em variedade, requerendo métodos específicos de análise, e sua distribuição no alimento não é uniforme. Considerando que a análise microbiológica do produto todo ou de um lote inteiro de produtos é impraticável, por razões de custo e pelo caráter destrutivo deste tipo de análise, analisa-se amostras retiradas do alimento ou do lote. A determinação do número de amostras a serem analisadas e os critérios de decisão compõem o que se denomina um plano de amostragem. Os planos de amostragem são desenvolvidos com a finalidade de avaliar as condições microbiológicas de lotes e permitir um julgamento sobre a sua aceitação ou rejeição. Planos de amostragem foram inicialmente propostos pela Comissão Internacional de Especificações Microbiológicas para Alimentos (ICMSF International Commission on Microbiological Specifications for Foods) em 1974, e vêm sendo revistos desde então. O Codex Alimentarius, órgão internacional formado pela FAO (Food and Agricultural Organization) e pela OMS (Organização Mundial da Saúde), ambos da Organização das Nações Unidas (ONU), é atualmente o fórum de discussão destes assuntos. A Organização Mundial do Comércio, que normatiza a comercialização de alimentos entre diferentes países, recomenda a adoção de padrões, orientações e normas desenvolvidos pelo Codex Alimentarius. Segundo a ICMSF, os diferentes planos de amostragem podem pertencer a quinze categorias distintas, de acordo com o grau de risco que os microrganismos contaminantes nos alimentos oferecem ao consumidor. Este grau de 6

7 risco é determinado pelo tipo de microrganismo presente, pela sua quantidade no alimento e pela probabilidade de seu número aumentar, diminuir ou se manter estável no alimento até o momento de ser consumido (Tabela 1). Alguns microrganismos são importantes porque deterioram o produtos (categorias 1, 2 e 3), outros são indicadores da possível presença de microrganismos patogênicos (casos 4, 5 e 6), outros são patogênicos, mas causam doenças brandas e de difusão restrita (categorias 7, 8 e 9), outros são patogênicos mas causam doenças brandas mas difusão extensa (categorias 10, 11 e 12) e outros são patogênicos e causam doenças graves(categorias 13, 14 e 15). Em relação à análise microbiológica de alimentos, é necessário definir alguns conceitos importantes, como lote, n, c, m e M. Lote é o total de unidades de um produto produzido, manuseado ou armazenado em condições idênticas, dentro de um determinado período, n é o número de unidades retiradas de um lote que serão analisadas independentemente (unidades amostrais) e c é o número máximo aceitável de unidades do lote em que as contagens microbianas estão acima do limite mínimo (m) e abaixo do limite máximo tolerado (M) para o microrganismo investigado (unidades defeituosas). Os planos de amostragem podem ser de duas ou de três classes. Em um plano de duas classes, o produto analisado é classificado como aceitável ou inaceitável, ou seja, o resultado está abaixo ou acima de um critério pré-estabelecido, respectivamente. Já em um plano de três classes, o alimento analisado pode pertencer ainda a uma terceira categoria, denominada marginal, definida por resultado que se encontra entre os limites m e M (Fig 1e 2) A Tabela 2 apresenta os diferentes planos de amostragem de duas e de três classes. Os planos de amostragem para as categorias 1 a 9 são de três classes, enquanto para as categorias 10 a 15 são de duas classes. Conforme pode ser visto, à medida que o risco aumenta, aumenta também o rigor o plano de amostragem, com aumento de n e diminuição de c, sendo o mais tolerante n = 5 e c = 3 (categoria 1) e o mais rigoroso n = 60 e c = 0 (categoria 15). O poder discriminatório de um plano aumenta com o aumento de n para um mesmo valor de c. Para facilitar a compreensão da Tabela 2, cita-se o exemplo da pesquisa de Salmonella em uma lingüiça crua. Se o produto será congelado, portanto o risco tende a diminuir, o plano de amostragem do produto congelado é da categoria 10, ou seja, devem ser analisadas 5 amostras do mesmo lote (n = 5), e nenhuma pode ser positiva para este patógeno (c = 0). Se a linguiça for mantida em refrigeração, sendo pouco provável que o patógeno se multiplique, deve-se aplicar o plano da categoria 11, Tabela 1: Categorias ICMSF dos planos de amostragem de acordo com o risco à saúde* Variação do risco de acordo com as condições de uso Reduz Mantém Aumenta Risco baixo (ex: Enterobacteriaceae) Categoria 4 Categoria 5 Categoria 6 Risco moderado e difusão restrita (ex: S. aureus, B. cereus, C. perfringens) Categoria 7 Categoria 8 Categoria 9 Risco moderado e difusão extensa (ex: Salmonella, Shigella, Vibrio ) Categoria 10 Categoria 11 Categoria 12 Risco elevado (ex: C. botulinum) Categoria 13 Categoria 14 Categoria 15 As categorias 1, 2 e 3 referem-se a planos de amostragem para análise de microrganismos não patogênicos *ICMSF, 2002 Tabela 2: Planos de amostragem de 2 e 3 classes, de acordo com a categoria do plano* Sem risco Categoria 1 3 classes n= 5 c = 3 Risco baixo Categoria 4 3 classes n= 5 c = 3 Risco moderado e difusão restrita Categoria 7 3 classes n= 5 c = 2 Risco moderado e difusão extensa Categoria 10 2 classes n= 5 c = 0 Risco elevado Categoria 13 2 classes n= 15 c = 0 *ICMSF, 2002 Categoria 2 3 classes n= 5 c = 2 Categoria 5 3 classes n= 5 c = 2 Categoria 8 3 classes n= 5 c = 1 Categoria 11 2 classes n= 10 c = 0 Categoria 14 2 classes n= 20 c = 0 Categoria 3 3 classes n= 5 c = 1 Categoria 6 3 classes n= 5 c = 1 Categoria 9 3 classes n= 10 c = 1 Categoria 12 2 classes n= 20 c = 0 Categoria 15 2 classes n= 60 c = 0 Figura 1: Classificação do alimento de acordo com os critérios m e M 7

8 Tabela 3: Probabilidades de aceitação de lotes contendo diferentes proporções de unidades aceitáveis e defeituosas, de acordo com Composição do lote Aceitável Defeituoso % % valores de n (plano de duas classes)* Número de unidades amostrais (n) < < < < < <: significa que p < 0,005 *ICMSF, 2002 Tabela 4: Probabilidades de aceitação de lotes contendo diferentes proporções de unidades aceitáveis e defeituosas, de acordo com valores de n e c (plano de duas classes)* Composição do lote n = 5 n = 15 Aceitável % Defeituoso % Figura 2: Planos de duas e de três classes, segundo ICMSF, 2002 ou seja, n = 10, c = 0 e se o produto for mantido em temperatura ambiente, com alta probabilidade de multiplicação de c = 3 c = 2 c = 1 c = 4 c = 2 c = < < <: significa que p < 0,005 *ICMSF, 2002 Samonella, deve-se aplicar a categoria 12, ou seja, n = 20 e c = 0. Considerando que as decisões de aprovar ou rejeitar um lote são baseadas nos resultados das unidades retiradas deste lote, deve-se levar em conta que este resultados não necessariamente indicam a situação exata do lote. Existe sempre a possibilidade de rejeitar um lote que esteja satisfatório, assim como aprovar um lote insatisfatório. No primeiro caso, há um risco para o produtor e no segundo, um risco para o consumidor. Na tabela 3, são apresentadas as probabilidades de aprovar um lote de acordo com o número de unidades amostrais analisadas (n) e a porcentagem de defeituosos neste lote, quando um plano de duas classes é utilizado. Por exemplo, admitindo-se que um lote que tenha 20% de defeituosos, ao analisar 5 amostras (n = 5) a probabilidade de aceitação do lote é 33%. Se forem analisadas 20 amostras, essa probabilidade cai para 0,1%. Para um lote com 2% de defeituosos, ao analisar 5 amostras existe 90% de probabilidade de se aprovar este lote e aumentando o n para 20, esta probabilidade será 67%. Na tabela 4, são apresentadas as probabilidades de aprovar um lote de acordo com o número de unidades amostrais analisadas (n), o número de unidades defeituosas toleradas (c) e a porcentagem de defeituosos neste lote, quando um plano de duas classes é utilizado. Por exemplo, admitindo-se que um lote que tenha 20% de defeituosos, ao analisar 5 amostras (n = 5) e tolerar 3 amostras defeituosas (c = 3) a probabilidade de aceitação do lote é 99%, mas se c for 2 essa probabilidade baixa para 94% e se for c = 1, baixa para 74%. Aumentando-se n para 15, as probabilidades de aprovar o lote serão 84% se c for 4, 40% se c for 2 e 17% de c for 1. Na legislação brasileira sobre requisitos microbiológicos em alimentos, verifica-se que tanto a Portaria n o 146, 1996, do Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento, quanto a Resolução RDC-12, 2001, da Agencia Nacional de Vigilância Sanitária do Ministério da Saúde determinam os valores de n, c, m e M nos critérios microbiológicos para aprovação de alimentos disponibilizados para a população, adotando n = 5 para todos os planos de amostragem, e valores de c, m e M que variam de acordo com o alimento e o microrganismo considerado. 8

9 Bibliografia Brasil. Agência Nacional de Vigilância Sanitária. Resolução da Diretoria Colegiada RDC- 12, Disponível em gov.br/legis/resol/12_01rdc.htm. Brasil. Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento. Portaria n o 146, Disponível em br/sislegis-consulta/consultarlegislacao. do?operacao=visualizar&id=1218 Franco, B.D.G.M., Landgraf, M. Microbiologia dos Alimentos, Editora Atheneu, 6ª reimpressão, International Commission on Microbiological Specifications for Foods (ICMSF). Microorganisms in Foods 2: Sampling for Microbiological Analysis: Principles and Specific Applications. 2nd ed., University of Toronto Press, International Commission on Microbiological Specifications for Foods (ICMSF). Microorganisms in Foods 7. Microbiological testing in food safety management. Kluwer Academic/ Plenum Publishers, Montville, T.J., Matthews, K.R. Food Microbiology. An introduction. 2 nd ASM Press

10 Ciência in Foco um centro de referência na uerj (*) PreVenindo demandas JudiciaiS Luiz Carlos D. Formiga Professor Associado. Aposentado. Bacharel em Direito. Faculdade de Ciências Médicas - UERJ RESuMO Erros cometidos no laboratório de diagnóstico bacteriológico podem dar origem a ações judiciais. Discutimos a importância da prudência, da diligência e da perícia na prevenção dessas demandas. Como modelo, utilizamos o diagnóstico da difteria, discutimos as possibilidades do erro nas suas fases examinando a necessidade da identificação microbiana, além do gênero. Analisamos os resultados práticos publicados em revistas especializadas, no Brasil e no exterior, pelo Centro de Referência Nacional do Ministério da Saúde, instalado na década de 1980, na Faculdade de Ciências Médicas da Universidade do Estado do Rio de Janeiro. Desta forma, encontramos as orientações para maior precisão no diagnóstico desta doença. Essas orientações dirigidas aos Laboratórios de Saúde Pública atingiam de forma tangencial o aspecto social e legal. Pudemos anotar os entraves e os problemas ligados a prevenção de surtos epidêmicos e também as soluções apontadas para capacitar e apurar a perícia dos profissionais envolvidos nesta prática biomédica, onde a imprudência, negligência e a imperícia devem ser extirpadas. (*) Palavras chave: Microbiologia Médica, Bioética, Biodireito 1. INTRODuÇÃO A. Apresentação do tema Há uma crescente preocupação internacional na identificação de princípios universais, tendo como base valores éticos compartilhados. Essa inquietação nos pede para identificar os desafios que vem surgindo com a ciência e a tecnologia e a pensar na responsabilidade com as futuras gerações. Por outro lado, desafios antigos aparentemente afastados insistem em retornar. Questões da Bioética, que eventualmente apresentam dimensão internacional, precisam ser examinadas considerando princípios estabelecidos nos tratados e convenções, uma vez que podem apresentar impacto sobre comunidades (12, 17). Tanto no campo biomédico, quanto no bioético importa não esquecer que o indivíduo inclui em sua natureza dimensões diversas, tais como as biológicas, psicológicas, sociais, culturais e espirituais. Essas dimensões nos fazem crer que a sensibilidade moral e a reflexão ética são partes do processo de desenvolvimento científico e tecnológico, onde a Bioética e o Biodireito (3, 23) desempenham papéis importantes. Todo ser humano deve se beneficiar dos padrões éticos de maior nível nas ciências biomédicas (3) Este estudo trata da prudência, da diligência e da perícia no laboratório de Bacteriologia Clínica que por sua especialidade, manipula materiais patológicos colhidos de seres humanos e portan- 10

11 to, deve também considerar a dimensão social e a legal. Dirigido aos Laboratórios Centrais de Saúde Pública e aos laboratórios de instituições públicas e privadas que desenvolvem atividades de bacteriologia clínica, procura valorizar e promover o respeito pela dignidade da pessoa humana representada por materiais que foram colhidos da intimidade de seus corpos, de modo a assegurar o respeito pela vida. Este artigo procura incentivar o diálogo multidisciplinar entre os que acreditam que o estar doente representa uma cidadania mais onerosa, com destaque para o emocional. Aponta para a dimensão biológica sem esquecer o aspecto biográfico do paciente. Enfatiza alguns princípios, entre outros, por causa de sua imediata relevância. Assim, a dignidade humana e os direitos humanos foram privilegiados, pois devem ser respeitados pelos que estão envolvidos nesta prática laboratorial. Fazendo surgir a reflexão entre o benefício, que deverá ser maximizado e o dano a ser minimizado. Considerando a onerosidade do paciente, chama a atenção para o respeito pela vulnerabilidade aumentada de determinados grupos humanos, eventualmente representados, nas doenças infecciosas, pelas populações mais carentes da comunidade. Os Laboratórios de Saúde Pública são representantes dos serviços públicos junto à população geral e devem ter em mente a promoção da saúde e o desenvolvimento social que são os objetivos centrais dos governos. Precisamos considerar que um dos direitos fundamentais do ser humano é o de usufruir o mais alto padrão de saúde. Só aparentemente o laboratório de bacteriologia médica apresenta papel secundário, pois existem outras situações onde pode desempenhar papel de relevância, o que adiante discutiremos. A conduta técnica do laboratório ganha maior destaque quando a clínica se encontra em dúvida, tendo que decidir pela aplicação da terapêutica específica, o que pode desencadear efeitos secundários, como o choque anafilático. A Difteria e a potente virulência de seu agente etiológico - Corynebacterium diphtheriae, está minuciosamente descrita (11, 13, 14, 19, 20, 21, 22). O bacilo diftérico pode causar infecção em vários órgãos e tecidos, mas a forma clínica mais freqüente e mais grave é a faríngea, denominada angina diftérica. As manifestações são principalmente devidas a uma potente exotoxina. Amostras não produtoras de toxina também podem causar o processo infeccioso. Assim, outros fatores, distintos da toxina, devem ser considerados. O diagnóstico laboratorial é feito com material retirado das lesões existentes, exsudatos de orofaringe e de nasofaringe, que são localizações mais comuns, ou de outras, conforme o caso, por meio de swab, antes da administração de qualquer terapêutica antimicrobiana. A bacterioscopia tem apenas valor presuntivo. A cultura deve ser feita por semeadura da secreção nos meios específicos. As colônias isoladas e suspeitas irão para teste de triagem, produção de porfirina e toxina. Amostras não produtoras de toxina, porém fluorescentes, necessitam estudo adicional, pois podem ser bacilos diftéricos atoxinogênicos, rotulados como avirulentos porque produzem manifestações clínicas discretas e localizadas, embora em algumas ocasiões produzam doença grave. O erro técnico pode ocorrer em diversas fases da evolução clínica da doença. B. Justificativa e objetivo do estudo. O erro biomédico laboratorial pode casar confusão no momento da escolha do tratamento, o que pode ter funestas conseqüências em relação à saúde do paciente. Embora já se tenha dito que o Brasil não está longe de atingir a perfeição no tratamento de saúde, a realidade é que hoje o nosso sistema de serviços públicos está em fase de declínio. Nossa Rede de Laboratórios de Saúde Pública apresenta carências e diferentes realidades. As condições de trabalho encontradas em vários laboratórios podem ser inadequadas. Em se tratando da Microbiologia Clínica o erro técnico também pode ocorrer pela ausência de especificação ou pela desvalorização do achado laboratorial. Todo cidadão tem responsabilidades para que seu tratamento aconteça de forma adequada. O laboratório, muitas vezes, é veículo imprescindível para alcançar esse objetivo. Com a ajuda de um destacado caso clínico ocorrido em 2001 (18) vamos iniciar a discussão sobre a responsabilidade civil do profissional de laboratório. Estamos diante de um diagnóstico, onde o bacilo diftérico pode ser confundido com outros micro-organismos (12, 17), situação que, por imprudência, imperícia ou negligência, pode conduzir o profissional ao erro técnico. Alertá-lo em relação a eventuais demandas judiciais é tarefa de relevância e certamente estaremos contribuindo para incentivar o estudo continuado. Nosso objetivo é analisar a necessidade de especificação bacteriana para o adequado tratamento e evitar aborrecimentos judiciais. Almejamos introduzir a discussão sobre o erro laboratorial e a Responsabilidade Civil no diagnóstico bacteriológico na Microbiologia Médica (4). C. Hipótese e questão problema. O Centro de Referência Nacional produziu eficaz, eficiente e efetiva orientação para o diagnóstico laboratorial da difteria (6, 7, 8). Isto parece relevante e também fundamental na prevenção do erro do profissional e das demandas judiciais. A orientação oferecida pelo Centro de Referência de Difteria do Ministério da Saúde se cumprida com prudência, diligência e perícia será capaz de mitigar o erro laboratorial e prevenir essas demandas? A imprudência, a negligência e a imperícia podem conduzir ao erro no diagnóstico laboratorial microbiológico. Quais as implicações em termos de Responsabilidade Civil deste profissional de saúde? D. Referencial teórico Apesar do amplo conhecimento sobre a etiopatogenia, aspectos clínicos, terapêutica, e profilaxia da difteria, a doença pode ser ameaça nos locais de vacinação deficiente; de controle inadequado dos contatos e quando do retardo do diagnóstico-tratamento. A letalidade diminui na vigência do diagnóstico precoce e instalação rápida da terapêutica específica. No diagnóstico laboratorial, a bacterioscopia possui valor presuntivo. A cultura deve ser feita em meios específicos. As colônias suspeitas deverão 11

12 ser submetidas a vários testes. Nestas fases podemos encontrar o erro laboratorial (5,9). As infecções subclínicas e o estado de portador são importantes, uma vez que concorrem para a circulação do bacilo na comunidade. A pele pode ser um reservatório de potencial importância na manutenção da circulação do C. diphtheriae, uma vez que ele pode ser isolado de vários tipos de lesões cutâneas, que são mais contagiosas do que as do trato respiratório. No momento do exame dos contatos, o laboratório fica exposto ao erro. A microbiota de associação é muito numerosa e sempre rica de bastonetes Grampositivos, que se assemelham ao agente etiológico. Nessa hora o profissional do laboratório é muito solicitado e necessita de cuidado redobrado para que não desvalorize o achado microbiológico, contribuindo de forma negativa na epidemiologia e letalidade da doença. Através da leitura das orientações do Centro de Referência procuramos as características de eficácia. Eficiência e efetividade, uma vez que a Constituição da República Federativa do Brasil de 1988 traz a saúde como direito social em mais de 20 dos seus dispositivos, sendo ela um direito subjetivo exigível do Estado que tem o dever de assegurá-lo (2). Para apurar a responsabilidade do Poder público precisamos atentar para os conceitos de saúde, vida e dignidade da pessoa humana, considerada como um ser multifacetado. O direito à saúde é uma das formas de garantia do direito à vida, cláusula pétrea, art. 5º da CRFB/88 (2). Diante da prestação do serviço de saúde devemos interpretar a norma constitucional com o sentido que maior eficácia lhe conceda, com o objetivo de preservar a vida e a dignidade da pessoa. Há uma relação entre os conceitos de direito à vida e dignidade da pessoa humana com os serviços de saúde. Qualquer atitude que se origine do Poder Público em detrimento do direito à vida pode ser catalogada como um desrespeito à dignidade do paciente. A garantia ao direito à vida pode necessitar de exames laboratoriais complementares adequados. Os dispositivos constitucionais apontam para uma ampla cobertura em matéria de saúde. Podemos considerar que qualquer omissão do Estado na garantia a esse direito, sendo comprovado o nexo de causalidade, permitirá a propositura de medidas judiciais. A responsabilidade civil do Estado é de natureza objetiva (art. 37, 6o, da CRFB/88). Assim, demonstrado o nexo causal deve o Estado responder pelos danos que seus agentes causarem a terceiros, no âmbito de seus hospitais, independente da prova de dolo ou culpa. O hospital ao fornecer serviços de saúde médico-hospitalares está sujeito às normas do Código de Proteção e Defesa do Consumidor (Lei 8078/90). A relação jurídica estabelecida com os seus pacientes é contratual, legítima relação de consumo, com as conseqüências legais que daí decorrem. As atividades complementares, ao atendimento do paciente, também ficam protegidas pelo manto deste contrato. Entre elas estão algumas como o serviço de controle de infecção hospitalar, de enfermagem, de limpeza e serviços complementares, de diagnóstico (laboratório de Bacteriologia Clínica e outros). Vamos recordar que a obrigação incluída neste contrato do hospital é de meios e não de resultados (4). No entanto, a assistência médica deve ser a mais adequada possível, devendo dispor de pessoal competente, nos procedimentos oferecidos aos seus pacientes nos atendimentos, uma vez que no contrato está implícita a cláusula de incolumidade, que tem característica de uma obrigação de resultados. Vamos lembrar que a administração pública direta e indireta de qualquer dos poderes da União, dos Estados, do Distrito Federal e dos Municípios, obedecerá a diversos princípios. Principio da legalidade, impessoalidade, moralidade, publicidade descritos no Art 37 da CRFB (2) e de onde, diante dos nossos propósitos, destacamos os princípios da eficiência e especialidade. A lei 9784, de 29 de janeiro de 1999, que regula o processo administrativo, no âmbito da Administração Pública Federal, nos relembra o princípio da eficiência e enfatiza o do interesse público, que deve ser obedecido pela Administração Pública. 2. Metodologia e desenvolvimento do estudo Os dados foram colhidos do Manual Técnico do Centro de Referência Nacional, do Ministério da Saúde, publicado na Revista Brasileira de Patologia Clínica (6,7,8), elaborado para a identificação de micro-organismos corineformes; dos exames laboratoriais realizados neste Centro e, ainda, dos relatos de investigações realizadas no âmbito do seu Laboratório de Pesquisas. Estes resultados estão divulgados em revistas técnicas de circulação nacional e internacional, encontradas na lista das referências bibliográficas. Para analise e avaliação, consideramos o diagnóstico laboratorial de certeza (21). O Serviço de Microbiologia e Imunologia, FCM-UERJ, foi convocado pelo Ministério da Saúde para implantar o Centro de Referência Nacional na década de Logo em seguida o Ministério deu inicio ao Programa Nacional de Vacinação da População Infantil. Essa iniciativa reduziu gradativamente o número de casos de difteria. Registra-se nos anos 90 menos de 10% do número de casos que foram registrados na década anterior. Nesta época, em 11 de setembro, surgiu a Lei de Proteção e Defesa do Consumidor. Foi no ano de 1986 que surgiu a orientação do Centro de Referência no Manual Técnico, publicado em três números sucessivos da Revista Brasileira de Patologia Clínica (6,7,8), hoje, Jornal Brasileiro de Patologia e Medicina Laboratorial. Podemos encontrar algumas comunicações apresentadas em congressos, sendo algumas no exterior. Da análise desses artigos, percebemos modificações em relação ao que era padronizado nos livros técnicos. Essas mudanças provenientes dos trabalhos realizados pelo Centro de Referência introduzem técnicas para facilitar a realização dos exames. Destinam-se principalmente aos que estão localizados nos países emergentes, onde as práticas laboratoriais são frequentemente realizadas em condições menos favoráveis, quando são comparadas com aquelas encontradas em países já desenvolvidos. 12

13 Na Constituição brasileira (Art 196), a saúde é dever do Estado, que deve garantí-la mediante políticas sociais e econômicas, que visem à redução do risco de doença e outros agravos (2). Desta forma, se torna explícita a sua multicausalidade e ainda se coloca de forma clara a determinação social, econômica e política do processo saúde-doença. A difteria, embora seja doença bem estudada, ainda pode ameaçar a população brasileira. Há perigo se a cobertura vacinal não atingir níveis satisfatórios. Soma-se a isso a desinformação das equipes médicas em relação a sua incidência, o que pode dificultar o diagnóstico clínico precoce e retardar a soroterapia. Apesar de preconizada pelo Ministério da Saúde, a vacina para adultos parece não ser suficientemente conhecida entre nós, o que não acarretou conseqüências mais sérias. No entanto, um número alarmante de casos de difteria foi descrito na Rússia e em outros países, atingindo inclusive profissionais de saúde (18, 21). A prevenção de doenças como a difteria é fruto de desenvolvimento tecnológico amplamente conhecido e acessível, apesar disso o controle ou a erradicação desta antiga doença transmissível não é ainda observado em inúmeros países como a Nigéria e o Paquistão. No setor é preocupante encontrar profissionais desinformados uma vez que saúde também é informação, elemento fundamental no processo de educação. Deve-se recomendar uma maior atenção em relação à imunização, avaliandose melhor a qualidade das reciclagens e treinamentos que são realizados, além de melhor supervisão, assegurando o cumprimento das normas existentes. Os serviços de saúde nos países em desenvolvimento podem não estar adequadamente vinculados às mães para poder administrar às crianças a vacina de que necessitam na idade apropriada; as necessidades técnicas de um Programa Nacional de Vacinação exigem conhecimentos no planejamento, na administração e uma supervisão prática dos serviços. A colaboração de uma população bem informada, a obtenção de fundos e o fortalecimento efetivo dos serviços básicos de saúde são objetivos a serem alcançados. O laboratório enfrenta diversos desafios. Por exemplo, uma parte das amostras da bactéria que causa a difteria no Brasil é bioquimicamente diferente daquelas que são encontradas nos países desenvolvidos. Entre nós, o C. diphtheriae é fermentador de sacarose, em contraste com os isolados em outros países. A capacidade de fermentar o açúcar pode causar confusão e induzir laboratórios desprevenidos a oferecer resultado genérico. Isso seria suficiente para nos alertar para a necessidade da perícia na prática laboratorial médica. Uma outra observação reforça esta necessidade. Trata-se do processo infeccioso causado pelo bacilo que perdeu a capacidade de produzir toxina. Casos de endocardites com bacilos não produtores de toxina foram descritos em diversos países no mundo, sendo isolados em hemoculturas. Nesses casos é possível que o agente etiológico possa ser identificado como difteróide, considerado mero contaminante. O Centro de Referência chama a atenção para essas amostras que não produzem toxina, mas que produzem a porfirina fluorescente. Ausência de produção de toxina não significa ausência de patogenicidade. Por outro lado, num caso de endocardite produzida por micro-organismo produtor de toxina não foram observados quaisquer sinais de toxemia (12). Voltando aos micro-organismos não produtores de toxina, podemos inferir que esses casos clínicos sem a presença de toxemia apontam para outros mecanismos de virulência existente nessas amostras, que circulam principalmente em países onde a imunização possui níveis adequados (12,14,19,20). A circulação de um micro - organismo não produtor de toxina não estimulará o sistema imune da população geral, não haverá a manutenção de níveis de anticorpos antitóxicos circulantes suficientes para deter, ou mitigar um processo de infecção mais adiante, na idade adulta. A ausência de vacinação específica de 10 em 10 anos poderá dar origem a indivíduos susceptíveis de idade mais avançada e favorecer o surgimento de casos entre pessoas mais idosas, como ocorreu na Europa na década de 90. A vacina é potente meio utilizado na erradicação da doença, mas o bacilo parece irredutível no seu objetivo de continuar circulando na população geral, concentrando-se em um segmento social, onde determinadas condições parecem estar satisfeitas. Pesquisa realizada no município do Rio de Janeiro revelou que o número de portadores de bacilo diftérico é cinco vezes mais alto em algumas regiões do subúrbio carioca do que na sua Zona Sul. A desnutrição, hábitos higiênicos inadequados e lesões cutâneas ocasionadas por mordidas de insetos ou por seringas são alguns dos fatores que facilitam a aderência e a infecção pelo microorganismo. Este estudo observou diferenças entre o número de portadores, do C. diphtheriae toxinogênico e atoxinogênico, entre escolares do município com relação a localização das escolas. Demonstrou que a população escolar da zona oeste apresentou índices bem mais elevados comparados com os da zona sul, onde o nível sócio-econômico é mais elevado (13). Esse trabalho apresentou uma das maiores casuísticas do mundo sendo examinados 1007 escolares no Centro de Referência. Já foi enfatizada a dificuldade encontrada por causa da semelhança entre o bacilo patogênico e outras espécies encontradas na microbiota humana. Vamos recordar dois problemas: (1) cepas com capacidade de fermentar sacarose (Brasil), que o assemelha à corineformes isolados de diversos nichos ecológicos humanos; (2) a grande freqüência de amostras não produtoras de toxina, principalmente isoladas de portadores no trato respiratório e nas lesões cutâneas. Anotemos também que o micróbio já foi isolado no Centro de Referência a partir de material proveniente de úlceras leishmanióticas e até mesmo do líquido espermático, onde poderia ser confundido com um difteróide (contaminante). Por esse motivo os micro-organismos que são bastonetes Gram-positivos produtores de porfirinas fluorescentes, no meio B de King, sob luz U.V. (365 nm) e fermentadores de maltose, são considerados como bacilo diftérico, até prova contrária. 13

14 Estivemos desenvolvendo este raciocínio objetivando o diagnóstico da doença clássica, a faringite diftérica, que é causada pela espécie tipo do gênero. Sob o ponto de vista clínico, a negligência dos difteróides pode nos conduzir a resultados desastrosos. No laboratório também não é diferente onde temos outro elemento complicador, uma vez que outros corineformes podem estar envolvidos em diversos quadros clínicos, que precisam ser valorizados. Isso aponta novamente na direção da prudência, da diligência e da perícia como prevenção de problemas diante dos tribunais. Podemos citar algumas doenças onde são descritos estes agentes etiológicos semelhantes ao bacilo diftérico e que apresentam alta taxa de resistência aos antibióticos: infecções do trato urinário, bacteremia ou endocardite. Outras infecções sistêmicas, como pneumonia ou peritonite; infecções em feridas cirúrgicas, artrite séptica e osteomielite vertebral; abscesso mamário, uretrite não gonocócica, epididimite, linfadenite granulomatosa, meningite em neonatos, peritonite em pacientes submetidos a diálise peritoneal e infecções endoftálmicas. Diante desses quadros infecciosos parece justificado o interesse de um Centro de Referencia com a educação continuada e ainda com as contribuições da Bioética e do Biodireito (3, 4, 23). O que significa o rótulo difteróides? A prática laboratorial permite afirmar que são bactérias oportunistas potencialmente patogênicas pertencentes à própria microbiota humana normal. Dados acumulados indicam a relevância de se identificar o gênero e eventualmente as espécies. O reconhecimento dessas infecções pode depender da perícia que possuem os laboratórios na sua capacidade de proceder a especificação. Um dos obstáculos encontrados é que mais de 40% das amostras dos bastonetes Gram-positivos pleomórficos não pertencem ao gênero Corynebacterium. Voltemos ao ponto central, o diagnóstico laboratorial da difteria. O isolamento em cultura pura necessita de pelo menos três meios de cultivo diferentes na garantia de um resultado satisfatório (95%). Esta prática mais onerosa é um desestímulo aos laboratórios que carecem de recursos porque todos os meios de cultura possuem prazo de validade e decresce o número de casos diante das medidas preventivas. No entanto, na vigência de um surto epidêmico essas práticas são absolutamente necessárias. Uma técnica desenvolvida também na FCM-UERJ para a pesquisa de toxina in vitro, comparada com a que explora o efeito citopatogênico da toxina em culturas de células, também foi apresentada no exterior (15,16). Devemos ainda admitir a possibilidade da doença em uma criança ou adulto vacinado. Apesar de se tratar de uma linha de pesquisa tradicional, só recentemente descrevemos um caso de isolamento de adulto vacinado. Neste caso, o diagnóstico laboratorial mostrou-se fundamental, uma vez que somente após a identificação bacteriana o tratamento específico foi iniciado, com boa resposta clínica (18). Em difteria a clínica é soberana, mas esse dado reforçou nosso entendimento de que devemos perseguir de forma rápida o diagnóstico de certeza. Sob o ponto de vista bioético este relato reforça a idéia de que a medicina é uma profissão moral. O médico interfere no campo do sujeito, no seu corpo, em sua vida pessoal, nas suas emoções e na sua economia. Em um Centro de Referência não podemos pensar diferente, pois há sempre um paciente, um aluno, uma pessoa representada naquele exame ou aula. A responsabilidade do docente pesquisador, em uma Faculdade de Medicina, não está apenas na pesquisa de ponta. A Lei de Defesa do Consumidor vem sendo invocada para dar suporte às pretensões indenizatórias de pacientes que buscam socorro nas barras dos tribunais: o fornecedor de serviços responde, independentemente da existência de culpa, pela reparação dos danos causados aos consumidores por defeitos relativos à prestação de serviços. Daquele diploma legal, podemos destacar este início do artigo 14 (Lei nº 8078, de 11 de setembro de 1990). No caso acima, por se tratar de um adulto vacinado, o tratamento especifico foi retardado pela dúvida no diagnóstico clínico. Após ampla vacinação e erradicação dos países desenvolvidos, a difteria praticamente desapareceu das cogitações da maioria dos pesquisadores no mundo. Apesar de bem estudada, surgiu entre nós observação de certa relevância que é a descrição de uma transialidase no C. diphtheriae. Esta enzima é importante na interação bactéria-hospedeiro. Não menos importante é o inesperado encontro da capacidade invasora em um micro-organismo patogênico de baixo poder invasor (14). Caiu vertiginosamente o número de notificações no Brasil, estando longe das cifras encontradas nas décadas anteriores. Hoje não são descritos surtos nas diversas regiões do território nacional. No entanto, na prática laboratorial devemos relembrar que o bacilo já foi encontrado em sítios incomuns como ouvidos, conjuntiva e vagina e que a colonização de pacientes adultos vem despertando grande interesse. Em nosso laboratório, já foi também isolado de espermocultura e de úlceras leishmanióticas (13). Embora o micro-organismo continue apresentando sensibilidade a maioria dos antimicrobianos utilizados na clínica ele foi isolado no Rio de Janeiro de um caso de endocardite mitral fatal, resistente a terapia com a penicilina (12). O micro-organismo isolado demonstrou produção de exotoxina in vitro. No entanto, enfatizamos que não foram encontrados sinais clínicos visíveis de toxemia, um dado complicador para o médico. Hoje sabemos que alguns clones podem apresentar propriedades invasoras, mas porque não produziu a toxina in vivo?. Embora o número de casos notificados seja pequeno, quando comparado com o encontrado em décadas anteriores, o seu isolamento pode deixar microbiologistas repletos de expectativas, quando o material clínico enviado ao laboratório é proveniente de instituições onde estão internados pacientes que apresentam baixa resistência imunológica. Por exemplo, o Centro de Referência descreveu, em 2001, que no laboratório do Instituto Nacional do Câncer, no Rio de Janeiro, foi isolada uma amostra toxinogênica de C. diphtheriae, de uma lesão ulcerada de carcinoma infiltrado basalóide, de um paciente de 45 anos de idade, no período pré-operatório. 14

15 Este bacilo pertencia à variedade mitis fermentadora de sacarose(17). Esses achados nos permitem reafirmar a necessidade da cuidadosa identificação microbiana, conduta particularmente importante, como dito anteriormente, porque outros corineformes, resistentes a antimicrobianos, são identificados como agentes etiológicos em diversos quadros clínicos e não devem ser negligenciados (13). Melhores serão os resultados se estivermos diante de um profissional apresentando mestria, qualidade de perito, por isso no laboratório a prudência, a diligência e a perícia devem ser estimuladas em todas as oportunidades. Não podemos permitir raciocínios em bases falsas. Ao acreditar que uma doença, como a difteria, desapareceu de nosso ambiente estamos correndo o grave risco de não diagnosticá-la a tempo de poder bloquear a ação da poderosa exotoxina. No laboratório do hospital, diante de uma espermocultura, de uma hemocultura ou ainda diante de uma lesão de carcinoma, onde foram encontrados associados cocos piogênicos, o bacteriologista pode rotular o patogênico como difteróide (17). Diante da realidade brasileira e sob o ponto da vista de saúde pública, o diagnóstico clínico precoce, o diagnóstico bacteriológico adequado e a vacinação de toda a população susceptível continuam sendo importantes desafios. Após três décadas de controle absoluto da doença, a difteria ressurgiu em países europeus de maneira epidêmica. O ocorrido na Federação Russa, com mais de 150 mil casos relatados no período de 1990 a 1999, transformou-se no maior surto recente de difteria. Nele foram confirmados 5 mil óbitos, sendo a maioria deles (75%) em adultos (17, 21) Cientistas de vários países voltaram sua atenção para doença. Em junho de 2000, numa reunião promovida pela Organização da Saúde Mundial Européia, os especialistas de mais de 30 países se mostraram preocupados com o risco de uma eventual epidemia generalizada. Naquela oportunidade o Brasil se fez representar pelo Centro de Referência (15). Em termos de prudência, diligência e perícia nossos laboratórios deverão ter como princípio o compartilhar benefícios. Resultados de pesquisas científicas e suas aplicações práticas devem ser divididos com a comunidade científica internacional e a sociedade como um todo. Após o surto epidêmico na Europa, como medida preventiva o Brasil passou a aplicar a vacina tríplice bacteriana na população acima de 7 anos. Nestes dias de crise global é importante incentivar a vacinação de adultos. A situação atual da população brasileira guarda certa semelhança com a da Europa daqueles dias em que o bacilo infectou mais adultos do que crianças. Estudos realizados no exterior demonstraram que 50% dos adultos apresentavam níveis baixos de anticorpos protetores antitóxicos. Por esse motivo recomendou-se a revacinação de adultos e em particular a imunização dos profissionais de saúde. O risco de exposição, na área de saúde, a este patogênico e em particular nos laboratórios de Bacteriologia nos deixa apreensivos. Nossos laboratórios podem estar descartando os bastonetes Gram-positivos, agentes de infecção, após rotulá-los como inofensivos difteróides. Preocupação adicional é saber como andará a imunidade de nossos médicos, enfermeiros, auxiliares de enfermagem e estudantes de saúde. Pediatras e bacteriologistas talvez nem tenham renovado a vacinação nos últimos dez anos. 3. Conclusão Neste trabalho apontamos para eventual demanda judicial, que pode surgir diante do eventual erro do profissional no Laboratório de Bacteriologia Médica. Por outro lado, após a análise das recomendações feitas pelo Centro de Referencia Nacional que também estimulam a prudência, a diligência e a perícia no âmbito da atuação profissional, podemos concluir. Apesar das numerosas dificuldades encontradas num país emergente, não estaremos inferiorizados mesmo diante das facilidades disponíveis nos laboratórios localizados em países do primeiro mundo. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 1. ASSIS TL, FORMIGA LCD & FILGUEIRA AL - A pele: um sistema ecológico. An bras Dermatol, 58 (6): , BRASIL. Constituição da República Federativa do Brasil. Promulgada em 05 de outubro de ª ed. São Paulo: Editora Atlas, BERLINGUER, G. Bioética Cotidiana. Tradução. Editora Universidade de Brasília. Brasília. DF CAVALIERI FILHO, S. Programa de Responsabilidade Civil. 6º edição. Malheiros Editores FORMIGA, L.C.D. New possibilities for Laboratory diagnosis of diphtheria. Brazilian J. Med. Biol. Res., 18: , FORMIGA, L.C.D. Diagnóstico Microbiológico da Difteria (1ª parte). 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16 14. GUARALDI, A.L.M., FORMIGA, L.C.D., PEREIRA, G.A Cell Surface Components and Adhesion in Corynebacterium diphtheriae. Microbes And Infection, 2: , GUARALDI, A.L.M., FORMIGA, L.C.D., CAMELO, T.C.F., PEREIRA, G. A. A Diphtheria Screening Method. In: Sixth International Meeting Of The European Laboratory Working Group On Diphtheria-Who, Bruxelas. Abstract..51, GUARALDI, A.L.M., ENGLER, K., TAM, M., HIRATA R. JR, & FORMIGA. LCD. The Immunochromatographic Method for Toxin Detection and the King-DSU Screening Procedures as Alternative in Rapid Laboratory Diagnosis of Corynebacterium diphtheriae. 101st General Meeting - May at Orange County Convention Center, Orlando, Florida, GUARALDI, A L.M., FORMIGA, L.C.D. Corynebacterium diphtheriae threats in cancer patients. Revista Argentina de Microbiología. 33: , GUARALDI, ALM; FORMIGA, LCD; MAR- QUES, EA, PIMENTA, FP, CAMELLO, TCF & OLIVEIRA, EF. Diphtheria in a vaccinated adult in Rio de Janeiro, Brazil. Brazilian Journal of Microbiology. 32: , HIRATA JR, R., NAPOLEÃO, F., MON- TEIRO-LEAL, L. H., ANDRADE, A. F. B., NA- GAO, P. E., FORMIGA, L.C.D., FONSECA, L.S., MATTOS-GUARALDI, A. L. Intracellular viability of toxigenic Corynebacterium diphtheriae in HEp-2 cells. Fems Microbiology Letters, 215(1): , HIRATA JR, R., SOUZA, S. M. S., RO- CHA-DE-SOUZA, C. M., ANDRADE, A. F. B., MONTEIRO-LEAL, L. H., FORMIGA, L. C. D., MATTOS-GUARALDI, A. L. Patterns of adherence to HEp-2 cells and actin polimerisation by toxigenic Corynebacterium diphtheriae strains. Microb. Pathog, 36: , KELLY C, EFSTRATIOU A. Le septième Congrès international du Groupe de Travail Européen sur la Diphtérie - Vienne, juin Euro Surveill. 2003;8(10):pii=427. Available online: org/viewarticle.aspx?articleid= MACAMBIRA, R.P.; FORMIGA, L.B. & FORMIGA, L.C.D..Difteria: O grave prognóstico brasileiro. J. Bras de Medicina, 66 (3): 69-81, SÉGUIN, E.. Biodireito. 3ª ed. Rio de Janeiro: Editora Lúmen Júris,

17 Ciência in Foco LEPTOSPIROSE: atualização E PERSPECTIVaS Paula Ristow Centro de Pesquisas Gonçalo Moniz, Fundação Oswaldo Cruz, Bahia; paularistow@pqvisitante.bahia.fi ocruz.br. Centro de Pesquisas Gonçalo Moniz. Rua Waldemar Falcão, 121, Candeal. Salvador/BA CEP: Walter Lilenbaum Instituto Biomédico, Universidade Federal Fluminense, Rio de Janeiro. INTRODuÇÃO A leptospirose é uma zoonose de importância global causada por bactérias do gênero Leptospira. Há uma grande diversidade de leptospiras, representadas por 20 espécies genômicas, sendo oito patogênicas, e mais de 200 sorovares. A leptospirose é um problema grave de saúde pública e é estimado que mais de casos da doença ocorram anualmente no mundo (113). A doença grave em humanos é caracterizada por insuficiência renal e icterícia, podendo levar ao óbito 5 a 15% dos pacientes (69). São cada vez mais relatados os casos de Síndrome Pulmonar Hemorrágica Severa (SPHS), os quais, por sua vez, podem atingir taxas de letalidade de até 70% (32, 41). A leptospirose é mantida na natureza por hospedeiros mamíferos reservatórios, os quais são cronicamente infectados por leptospiras nos rins e eliminam a bactéria na urina, contaminando o ambiente (37). A transmissão ocorre através do contato com água contaminada pela urina de reservatórios ou contato direto com animais infectados (58). A doença apresenta padrão endêmico com epidemias sazonais em alguns países da América do Sul, Índia e Sudeste Asiático (50, 52, 53, 54). Epidemias de leptospirose ocorrem após períodos chuvosos (52), onde o número de casos pode chegar a 100/ habitantes ou 0,1% da população (114). Relatos da doença ocorrem tradicionalmente por atividade ocupacional de risco, como lixeiros, veterinários, agricultores (22, 37, 58); e esporadicamente, por contato prolongado com água contaminada de rios e lagos, durante atividades de lazer ou esportivas (70, 82, 98). Recentes surtos epidêmicos deram o status emergente ou re-emergente à leptospirose, que, trata-se, também, de uma doença negligenciada (86), por estar freqüentemente associada a condições de pobreza e falta de saneamento básico (86, 88). A leptospirose é uma importante doença veterinária. Inquéritos sorológicos demonstram alta soroprevalência da doença em animais de produção (62, 85). Os prejuízos na pecuária estão relacionados à doença crônica reprodutiva e diminuição da produção de leite (80). Cães podem apresentar quadros clínicos severos e tornarem-se portadores assintomáticos (5). Animais silvestres de podem ser portadores de leptospiras e há relatos de sorologia positiva em animais silvestres e em cativeiro no Brasil (61, 63, 64, 96). O controle da leptospirose é um desafio em saúde pública e veterinária. O recente seqüenciamento genético de leptospiras (20, 78, 84, 87) representa um marco na pesquisa em leptospirose e possibilitou a realização de estudos inovadores em genômica e patogenia. Com base nestes estudos, têm sido desenvolvidas novas estratégias para o diagnóstico e vacinologia em leptospirose. Esta revisão pretende abordar a zoonose leptospirose com maior enfoque em patogênese, patologia, genômica e perspectivas para o controle da doença. um SéCuLO DE LEPTOSPIROSE Em 2007 comemoramos os 100 anos da descoberta das leptospiras, quando, em 1907, Stimson observou pela primeira vez espiroquetas impregnadas pela prata em cortes histológicos de rins de paciente com diagnóstico errôneo de febre amarela. As bactérias formavam agregados e, individualmente, apresentavam forma de ponto de interrogação, sendo então denominadas Spirochaeta interrogans (103). A primeira descrição da doença fora feita 21 anos antes por Adolf Weil como uma doença infecciosa que causa esplenomegalia, nefrite e icterícia, dando o nome à forma grave da leptospirose como Síndrome de Weil. 17

18 Figura 1. Biofilme de leptospiras em suporte abiótico (vidro). Biofilme de L. biflexa Patoc em lâminas de microscopia, onde a formação do biofilme ocorre na interface ar-líquido, sem coloração (esquerda) e após coloração com solução de cristal violeta 1% (direita) (A); região densa do biofilme no detalhe (A) e em microscopia de contraste de fase (B), onde as leptospiras aderidas ao suporte formam densa rede bacteriana com material extracelular amorfo característico de matriz (aumento de 400x); biofilme vizualizado em microscopia de campo escuro (200x) (C); biofilme de L. interrogans Lai em microscopia eletrônica de varredura, possibilitando observar detalhes da rede bacteriana e presença de matriz extracelular entre as leptospiras. O cultivo do microrganismo foi realizado pela primeira vez no Japão, em 1916, por Inada e colaboradores (48). Nos anos subseqüentes, os pesquisadores japoneses publicaram estudos clássicos acerca da patogenia e profilaxia da leptospirose, demonstrando a infecção experimental, proteção passiva em cobaios e características morfológicas das leptospiras (46, 48). Em 1917, Ido e colaboradores identificaram o papel do rato como reservatório (47). Ao longo do tempo a leptospirose foi caracterizada como uma doença ocupacional, afetando agricultores de arroz, de cana; fazendeiros, trabalhadores de esgoto, mineiros e militares (58). A migração rural humana para as cidades no século XXI levou a um desenvolvimento desorganizado de cidades e falta de planejamento em saúde, levando a epidemias de leptospirose e outras doenças infecciosas nestas populações (52, 88). A Biologia Única do Gênero Leptospira As leptospiras (do grego leptós, fino, pequeno, delicado e speira, espira) são bactérias helicoidais de 6 a 20 µm de comprimento e 0,1 µm de diâmetro, com um ou ambos os terminais em forma de gancho (58). Embora possuam estrutura celular semelhante à de bactérias Gramnegativas, como a presença de membrana externa contendo lipopolissacarídeo (LPS), têm características singulares de parede, como a presença de peptidoglicano ligado à membrana citoplasmática (43). As leptospiras não se coram pelos métodos usuais de coloração, sendo visualizadas por microscopia de campo escuro ou microscopia de campo claro de contraste de fase, ou ainda, por impregnação pela prata. São microrganismos extremamente móveis por possuírem dois endoflagelos polares, um em cada terminal, localizados no espaço periplásmico (21, 75). Realizam movimentos de rotação ao longo do seu eixo e de translação, movendo-se rapidamente em linha reta ou em arcos (37). São microrganismos aeróbios obrigatórios (21, 58, 106) e de difícil cultivo, crescendo em temperatura ótima de 28 a 30ºC, ph 7,2 a 7,6, e em meios ricos, contendo albumina bovina e soro de coelho (34, 49, 102). Possuem longo tempo de geração em cultivos in vitro, variando de três horas para espécies saprófitas até 24 horas para espécies patogênicas. O crescimento em meio de cultura varia de dois dias até 26 semanas em isolamentos primários (36, 37). As leptospiras são bactérias ubiquitárias que sobrevivem na água (12, 39, 92, 104), bem como em solos, lama, coleções de água doce e rios (45). São sensíveis ao ressecamento, desinfetantes, extremos de temperatura e ph (37). As espécies saprófitas sobrevivem e se multiplicam na água (84, 92), no entanto os mecanismos de sobrevivência na água e ambiente ainda são desconhecidos. As leptospiras naturalmente formam agregados (104) e recentemente descrevemos a formação de biofilme in vitro por leptospiras saprófitas e patogênicas (90) (Figuras 1 e 2). As leptospiras quando formam biofilmes aderem-se a uma superfície e assumem um estilo de vida séssil, em comparação com a vida livre ou planctônica anteriormente descrita (Figura 2). A formação de biofilmes possivelmente ofereça vantagens biológicas às leptospiras, como maior proteção no ambiente natural, conseqüentemente maior tempo de sobrevivência no ambiente; ou proteção contra o sistema imune, favorecendo a colonização renal de reservatórios e conseqüentemente transmissão da leptospirose. Tais aspectos da biologia e patogenia de leptospiras permanecem desconhecidos e serão escopo de futuras pesquisas. A Complexa Classificação de Leptospiras Leptospiras pertencem ao Filo Spirochaete, Ordem Spirochaetales, Família Leptospiraceae e Gênero Leptospira. Até 1989 o gênero era classificado de acordo com as características sorológicas, 18

19 Figura 2. Ciclo de formação de biofilmes. 1. As leptospiras, microrganismos espiralados, aderem-se a superfícies bióticas ou abióticas. 2. Uma vez em vida séssil, multiplicam-se formando microcolônias. 3. O biofilme maduro é constituído por densa rede de bactérias cobertas por material amorfo denominado matriz extracelular. Os biofilmes de leptospiras atingem o estado maduro em 48 h (espécie saprófita) e 7-10 dias (espécies patogênicas). 4. A partir da maturaçao do biofilme, as células bacterianas destacam-se do biofilme e retornam à vida planctônica ou sofrem morte celular. baseando-se na variabilidade do LPS de parede de leptospiras, e fenotípicas; sendo dividido em dois grandes grupos, Leptospira biflexa sensu lato, contendo as leptospiras saprófitas e Leptospira interrogans sensu lato, contendo as leptospiras patogênicas (13). A aglutinação sorológica com antígenos homólogos permitiu identificar mais de 200 sorovares de Leptospira e os sorovares relacionados antigenicamente foram agrupados em 24 sorogrupos, os quais embora sejam aceitos em microbiologia clínica e epidemiologia, não são reconhecidos como unidades taxonômicas (58). A classificação genotípica, baseada em hibridização DNA-DNA, agrupou as leptospiras em espécies genômicas. As espécies patogênicas compreendem: Leptospira alexanderi, Leptospira borgpetersenii, L. interrogans, Leptospira kirschneri, Leptospira noguchii, Leptospira santarosai, Leptospira weilii e Leptospira alstoni. As leptospiras intermediárias, que podem ou não causar doença, são: Leptospira broomii, Leptospira fainei, Leptospira inadai, Leptospira wolffii e Leptospira licerasiae. O último grupo compreende as leptospiras saprófitas: L. biflexa, Leptospira meyeri, Leptospira wolbachii, Leptospira kmetyi, Leptospira vanthielii, Leptospira terpstrae e Leptospira yanagawae (19, 59, 68). A classificação genotípica apresenta dicotomia em relação à classificação sorológica, pois um mesmo sorovar pode representar mais de uma espécie genômica, sendo a última, portanto, ainda aceita. Técnicas de tipagem molecular foram desenvolvidas (17, 95, 105), porém o seu uso para rotina em classificação permanece restrito, pois estudos de aperfeiçoamento e validação ainda são necessários para a sua ampla aplicação. Genômica e Manipulação Genética O sequenciamento genético completo de leptospiras patogênicas e saprófita revelou a presença de dois cromossomos circulares com conteúdo G-C de aproximadamente 35% (78, 84, 87). O genoma de L. interrogans sorovar Copenhageni, agente da síndrome de Weil, contém sequências codificadoras divididas no cromossomo maior (CI) de 4,2 Mb, contendo a maioria de genes essenciais, e no cromossomo menor (CII) de 0,35 Mb (78). O genoma de L. interrogans sorovar Lai possui ainda uma região fágica com características de ilha de patogenicidade (16). A saprófita L. biflexa sorovar Patoc possui um terceiro elemento genético replicativo com características de plasmídio (84). O genoma de L. borgpetersenii sorovar Hardjo possui redução genômica de 700 kb em relação a L. interrogans, o que sugere que uma pior adaptação à vida fora do hospedeiro bovino (20). Cerca da metade dos genes de Leptospira não exibem similaridade com genes que codificam proteínas de função conhecida ou proteínas de outros organismos, sugerindo serem únicos do gênero (84). Conhecimentos dos mecanismos de patogênese ainda são incipientes, devido principalmente pela ausência, até pouco tempo, de ferramentas genéticas adequadas para a manipulação de leptospiras (6, 65). O primeiro passo na manipulação genética de leptospiras ocorreu com o desenvolvimento de um plasmídio replicativo E. coli - L. biflexa (93, 94). Picardeau e colaboradores (2001) realizaram a recombinação homóloga pela primeira vez em L. biflexa, gerando o mutante flab deficiente em síntese de flagelina (83). A primeira transferência genética em Leptospira patogênica foi realizada por transposição aleatória do transposon Himar1, o qual se insere de maneira aleatória no genoma bacteriano, interrompendo um gene (15). Utilizando a transposição aleatória foi possível identificar o primeiro gene de virulência 19

20 Figura 3. Aspecto microscópico de seções histológicas de cobaio, modelo experimental de leptospirose aguda, infectado por Leptospira interrogans. Acima à esquerda, observamos secção de fígado em coloração por hematoxilina-eosina (HE) evidenciando perda da estrutura parenquimatosa, destrabeculação, presença de células de Kupfer aumentadas e de infiltrado linfocitário periportal (x100). Acima à direita, secção de pulmões corada por Wartin-Starry, onde as leptospiras coram-se em preto e encontram-se aderidas à membrana alveolar (x1000). Os rins de cobaios infectados (abaixo) apresentam intensa hemorragia e necrose tubular na área cortical quando corados por HE (x200, à esquerda) e, em imunohistoquímica com anticorpos anti LipL-32, apresentam leptospiras no espaço de Bowman e entre capilares glomerulares (x400, à direita). de leptospiras, loa22, que codifica para uma proteína do tipo OmpA localizada na membrana externa (89) e majoritária na membrana (43), associada a citotoxidade renal e indução de resposta inflamatória (115). A interrupção de loa22 por cassete de resistência a espectinomicina provocou a atenuação em L. interrogans Lai, perdendo a capacidade de causar doença e letalidade nos modelos animais hamster e cobaio (89). A mutação sítio dirigida através de recombinação homóloga do gene putativo de virulência ligb, resultou, no entanto, em mutantes virulentos, demonstrando que pode haver redundância funcional em proteínas putativas de virulência (28). Hospedeiros e Manifestações clínicas Os reservatórios animais de leptospiras, denominados hospedeiros de manutenção, compreendem uma grande diversidade de animais silvestres e domésticos, em meio urbano e rural. Cada sorovar de Leptospira tende a ser mantido por um reservatório específico e as associações entre reservatórios e sorovares mais conhecidas são: roedores e Icterohaemorrhagiae, ou Copenhageni, ou Lai; cães e Canicola; bovinos e Hardjo; suínos e Pomona (37). Rattus norvegicus é o principal reservatório de Leptospira interrogans sorovar Copenhageni, o sorovar implicado em epidemias urbanas no Brasil (52). O homem é sempre um hospedeiro incidental no ciclo da leptospirose e não é adaptado a nenhum sorovar, sendo susceptível à doença (37). As manifestações clínicas da leptospirose possuem amplo espectro de 20