17/10/2012. Bases Instrumentais de bioinformática aplicada à Epidemiologia Molecular das doenças transmissíveis. Fábio Gregori. O que é?

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Ana do Carmo Domingues Barateiro
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1 Bases Instrumentais de bioinformática aplicada à Epidemiologia Molecular das doenças transmissíveis Fábio Gregori O que é? Vantagens e desvantagens Ser mais completo,... Versões (Windows [32 bit], DOS, Linux, MacOs 9) O que o PAUP* não faz? PAUP* não permite edição de árvores (como o MacClade ou TreeView). PAUP* não faz análises de maximum likelihood em sequências de aminoácidos. PAUP* (não alinha nem busca sequências em bancos de dados). 1

.. Versões (Windows [32 bit], DOS, Linux, MacOs 9) O que o PAUP* não faz?

2 FASTA (*.FAS) BLOCO DE ANÁLISE (NTs ou Aas) ALINHADOS ENTRADA *.NEX / *.PAU / *.NEXUS SAÍDA *.TRE (entre outras possíveis) 2

3 FASTA (*.FAS) BLOCO DE ANÁLISE ALINHADO Modeltest? ENTRADA *.NEX / *.PAU / *.NEXUS SAÍDA *.TRE (entre outras possíveis) PAUP.html #Nexus begin paup; set crit=parsimony autoclose=yes maxtrees=1000 increase=auto; Pset gapmode=newstate; log start file=pars_log.txt replace; hsearch; Pscores/ RI=yes Scorefile=scores_par.txt replace=yes; Contree; Savetrees from=1 to=1 file=contree.tre brlens=yes format=altnexus replace=yes; bootstrap nreps=1000 search=heuristic brlens=yes; savetrees from=1 to=1 savebootp=nodelabels maxdecimals=0 file=bootst_par.tre; log stop; end; 3

html #Nexus begin paup; set crit=parsimony autoclose=yes maxtrees=1000 increase=auto; Pset gapmode=newstate; log start file=pars_log.

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5 Inferências Filogenéticas Fábio Gregori Alguns critérios para Grupos Externos 1 Certeza de divergência anterior: o grupo que determina a raiz deve ser mais basal que o grupo interno 2 Descartar grupos muito distantes pode resultar em sérios erros topológicos, pois os sítios poderão estar saturados por múltiplas mutações e a informação filogenética estará perdida 3 Descartar grupos muito próximos pois este pode ser, na verdade, um grupo interno 4 Se possível, usar mais de um grupo externo quando possível, garantirá uma topologia de árvore mais consistente Métodos de Distância: Funcionam basicamente em dois passos, sendo que o primeiro deles é a redução das variações entre sequências alinhadas a valores de distância dispostos em uma matriz. No segundo passo, estes valores são utilizados na reconstrução filogenética. A chamada distância p, que expressa o número de sítios variáveis entre duas sequências com relação ao total de sítios comparados, geralmente é apresentada/construída em forma de uma matriz. Modelos evolutivos utilizados para o cálculo de distâncias genéticas: Jukes-Cantor, Kimura 2 parâmetros, Tajima e Nei e Tamura 3 parâmetros. Na reconstrução filogenética, são utilizados os algoritmos o UPGMA (Unweighted Pair Group Method with Arithmetic means), Neighbor-joining, Evolução Mínima, Least Squares que realizam uma série de cálculos com a matriz de distância gerada a partir do alinhamento para estimar a árvore filogenética. Vantagens: rápido e gera apenas uma única árvore. 1

próximos pois este pode ser, na verdade, um grupo interno 4 Se possível, usar mais de um grupo externo quando possível, garantirá uma topologia de árvore mais consistente Métodos de Distância:

6 Métodos de Distância: Modelos de Substituição 1 Alinhar e criar bloco de análise 2 Criar uma matriz de distâncias sob algum critério: dist. p ou Modelo de Substituição. 3 Processar a matriz sob algum algoritmo para a construção da árvore (UPGMA, NJ, LS, ME) Modelo de Substituição JC Transições e transversões Onde: d x,y = distância entre seqs X e Y, expressa como nº de mudanças por sítio p=1-q = proporção de nucleotídeos diferentes entre as seqs. X e Y ln = logaritmo natural para corrigir mutações sobrepostas. Exemplo: Duas seqs são idêntidas em 90% dos sítios (ou seja são 10% diferentes) A G C T Transições ( ) são mutações entre PURINAS (A,G) ou entre PIRIMIDINAS (C,T). Transversões ( ) são mutações entre PURINAS e PIRIMIDINAS (ou vice-versa). Transições e transversões Modelo de Substituição K2P 4 possíveis transições : A G; C T 8 possíveis transversões: A C, A T, G C, G T K2P: Leva em consideração que as taxas de transição são diferentes, mas assume freq. de bases iguais. Portanto, se as mutações forem randômicas, as transversões são 2 vezes mais prováveis do que as transições. Porém, biológicamente, as transições são mais frequentes. Transversões tem maior impacto na possibilidade de alterações em termos de aminoácidos se comparados com as transições. Onde: P, Q = freq. total de pares de substituição do tipo transição e transversão. 2

de mudanças por sítio p=1-q = proporção de nucleotídeos diferentes entre as seqs. X e Y ln = logaritmo natural para corrigir mutações sobrepostas.

7 Modelo de Substituição Tamura Em dados reais, as freqs dos nucleotídeos raramente são iguais e o conteúdo de GC difere de 0,5. Tamura desenvolveu um método que leva em consideração diferenças no conteúdo de GC (alto e baixo): Qual Modelo usar? Onde: h = 2t (1-t) Sendo t = conteúdo de GC. Modeltest Métodos de Distância: 1 Alinhar e criar bloco de análise 2 Criar uma matriz de distâncias sob algum critério: dist. p ou Modelo de Substituição. 3 Processar a matriz sob algum algoritmo para a construção da árvore (UPGMA, NJ, LS, ME) 3

Onde: h = 2t (1-t) Sendo t = conteúdo de GC. Modeltest http://darwin.uvigo.es/software/modeltest.

8 Máxima Este método baseia-se na teoria de que a melhor hipótese para explicar um processo é aquela que requer o menor número de passos. Ou seja, uma mudança é mais provável do que duas. A árvore que possuir um menor número de mudanças (substituições/passos) para explicar os dados do alinhamento é a mais próxima da real Modelo Implícito Na MP não há a fase de cálculo de distância, sendo que as árvores são calculadas diretamente dos dados do alinhamento. Entretanto, esta metodologia requer muito mais tempo quando se usa a busca exaustiva de árvores, uma vez que o computador precisa reconstruir todas as árvores possíveis para "escolher" aquelas com um número mínimo de mudanças, que são chamadas de árvores mais parcimoniosas ( consenso). Para contornar este problema do tempo, existem também algoritmos heurísticos de reconstrução filogenética, mas é preciso lembrar que, nestes casos, a árvore final pode ser sub-ótima. Sítios de Informação p/ Rato Lagarto Peixe Rato Lagarto Peixe Rato Peixe Lagarto Devem apresentar pelo menos dois tipos de nucleotídeos em pelo menos duas das sequências. A B C = aparecimento do pulmão A topologia A representa a árvore mais parcimoniosa pois requer o menor número de mudanças para explicar o caráter pulmão. 4

sendo que as árvores são calculadas diretamente dos dados do alinhamento.

9 Número de árvores dicotômicas para n OTUs Considere 6 taxas (seqs), denominados de 1 a 6. 1=TTTCCCAGGG 2=TTTCCCCGGG 3=TTTCCCAGGG 4=TTTCCCGGGG 5=TTTCCCGGGG 6=TTTCCCCGGG Existem 105 possíveis árvores para estes 6 taxas. 22 OTUs= 3x10 23 árvores não enraizadas = quase 1 mol de árvores 50 OTUs= 3x10 74 árvores não enraizadas = Maior que o número de átomos do universo Por exemplo, escolhemos 1 árvore não enraizada (outras árvores serão avaliadas pelo computador) Se enraizarmos a árvore A partir do táxon 1, temos: 5

22 OTUs= 3x10 23 árvores não enraizadas = quase 1 mol de árvores 50 OTUs= 3x10 74 árvores não enraizadas = Maior que o número de

10 A partir dos ramos, vamos movendo para a raiz, observando os estados. Total de mudanças: 4 Árvores consenso Consenso estrito 50% majority rule 75% majority rule Bootstrap consensus tree Total de mudanças: 4 6

11 =consenso estrito politomia Estratégias de busca de árvores Estratégias de busca de árvores Exaustiva (max-mini) Branch-and-bound: árvores que tem um comprimento maior do que o previamente examinado são ignorados. Heurística: Stepwise addition (as is, random, closest) / star decomposition Branch Swapping (nearest neighbor interchanges, subtree pruning regrafting e Tree bisection-reconection). Estratégias de busca de árvores Número de árvores dicotômicas para n OTUs OTU < 10 Busca Exaustiva - TODAS as árvores possíveis são examinadas 10 < OTU < 20 Busca por árvore específica - Topologias sabidamente incorretas são descartadas - Branch-and-Bound OTU > 20 Busca Heurística - Apenas uma porção de todas as árvores possíveis é examinada (e não há garantias de se encontrar a árvore de MP, mas é possível aumentar a probabilidade de encontrá-la através de algoritmos específicos) 22 OTUs= 3x10 23 árvores não enraizadas = quase 1 mol de árvores 50 OTUs= 3x10 74 árvores não enraizadas = Maior que o número de átomos do universo 7

Estratégias de busca de árvores Número de árvores dicotômicas para n OTUs OTU < 10 Busca Exaustiva - TODAS as árvores possíveis são examinadas 10 < OTU < 20 Busca por árvore específica - Topologias

12 Bootstrap 8

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