GTA GAA GTA GAA. Implicações do código DNA ser degenerado. Tipos de mutação pontual

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1 Mutaçã Breve Históric Uma ferramenta para estud da estrutura e funçã de prteínas Fernand Vascncels Maluf Dutrand IFSC - USP Intrinsecamente ligada cm a evluçã das espécies survival f the fittest under selective pressure. Darwin 1927 Hermann Muller - Mscas e rais X (Science) 1936 Stadler UV e milh (PNAS) 1940 Auerbach & Rbsn Mscas e Gás mstarda (Cmpst Químic Mutagênic) Relaçã de denças que sã manifestações de mutações, entre elas, câncer. VANTAGEM OU DESVANTAGEM 2 Mutaçã - Cnceits Mudança acidental na sequência de DNA u RNA Causas - Radiaçã - Vírus - Transpsns - Cmpsts químics mutagênics Tips de mutaçã Mutaçã Pntual (SNP) Inserçã Deleçã Grande escala (Regiã crmssômica) Fase - 1 MKRSRRATQQEDVMRALKEGV QALSVSSALSTKDLVCRGDHAR AIQQFLEDEKHHTMQIFGMPG TGKTATVNFALAQLVSRRGT Fase - 2 SGAGERRSRRMStp CGRSRKAC RRStp VFRARFPQRTLFAEGTT HVQYSNSSKMRSITRCRYLECL VPARRRPStp TLRWRNWYRDE - Replicaçã d DNA Efeit Variável Amplificaçã de regiã crmssômica Deleçã Translcaçã 3 4

2 Implicações d códig DNA ser degenerad Tips de mutaçã pntual - Silencisa Nã há mudança n aminácid TTC Phe TTT Phe - Missense Neutral Há mudança de aminácids Anemia falcifrme Fibrse cística Câncer AGT AGA Ser Arg - Nnsense Sem sentid Gera um Stp códn CGA TGA Fibrse cística Talassemia Síndrmes variadas Câncer 5 Arg Stp 6 Tips de mutaçã pntual Missense Mutaçã cnservativa Mutaçã para um aminácid cm características semelhantes Tips de mutaçã pntual Missense Mutaçã nã-cnservativa Mutaçã para um aminácid cm características diferentes GAA GTA GAA GTA Archives f Bichemistry and Biphysics 489, p10-14 (2009) Glu Asp Mudanças K d d substrat para enzima em estud cm esta mudança cnservativa Glu Val 7 Anemia Falcifrme 8

3 Mecanisms de repar Imprtância da manutençã da integridade d DNA bem cm ds sistemas de repars (múltipls) Mutaçã Cm explrar?? Diante de uma manifestaçã fentípica >> análise gentípica (eg. resistência à um antibiótic) Sistema de Repar E. cli Bases mal emparelhadas Outrs sistemas de repars E. cli Mutaçã aleatória induzida (eg. expsiçã a UV, agentes mutagênics químics, PCR errr prne ) Excisã de bases : explrar imprtância de resídus: Excisã de nucletídes Repar diret Se tenh sistema de repar, cm pdem crrer mutações??? 9 - Atividade catalítica - Afinidade de substrat/ligantes - Interfaces entre subunidades Fenômens de ligmerizaçã e interaçã entre prteínas - Fenômens de cperatividade em enzimas - Validaçã de hipóteses relacinadas a papel de resídus específics 10 Mutaçã Exempl GAPDH de T. cruzi Mutaçã Exempl GAPDH de T. cruzi Ácid anacárdic H 2 Pd Avaliaçã da Inibiçã 1/V max [I] Pereira et al., Birg. Med. Chem., 2008, 16, /K app M 11 12

4 Mutaçã Exempl GAPDH de T. cruzi Inibidr nã-cmpetitiv Mutaçã Exempl GAPDH de T. cruzi Estuds cristalgráfics Lys101 Ala101 Glu101 Gln QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit Prpsta: Cm própri nme diz >> Rápid Fundament: Olignucletídes aut-cmplementares cntend a mutaçã desejada Cndiçã: passs de alta eficiência Prblema: Meu grup de pesquisa trabalha cm uma enzima (GAPDH) que catalisa a reaçã de transfrmaçã d gliceraldeíd-3- fsfat para 1,3-bifsfglicerat. Há sugestões que um resídu serina psicinada n síti ativ seja essencial para a atividade catalítica. Quer avaliar pr mutaçã síti-dirigida. Prtcl Planejament ds Olignucletides (Primers) - Aut-cmplementares perfeits; - Ter entre bases e um T m 78 C (usand fórmula própria para cálcul); - Mutaçã deve ficar n mei d primer, tend bases crretas de cada lad; Ser TCA AGT Cnstruçã em pet28a Ala GCA Ser TCA Thr ACA 15 - Cnteúd de GC em trn de 40%; - Nã há necessidade de serem fsfrilads mas precisam ser purificads via HPLC; - Manter a quantidade de primer em excess (Variações); 16

5 Prtcl Reaçã de Síntese PCR Primer pair PARA ALA ** Frward: 5' CGGATCTCCCATGGGGCGCGCTTGGTGTGGAGTACG 3' Reverse: 5' CGTACTCCACACCAAGCGCGCCCCATGGGAGATCCG 3' ** GC cntent: 66.67% Lcatin: Melting temp: 84.2 C Mismatched bases: 2 Length: 36 bp Mutatin: Substitutin 5' flanking regin: 17 bp Frward primer MW: Da 3' flanking regin: 17 bp Reverse primer MW: Da Detalhes Técnics: - DNA Plimerase >> Pfu; - Quantidade de material mlde baix (5-50 ng); - Númer de cicls baix (12-18 cicls); Reaçã de PCR Tampã de Reaçã Primer Sens ( Frward ) Primer Antisense ( Reverse ) DNA mlde dntp 95 C 55 C 68 C X cicls 17 Pfu (DNA plimerase) 18 Prtcl Reaçã de Síntese PCR Selvagem Mutante Prtcl Tratament cm endnuclease DPN I 1 cicl Mistura de espécies 2 cicl 19 20

6 Prtcl Tratament cm endnuclease DPN I - Resum Grup Metil 37 C 1 hra DNA parental digerid Prtcl Transfrmaçã da prdut tratad em células cmpetentes - Células Quimicmpetentes - Células Eletrcmpetentes ( Pass imprtante) - Cnfirmaçã Ser AGC Obtençã ds mutantes - A presença d plasmíde é cnfirmada pel cresciment em mei seletiv Cnfirmaçã da mutaçã - Sequenciament ACC Thr 23 24

7 - Cnfirmaçã - Cnfirmaçã Phusin Diferenças Phusin Prtcl - Phusin (DNA plimerase) - Primers nã sã autcmplementares, sã fsfrilads e de alta pureza (HPLC) - Apenas um ds primers que cntém a mutaçã desejada - Quantidades muit pequenas de DNA mlde para a reaçã, nã havend necessidade de destruir DNA parental em uma etapa psterir - Sequenciament de pel mens 5 clônias para btençã de um mutante 27 28

8 Phusin Prtcl Exempl 2 Prteína flurescente (GFP Green Flurescence Prtein ) Prêmi Nbel 2008 Tratament - T4 DNA ligase Opçã: T4 DNA kinase +T4 DNA ligase - Muit antiga (milhões de ans) presente Aequrea victria - Serve cm snda (micrscópi) gene reprter - Pss acmpanhar a lcalizaçã de prteínas - Prduçã de prteínas - GFP Y66H flurescência 29 30

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