UNIVERSIDADE FEDERAL DO AMAZONAS FACULDADE DE CIÊNCIAS DA SAÚDE PROGRAMA DE MESTRADO EM PATOLOGIA TROPICAL

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1 UNIVERSIDADE FEDERAL DO AMAZONAS FACULDADE DE CIÊNCIAS DA SAÚDE PROGRAMA DE MESTRADO EM PATOLOGIA TROPICAL AVALIAÇÃO IN VITRO DA ATIVIDADE ANTIMICROBIANA DA PASTA DE HIDRÓXIDO DE CÁLCIO ASSOCIADA A DIFERENTES VEÍCULOS FRENTE À Candida albicans E AO Enterococcus faecalis CLAUDIA DIAS ABINADER MANAUS 2005

2 UNIVERSIDADE FEDERAL DO AMAZONAS FACULDADES DE CIÊNCIAS DA SAÚDE PROGRAMA DE MESTRADO EM PATOLOGIA TROPICAL CLAUDIA DIAS ABINADER AVALIAÇÃO IN VITRO DA ATIVIDADE ANTIMICROBIANA DA PASTA DE HIDRÓXIDO DE CÁLCIO ASSOCIADA A DIFERENTES VEÍCULOS FRENTE À Candida albicans E AO Enterococcus faecalis Dissertação apresentada ao Programa de Mestrado em Patologia Tropical da Universidade Federal do Amazonas, como requisito parcial para a obtenção do título de Mestre em Patologia Tropical, área de concentração em Etnomedicina e Biodiversidade Princípios ativos em recursos naturais amazônicos. Orientadora: Prof a Dr a Maria Fulgência Costa Lima Bandeira Co-orientadora: Prof a Dr a Maria Francisca Simas Teixeira MANAUS 2004

3 ABINADER, Claudia Dias Abinader. Avaliação in vitro da atividade antimicrobiana da pasta de hidróxido de cálcio associada a diferentes veículos frente à Candida albicans e ao Enterococcus faecalis/ Claudia Dias Abinader, Orientador: Maria Fulgência Costa Lima Bandeira; Co-orientadora: Maria Francisca Simas Teixeira Manaus, AM: UFAM, p : il. Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de Pós-graduação Multidisciplinar em Patologia Tropical da Universidade Federal do Amazonas. 1. Infecção Endodôntica Enterococcus faecalis Candida albicans 2. Hidróxido de Cálcio Atividade Antimicrobiana 3. Óleo de Copaíba Atividade Antimicrobiana I. Maria Fulgência Costa Lima Bandeira II. Título

4 CLAUDIA DIAS ABINADER AVALIAÇÃO IN VITRO DA ATIVIDADE ANTIMICROBIANA DA PASTA DE HIDRÓXIDO DE CÁLCIO ASSOCIADA A DIFERENTES VEÍCULOS FRENTE À Candida albicans E AO Enterococcus faecalis Dissertação apresentada ao Programa de Mestrado em Patologia Tropical da Universidade Federal do Amazonas, como requisito parcial para a obtenção do título de Mestre em Patologia Tropical, área de concentração em Etnomedicina e Biodiversidade Princípios ativos em recursos naturais amazônicos. Aprovado em 04 de Outubro de 2005 BANCA EXAMINADORA Prof a Dr a Maria Fulgência Costa Lima Bandeira Universidade Federal do Amazonas Prof a Dr a Ângela Delfina Bittencourt Garrido Universidade Federal do Amazonas

5 Prof a Dr a Juliana Mesquita Vida Martinez de Lucena Universidade Estadual do Amazonas Dedico este trabalho a Deus que esteve sempre ao meu lado em todos os momentos. Sua manifestação me veio através das muitas pessoas de boa vontade e de bom coração que cruzaram o meu caminho durante essa jornada.

6 AGRADECIMENTOS Agradeço à Universidade Federal do Amazonas, ao Programa de Mestrado em Patologia Tropical, seus coordenadores e funcionários pela cooperação e auxílio durante a conclusão desse projeto. À Prof a Dr a Maria de Jesus Coutinho Varejão do Instituto Nacional de Pesquisa da Amazônia INPA pela disposição e pela gentileza em me ajudar e a todos os funcionários dessa instituição que me auxiliaram na obtenção dos óleos de copaíba. À fundação Oswaldo Cruz do Rio de Janeiro e ao Prof. Dr. Ivano de Filipis, Chefe do Laboratório de Microrganismos de Referência do INCQS, que gentilmente cedeu as cepas-padrão utilizadas nesse trabalho. A todos meus companheiros de Laboratório, Memé, Tereza, Araluce, Julinho, Iarinha, Thaís, Felipe e Suanni. As horas passadas com vocês me valeram todo o mestrado. Obrigada pela amizade e eterna boa vontade de todos. Ao professor e colega de Mestrado Antonio Batista da Silva, pelas preciosas sugestões concedidas durante todo o experimento. Às colegas de Mestrado Andréia Camargo e Mônica Hosannah. Mesmo que eu nada tivesse alcançado durante este curso, a amizade que conquistamos juntas teria suplantado qualquer fracasso.

7 Aos colegas de Mestrado, Ana Paula, Rossilene, Heliana, Francisco e Socorro por terem me dado a oportunidade de conviver com pessoas maravilhosas: vocês. À Prof a Dr a Waldireny Caldas Rocha, ao Prof. Dr. Cabral e a todos os funcionários do Centro de Biotecnologia da Amazônia CBA que me auxiliaram na obtenção das frações dos óleos de copaíba. Muito obrigada pela gentileza e boa vontade. A acadêmica Patrícia Samea Ledo Lima, por me ajudar em todas as horas, por ser paciente e desprendida e por ter sido meu braço direito em todo esse trabalho. À Prof a Dr a Maria Francisca Simas Teixeira, do Instituto de Ciências Biológicas da UFAM, por todo o carinho, toda a paciência, por todos os indispensáveis ensinamentos e principalmente por ter me acolhido de braços abertos. A minha amiga e orientadora Prof a Dr a Maria Fulgência da Costa Lima Bandeira que acreditou em mim desde o início. Sou grata pelo apoio, pelo eterno incentivo, pelos conselhos em boa hora, por me escutar e me tratar sempre como uma filha, muito mais do que aluna. Serei eternamente grata.. As minhas amigas Lidiane Antunes Fernandes, Andréa Claudia Araújo Barbosa e Cimara Barroso Brum. A amizade de vocês me é tão preciosa. Vocês sempre me apoiaram e, o mais importante, sempre acreditaram em mim. Obrigada pela força e por me resgatarem dos meus momentos de desespero durante essa empreitada. Ao meu amigo querido João Luiz Pereira de Araújo, colega de faculdade, de mestrado e irmão de coração. Obrigada pela generosidade, pelo desprendimento e por sempre ser tão honesto e sincero. Obrigada por agüentar minhas crises e maluquices e por ter atendido meu apelo desesperado na hora de concluir essa dissertação.

8 A toda a minha família, à minha avó Maria Leonor Cabral Dias e à minha tia Cleonor Cabral Dias pelo incentivo e pelo apoio em todos os aspectos durante toda a minha vida. Amo todos vocês. Aos meus queridos irmãos Humberto Dias Abinader e Samir Dias Abinader, pelo apoio, pela paciência, pelo carinho e pela eterna disposição em me ajudar. A Marcelo Abelaira Vizotto, meu marido, meu melhor amigo, amor da minha vida. Se não fosse pelo seu exemplo eu jamais teria iniciado essa jornada. Obrigada pelo incentivo, pelo carinho, por estar sempre ao meu lado e principalmente por seu amor, alicerce que me apoiou em todas as horas. Por fim, agradeço aos fundadores do meu Fã Clube Oficial e membros vitalícios dessa instituição, Tobias Mousse Abinader e Cleomar Dias Abinader, meus pais. Foi o amor, o exemplo, a dedicação, o sacrifício e a fé de vocês que me fizeram o que sou hoje. Não existe palavra que expresse a gratidão e o amor que sinto por vocês. Espero ser sempre motivo de orgulho e alegria.

9 RESUMO A maioria dos microrganismos de infecções endodônticas, juntamente com a sua principal fonte de substrato, a polpa necrótica, pode ser eliminada pela terapia endodôntica convencional e pelo uso de medicamentos intra-canal. O hidróxido de cálcio (HC) possui atividade antimicrobiana comprovada e é um dos agentes mais usados na endodontia, no entanto, alguns microrganismos, como a Candida albicans e o Enterococcus faecalis são resistente à sua ação antimicrobiana. O óleo de copaíba, fitoterápico amplamente utilizado pelas populações amazônicas, é conhecido por suas propriedades medicinais. Baseando-se nas propriedades do óleo de copaíba e na ação antimicrobiana comprovada do hidróxido de cálcio, propôs-se nesse estudo, avaliar a atividade antimicrobiana da pasta de hidróxido de cálcio associada a vários veículos, entre eles o óleo de copaíba frente à C. albicans e ao E. faecalis. A atividade antimicrobiana foi avaliada utilizando-se o teste de difusão em ágar e o teste de diluição em meio líquido frente às cepas de C. albicans ATCC e E. faecalis ATCC em 16 grupos experimentais: G1 in natura C. multijuga 73 (IN 73); G2 in natura C. multijuga 69 (IN 69); G3 in natura C. reticulata (IN Cr); G4 essencial C. multijuga 73 (E 73); G5 essencial C. mulitjuga 69 (E69); G6 essencial C. reticulata (E Cr); G7 soro fisiológico - SF (controle negativo); G8 polietilenoglicol 400 PEG 400 (controle negativo); G9 HC+ IN 73; G10 HC+ IN69; G11 HC + PEG 400; G12 HC+ E 73; G13 HC+ E 69; G14 HC + E Cr; G15 HC + SF; G16 HC + IN Cr, nos períodos de 24, 48 e 72 horas. Os grupos G1 a G8 não apresentaram atividade antimicrobiana frente aos microrganismos em ambas as metodologias empregadas. Os grupos G9 a G15 apresentaram atividade fungicida frente à C. albicans em ambos os testes utilizados. Os grupos G9 a G16 não apresentaram atividade bactericida frente a E. faecalis no teste de difusão em ágar. Os grupos G11 a G15 apresentaram atividade bactericida frente ao E. faecalis no teste de diluição em caldo. Os resultados permitiram concluir que a associação do hidróxido de cálcio a vários veículos, dentre eles o óleo de copaíba e sua frações, apresentaram atividade antimicrobiana sobre os microrganismos teste dentro das condições experimentais do estudo. Palavras chave: óleo de copaíba; hidróxido de cálcio; infecção endodôntica

10 ABSTRACT The majority of endodontic infections microbiota can be eliminated by conventional endodontic therapy and intra-canal medications. However, some endodontic pathogens as Enterococcus faecalis and Candida albicans can resist to the most used intra-canal dressing, calcium hydroxide (CH). The copaiba oilresin is phitotherapic used by the amazon population wide know by its medicinal. The aim of this study is to evaluate tha antimicrobial action of calcium hydroxide pastes associated to several vehicles, among them the copaiba oilresin, against E. faecalis and C. albicans. The method for evaluation of the antimicrobial activity was de agar diffusion test and the broth dilution test against strains of C. albicans ATCC and E. faecalis ATCC at 3 time intervals (24, 48 and 72 hours). 16 groups were tested: G1 in natura C. multijuga 73 (IN 73); G2 in natura C. multijuga 69 (IN 69); G3 in natura C. reticulata (IN Cr); G4 essential C. multijuga 73 (E 73); G5 essential C. mulitjuga 69 (E69); G6 essential C. reticulata (E Cr); G7 saline solution- SS (negative control); G8 polietileno glicol 400 PEG 400 (negative control); G9 CH+ IN 73; G10 CH+ IN69; G11 CH + PEG 400; G12 CH+ E 73; G13 CH+ E 69; G14 CH + E Cr; G15 CH + SS; G16 CH + IN Cr. G1 through G8 show no effect against the strains in both methods. G9 through G15 were effective against C. albicans in both tests. G9 through G16 show no effect against E. faecalis in the agar diffusion method. G11 through G15 were effective against E. faecalis in broth dilution method. Within the present study experimental conditions, the results allowed the author to conclude that association between calcium hydroxide and several vehicles, among them the copaiba oil and its fractions showed antimicrobial activity against E. faecalis and C. albicans. Key-Words: Copaiba oilresin, calcium hydroxide, endodontic infection

11 LISTA DE FIGURAS Figura 1 Confecção do furo 69 Figura 2 Coleta inicial do óleo-resina 69 Figura 3 Coleta do óleo-resina em um vidro âmbar estéril 69 Figura 4 Vedamento do orifício com madeira 69 Figura 5 Destilação dos óleos in natura 70 Figura 6 Cepa padrão de C.albicans 71 Figura 7 Reativação da cepa padrão 71 Figura 8 Semeadura da cepa padrão reativada em placas de Petri 72 Figura 9 Balança de precisão 75 Figura 10 Escala de McFarland 77 Figura 11 Desenho esquemático da semeadura da suspensão na placa de Petri, em 3 pontos eqüidistantes 77 Figura 12 Desenho esquemático da placa contendo ágar Sabouraud perfurada com 3 orifícios padronizados 78 Figura 13 Placas incubadas em estufa bacteriológica 78 Figura 14 Placas de Petri divididas em quadrantes 83 Figura 15 - Câmara de Neubauer 84 Figura 16 - Detalhe dos Quadrantes da Câmara de Neubauer 84 Figura 17 Teste de difusão dos veículos experimentais 88 Figura 18 Halos de inibição das pastas experimentais frente à C. albicans 91 Figura 19 Teste de difusão para E. faecalis 93

12 LISTA DE GRÁFICOS Gráfico 1 - Curva de crescimento do E.. faecalis 73 Gráfico 2 - Curva de Crescimento da C. albicans 73 Gráfico 3 - Média dos halos de inibição para os grupos experimentais frente à C. albicans em 24 horas 90 Gráfico 4 - Média dos halos de inibição para os grupos experimentais frente à C. albicans em 48 horas 90 Gráfico 5 - Porcentagem de células coradas (não viáveis) e hialinas (viáveis) para cada concentração analisada 99 Gráfico 6 - Porcentagem de células coradas (não-viáveis) e hialinas (viáveis) para cada concentração analisada 99 Gráfico 7 - Porcentagem de células coradas (não-viáveis) e hialinas (viáveis) para cada concentração analisada 100 Gráfico 8 - Porcentagem de células coradas (não-viáveis) e hialinas (viáveis) para cada concentração analisada 100 Gráfico 9 - Porcentagem de células coradas (não-viáveis) e hialinas (viáveis) para cada concentração analisada 101 Gráfico10 - Comparação das porcentagens de células não viáveis (coradas) para cada grupo experimental e suas concentrações 103 Gráfico11 - Comparação das porcentagens de células viáveis (hialinas) para cada grupo experimental e suas concentrações 103

13 LISTA DE QUADROS Quadro 1 Relação entre atividades farmacológicas e constituições químicas da copaíba na literatura 58 Quadro 2 - Indicações etnofarmacológicas dos óleo de copaíba encontradas na literatura 62 Quadro 3 - Indicações etnofarmacológicas dos óleo de copaíba encontradas na literatura (continuação quadro 2) 63 Quadro 4- Quantidade em ml de meio líquido para cada tubo 79 Quadro 5 - Quantidade em ml de substância experimental para cada tubo 80 Quadro 6 Quantidade total de substância (ml) para cada tudo de ensaio 80 Quadro 7 - Concentrações em % para cada tubo de ensaio 80 Quadro 8 - Quantidade em ml de meio de cultura líquido para cada tubo 81 Quadro 9 - Quantidade em g de pó de Ca(OH) 2 pa e veículo em ml para cada tubo 81 Quadro 10 - Concentrações finais em % para cada tubo de ensaio 82 Quadro 11 Quantidade total de susbstâncias experimentais (ml/g/ml) em cada tubo de ensaio 83 Quadro 12 - Teste diluição dos veículos sobre C. albicans em 24 horas 93 Quadro 13 - Teste diluição dos veículos sobre C. albicans em 48 horas 94 Quadro 14 - Teste diluição das pastas sobre C. albicans em 24 horas 94 Quadro 15 - Teste diluição das pastas sobre C. albicans em 48 horas 95 Quadro 16 - Teste diluição dos veículos sobre E. faecalis em 24 horas 96 Quadro 17 - Teste diluição dos veículos sobre E. faecalis em 48 horas 96

14 Quadro 18 - Teste diluição dos veículos sobre E. faecalis em 24 horas 97 Quadro 19 - Teste diluição dos veículos sobre E. faecalis em 48 horas 97 LISTA DE TABELAS Tabela 1 - Medida dos halos de inibição em mm para cada repetição em 24 horas. 86 Tabela 2 - Média dos halos de inibição em mm para cada repetição em 24 horas 86 Tabela 3 - Medida dos halos de inibição em mm para cada repetição em 48 horas 87 Tabela 4. - Média dos halos de inibição em mm para cada repetição em 48 horas 87 Tabela 5 Valores de p-valores da análise de variância; p-valor menor que 0,05 indica significância estatística 88 Tabela 6 - Comparação de médias dos grupos em 24 e 48 horas no teste de difusão para C. albicans 89 Tabela 7 - Medida dos halos de inibição em mm para cada repetição em 24 horas dos veículos 91 Tabela 8 - Medida dos halos de inibição em mm para cada repetição em 24 horas das pastas 92 Tabela 9 - Medida dos halos de inibição em mm para cada repetição em 48 horas dos veículos 82 Tabela 10 - Medida dos halos de inibição em mm para cada repetição em 48 horas das pastas 92 Tabela 11 - ph dos veículos testados 104 Tabela 12 - ph das pastas experimentais 104

15 LISTA DE ABREVIATURAS AIDS Síndrome da Imunodeficiência Adquirida AS Substância de agregação ATCC American Type Culture Collection BHI Brain Heart Infusion C. albicans Candida albicans C. multijuga Copaifera multijuga C. reticulata Copaifera reticulata CaCO 3 Carbonato de Cálcio CaO Óxido de Cálcio Ca(OH) 2 Hidróxido de Cálcio CIM Concentração Inibitória Mínima CBM Concentração Bactericida Mínima CN Controle Negativo CP Controle Positivo DNA Ácido Desoxirribonucléico E. faecalis Enterococcus faecalis Esp Proteína de superfície de Enterococcus FDA Food and Drugs Administration Fiocruz Fundação Oswaldo Cruz g Grama INCQS Instituto Nacional de Controle de Qualidade em Saúde INPA Instituto Nacional de Pesquisa da Amazônia Kg Kilograma LPS Lipopolissacarídeo µl Microlitro μm Micrômetro ml Mililitro mm Milímetro Nm Nanômetro NaCl Hipoclorito de Sódio NOSB National Organic Stardard Board p. a. Pró Análise ph Potencial de Hidrogênio PEG 400 Polietilenoglicol 400 PVC Policloreto de vinila R Resistente rpm Rotações por minutos

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17 LISTA DE SÍMBOLOS α β C Ca δ Alfa Beta Carbono Cálcio Gama Marca Registrada ± Mais ou menos N Nitrogênio # Número

18 1 INTRODUÇÃO 22 2 REVISÃO DA LITERATURA A INFECÇÃO ENDODÔNTICA MICROBIOTA DE INFECÇÕES ENDODÔNTICAS MICRORGANISMOS RESISTENTES À TERAPIA ENDODÔNTICA Enterococcus faecalis Candida albicans MEDICAÇÃO INTRACANAL Características Químicas e Físicas Aplicações das Pastas de Hidróxido de Cálcio Mecanismo de Ação Veículos COPAÍBA Composição Química Biocompatibilidade Propriedades Medicinais Atividade Antiinflamatória Atividade Antimicrobiana 84 3 OBJETIVOS GERAL ESPECÍFICOS 86 4 MATERIAIS E MÉTODOS OBTENÇÃO DO ÓLEO-RESINA Obtenção das Frações REATIVAÇÃO DAS CEPAS PADRÃO LIOFILIZADAS CURVA DE CRESCIMENTO DOS MICRORGANISMOS PREPARO DOS GRUPOS EXPERIMENTAIS Determinação do ph dos grupos experimentais TESTES DE ATIVIDADE ANTIMICROBIANA Preparo do Inóculo Teste de Difusão em Ágar Determinação da Concentração Inibitória Mínima (CIM) Contagem de Células Viáveis e Não Viáveis RESULTADOS TESTE DE DIFUSÃO EM ÁGAR 105

19 5. 2 TESTE DE DILUIÇÃO EM MEIO LÍQUIDO CONTAGEM DE CÉLULAS VIÁVEIS E NÃO-VIÁVEIS PH DOS GRUPOS EXPERIMENTAIS DISCUSSÃO CONCLUSÃO REFERÊNCIAS ANEXOS 160

20 1 INTRODUÇÃO Infecções periapicais de origem endodôntica, resultam da agressão pulpar por bactérias, extremos de temperatura e forças físicas, sendo a mais comum a contaminação bacteriana por lesões de cárie que avançaram através do esmalte e dentina (NISENGARD ; NEWMAN, 1997). Devido ao fato da polpa estar enclausurada entre dentina inextensível, a presença de bactérias e seus antígenos culmina rapidamente em necrose pulpar. Quando a degeneração pulpar ocorre, um grande número de bactérias acumula-se no sistema de canais radiculares, resultando em uma alta concentração de toxinas e enzimas (NISENGARD ; NEWMAN, 1997). Existem diferentes tipos de infecções endodônticas, que geralmente estão associadas à diferentes condições clínicas. A infecção do canal radicular, na maioria das vezes, é a causa primaria de doenças periapicais agudas ou crônicas. Infecções persistentes resultam em sintomatologia, exsudação ou insucesso endodôntico. A composição da microbiota varia, dependendo do tipo de infecção e da lesão perirradicular (SIQUEIRA, 2002). Tais infecções podem ser classificadas como primárias e secundárias (SIREN et a., 1997). A infecção periapical primária é composta de uma variedade de combinações de bactérias, usualmente de 3 a 6 espécies em um único dente infectado. A maioria dessas bactérias é estritamente anaeróbica, juntamente com algumas aeróbicas facultativas como as do gênero Streptococcus. Nas infecções periapicais

21 secundárias, as bactérias anaeróbicas constituem a minoria da microbiota e são isoladas em menor freqüência (SIREN et a., 1997). Segundo Siqueira (2002), infecções radiculares possuem uma microbiota mista, geralmente composta de três a sete espécies bacterianas. Entre os prováveis microrganismos patógenos estão, Porphyromonas endodontalis, Porphyromonas gengivalis, Prevotella intermédia, Prevotella nigrescens, e Actinomyces israelii. (SUNDQVIST, 1994; LANA et al., 2001; KHEMALEELAKUL et al., 2002). Na maioria dos casos, as infecções endodônticas respondem bem ao tratamento convencional. Estudos de acompanhamento de casos mostraram uma taxa de sucesso de 80 a 90% no tratamento quando o canal é devidamente instrumentado, desinfetado e obturado. No entanto, apesar da grande taxa de casos bem sucedidos, ainda se tem de 10 a 20% de lesões periapicais que não respondem bem ao tratamento local. Não se sabe se a falta de resposta dessas lesões periapicais refratárias se deve a inacessibilidade dos microrganismos localizados extrarradicularmente ou a presença de uma microbiota que é diferente da que normalmente é encontrada em infecções endodônticas (SUNDE et al., 2002). As diferenças na composição da flora bacteriana de canais radiculares que respondem bem a terapia endodôntica e aqueles que resistem ao tratamento podem ser devido a alguns fatores: (1) Uma pequena quantidade de bactérias entéricas já está presente no canal infectado no início da terapia e essa proporção aumenta a medida que as outras bactérias são mais suscetíveis ao tratamento; (2) bactérias entéricas penetram no canal radicular durante o tratamento devido ao isolamento inadequado, selamento temporário com infiltração ou pelo conduto ser deixado aberto para drenagem de exsudato (SIREN et al., 1997).

22 Enterococcus faecalis (E. faecalis) e Candida albicans (C. albicans) também podem ser encontrados em canais necrosados, porém eles estão comumente relacionados com casos de insucesso endodôntico, pois possuem a habilidade de utilizar oportunidades criadas quando da remoção de outros micróbios e ainda de crescer em ambientes de baixo teor nutritivo (SUNDQVIST, 1994; CHEUNG et al., 2001; GOMES B. et al., 2002a). E. faecalis é um patógeno oportunista que traz problemas significantes quando encontrado nos canais radiculares, principalmente pelo fato de ser de difícil erradicação e resistente a maioria dos medicamentos utilizados na terapêutica endodôntica (DAHLEN et al., 2000; EVANS et al., 2002; GOMES B. et al., 2002b). Dentre as leveduras encontradas na cavidade oral, o grupo Candida spp. é o predominante, sendo a C. albicans a espécie comumente isolada de canais radiculares (WALTIMO et al., 1999a, WALTIMO et al., 1999b). Em um estudo sobre a ocorrência de C. albicans em infecções endodônticas, Baumgartner et al. (2000) concluíram que tal levedura está freqüentemente associada a infecções radiculares resistentes ao tratamento padrão. A instrumentação, irrigação, aspiração, e obturação do canal radicular, são técnicas endodônticas utilizadas para eliminar os microrganismos e obter a regeneração dos tecidos periapicais. Porém, o tratamento biomecânico de canais necrosados nem sempre é suficiente para a desinfecção do sistema de canais. A quantidade remanescente de bactérias dentro dos túbulos dentinários e ramificações é considerável, e o uso de medicação intracanal é indicado como curativo para eliminar tais microrganismos (FERREIRA et al., 2002). O Hidróxido de cálcio foi inicialmente usado como capeador pulpar por Hermann em 1930 e desde então o seu uso em endodontia vem aumentando. Hoje em

23 dia, é considerado umas das medicações mais versáteis da Odontologia, especialmente pelo seu uso como curativo intracanal (GOMES B. et al., 2002a). As relevantes propriedades químicas e biológicas do hidróxido de cálcio são decorrentes principalmente de sua dissociação em íons hidroxila e cálcio bem como de seu elevado ph, com valores aproximados de 12,6 (ESTRELA; HOLLAND, 2003). Para ser empregado como medicamento intracanal, o hidróxido de cálcio precisa de um veículo para confecção de uma pasta que irá ser introduzida no conduto. O veículo utilizado para a confecção da pasta é sem dúvida, um fator determinante no processo de liberação iônica, pois pode mediar a velocidade de solubilização da mistura, orientando a sua rápida ou lenta reabsorção (ESTRELA et al., 1999a). Dentre outros veículos podem-se listar os seguintes: soro fisiológico, glicerina, polietileno glicol, paramonoclorofenol canforado, óleo de oliva e óleo de copaíba (FAVA; SAUNDERS, 1999; BANDEIRA et al., 1999a). Apesar de suas excelentes propriedades terapêuticas, alguns microrganismos, dentre eles E. faecalis e C. albicans, são resistentes à ação do hidróxido de cálcio, principalmente no que diz respeito ao crescimento em ph alcalino, pois tais patógenos são capazes de sobreviver em ph acima de 10 (WALTIMO et al., 1997; WALTIMO et al., 1999a; WALTIMO et al., 1999b; EVANS et al., 2002; GOMES B. et al., 2003b). O óleo de copaíba é um produto patológico do tronco de árvores conhecidas como copaibeiras, encontradas em regiões tropicais da América do Sul, como Brasil, Venezuela e Colômbia, com maior incidência no Brasil, onde apresenta ampla distribuição na terra firme da Amazônia (BRITO M. et al., 2001; VEIGA JUNIOR et al., 2001; VEIGA JUNIOR; PINTO, 2002).

24 Bandeira et al. (1999b) relataram que esse óleo-resina tem sido usado pelas populações amazônicas desde muito tempo, devido as suas propriedades medicinais. Assim, é empregado como antiinflamatório, anestésico, antisséptico, cicatrizante, entre outros. Bandeira et al. (1999c), avaliaram a atividade antibacteriana do óleo essencial e da resina da Copaifera multijuga, tendo em vista as propriedades medicinais deste óleo. Confeccionaram pastas de hidróxido de cálcio ou óxido de zinco associados ao óleo essencial ou a resina. Os autores concluíram que as pastas experimentais de hidróxido de cálcio e óxido de zinco associados ao óleo essencial ou resina apresentaram atividade antibacteriana frente ao Streptococcus mutans; o óleo de copaíba foi bacteriostático e bactericida e a resina foi bacteriostática frente ao Streptococcus mutans. Tendo como base as propriedades medicinais do óleo de copaíba e os resultados encontrados por Bandeira et al. (1999a) e Simões (2004) quanto a atividade antibacteriana, propõe-se aqui, a avaliação da atividade antibacteriana do hidróxido de cálcio associado a vários veículos, entre eles o óleo de Copaifera multijuga, frente a microrganismos encontrados em infecções endodônticas, em particular as espécies resistentes à terapia endodôntica convencional.

25 2 REVISÃO DA LITERATURA 2.1 A INFECÇÃO ENDODÔNTICA Existem diferentes tipos de infecção endodôntica, as quais estão normalmente associadas com diferentes condições clínicas. A infecção do canal radicular é a primeira causa de doença perirradicular aguda ou crônica. Infecções secundárias ou persistentes são a causa de lesões perirradiculares secundárias ou crônicas, as quais podem resultar em sintomatologia persistente, exsudação ou fracasso do tratamento endodôntico (SIQUEIRA, 2002). A infecção primária do canal radicular é causada por microrganismos que colonizam o tecido pulpar necrótico. A microbiota envolvida geralmente muda dependendo do tempo de infecção. Além disso, tem sido fortemente sugerido que a microbiota pode variar de acordo com o tipo de doença perirradicular. Enquanto que em lesões perirradiculares grandes há uma enorme variedade de espécies microbianas, um grupo mais restrito de espécies está associado com lesões perirradiculares sintomáticas tais como as periodontites apicais agudas e os abscessos periapicais agudos (BAUMGARTNER; FALKER.; 1991; SUNDQVIST, 1994; WALTIMO et al., 1997; SIQUEIRA et al., 2000; SIQUEIRA et al., 2001). No geral, as infecções primárias são mistas e as bactérias anaeróbias predominam, entre elas podem-se citar os seguintes gêneros: Bacteroides, Porphyromonas, Prevotella, Fusobacterium, Treponema, Peptostreptococcus,

26 Eubacterium e Campylobacter. Estreptococcus facultativos ou microaerofílicos também são comumente encontrados em infecções primárias (SIQUEIRA, 2002). Infecções intrarradiculares secundárias são causas por microrganismos que não estavam presentes na infecção primária e que penetraram no sistema de canais radiculares durante o tratamento, entre as sessões, ou após a conclusão do tratamento endodôntico. Se os microrganismos que penetraram conseguem sobreviver e colonizar o sistema de canais radiculares, então se estabelece uma infecção endodôntica secundária (SIREN et al., 1997; SIQUEIRA, 2002). Microrganismos que de alguma maneira resistem aos procedimentos de desinfecção intra-canal causam infecções perirradiculares persistentes. Os microrganismos causais são membros ou da infecção primária ou da infecção secundária (SIQUEIRA, 2002). Influências ambientais agem no sistema de canais radiculares durante e depois do tratamento e podem auxiliar certos microrganismos a sobreviver. Conseqüentemente, as poucas espécies microbianas que possuem tal habilidade podem estar envolvidas no insucesso dos tratamentos endodônticos (SIQUEIRA, 2002). A microbiota envolvida com infecções secundárias persistentes é usualmente composta de uma única espécie ou pelo menos por um baixo número de espécies quando comparadas com infecções primárias. Bactérias gram-positivas são as predominantes (SIREN et al., 1997; SUNDQVIST et al., 1998; PECIULIENE et al., 2000). Fungos também podem ser encontrados em uma taxa significativamente mais alta do que em infecções primárias (NAIR et al., 1990; WALTIMO et al., 1997; SUNDQVIST et al., 1998). Infecções extrarradiculares podem ser primárias, secundárias ou persistentes. São causadas geralmente por uma infecção intrarradicular anterior. O

27 abscesso perirradicular agudo é a forma mais comum de infecção extrarradicular (SIQUEIRA, 2002). A invasão da polpa só ocorre após a necrose tecidual. Conseqüentemente, a necessidade dos microrganismos possuírem fatores de virulência é mínima. Isso é demonstrado pelo fato de que a maioria dos microrganismos orais que invadem o tecido pulpar necrosado é constituída de patógenos oportunistas (SIQUEIRA, 2002). A sobrevivência no tecido pulpar necrosado para os microrganismos invasores não é difícil inicialmente, pois existem nutrientes em abundância e poucos mecanismos de defesa do hospedeiro no meio. Com o decorrer do tempo, pressões seletivas começam a agir dentro do sistema de canais radiculares, dentre elas estão tensão de oxigênio, potencial redox, ph, temperatura e tipo de nutrientes disponíveis. Apenas as espécies microbianas que são capazes de se adaptar às condições ambientais do sistema de canais radiculares sobreviverão e se estabelecerão. Interações microbianas ulteriores, sejam elas positivas ou negativas, irão influenciar a composição final da microbiota das infecções endodônticas (SIQUEIRA, 2002). 2.2 MICROBIOTA DE INFECÇÕES ENDODÔNTICAS Mais de 300 espécies de bactérias são reconhecidas como habitantes normais da cavidade oral. Toda bactéria que normalmente habita a cavidade bucal pode, teoricamente, invadir o sistema de canais radiculares durante de depois da necrose pulpar, para participar na infecção endodôntica e, por fim, penetrar nos tecidos periapicais (SUNDQVIST, 1992b; SUNDQVIST, 1994).

28 As bactérias presentes nas infecções radiculares incluem um grupo restrito de espécies comparadas com o total da microbiota da boca. A maioria das espécies encontradas nas infecções endodônticas tem sido também isoladas de bolsa periodontais, no entanto a flora microbiana do canal radicular não é tão complexa quanto a da gengiva (SUNDQVIST, 1992b). Isso significa que pressões seletivas operam favorecendo o desenvolvimento de certas bactérias enquanto outras não conseguem sobreviver (SUNDQVIST, 1994). Segundo Siqueira (2002), os seguintes requisitos são necessários para um determinado microrganismo se estabelecer no sistema de canais radiculares e posteriormente participar da patogênese da infecção endodôntica: 1. O microrganismo deve estar presente em número suficiente para iniciar ou manter a infecção; 2. O microrganismo deve possuir uma gama de fatores de virulência que devem se expressar durante a infecção do canal radicular; 3. O microrganismo deve estar localizado espacialmente dentro do canal radicular para que ele ou seus fatores de virulência possam ter acesso aos tecidos perirradiculares; 4. O ambiente do canal radicular deve permitir a sobrevivência e o crescimento do microrganismo e prover sinais e avisos que estimulem a expressão dos genes de virulência; 5. Microrganismos inibitórios devem estar ausentes ou em pequenas quantidades no sistema de canais radiculares; 6. O hospedeiro deve montar uma estratégia de defesa nos tecidos perirradiculares, inibindo a propagação da infecção. Esse processo resultará em dano tecidual.

29 As infecções primárias geralmente são compostas de uma microbiota mista onde predominam as bactérias anaeróbicas gram-negativas (FABRICIUS et al., 1982; BAUMGARTNER; FALKER, 1991; SUNDQVIST, 1992b; SUNDQVIST, 1994; ASSED et al., 1996; LANA et al., 2001; SIQUEIRA, 2002; KHEMALEELAKUL et al., 2002; SIQUEIRA et al., 2002d; JACINTO et al., 2003; SIQUEIRA; RÔÇAS, 2005). Os gêneros predominantes são: Bacteroides, Porphyromonas, Prevotella, Fusobacterium, Treponema, Peptostreptococcus, Eubacterium e Campylobacter. Estreptococos facultativos e microaerofílicos também são comumente encontrados (SIQUEIRA, 2002) 2.3 MICRORGANISMOS RESISTENTES À TERAPIA ENDODÔNTICA As diferenças na composição da microbiota endodôntica em casos que respondem bem à terapia endodôntica e em casos de infecção persistente e lesão periapical podem ser devido aos seguintes fatores: 1. Uma pequena quantidade de bactérias entéricas já está presente no canal infectado no começo da terapia e a sua proporção aumenta relativamente durante o tratamento devido à suscetibilidade das outras espécies à terapia; 2. Bactérias entéricas penetram no canal radicular durante o tratamento em decorrência de: isolamento absoluto inadequado, selamento temporário infiltrado, ou canal sem selamento temporário para drenagem de exsudato (SIREN et al., 1997). As infecções secundárias e persistentes são na maioria das vezes causadas por bacilos gram-negativos entéricos como Enterobacter sp. e Klebsiela sp.,

30 Pseudomonas ou bactérias gram-positivas facultativas como os Actinomyces spp. (SIREN et al., 1997; FIGDOR; DAVIES, 1997; HIRSHBERG et al., 2003). E. faecalis e C. albicans são freqüentemente encontrados em casos de insucesso endodôntico e em infecções resistentes à terapia endodôntica convencional (WALTIMO et al., 1997; SUNDQVIST et al., 1998; MOLANDER et al, 1998; WALTIMO et al., 1999a, WALTIMO et al., 1999b; DAHLÈN et al., 2000; SIQUEIRA et al., 2004; RÔÇAS et al., 2004a, RÔÇAS et al., 2004b), Enterococcus faecalis Segundo Rince et al. (2000), a primeira descrição oficial do gênero Enterococcus foi relatada por Thiercelin em 1899, o qual descreveu uma bactéria grampositiva de origem intestinal, com forma esferoidal e arranjada a forma de diplococos. Essa bactéria foi chamada de Enterococcus que deriva da palavra Grega Enteron` ou intestino. Os enterococos constituem um importante grupo de microrganismos que se destacam, cada vez mais, como patógenos oportunistas cujas biologia e taxonomia têm passado por significativas alterações nos últimos anos. Considerados, por longo tempo, como uma das categorias de estreptococos possuidores de antígeno do grupo D, esses microrganismos são diferenciados das espécies do grupo D não-enterococos (Streptococcus bovis) com base em características fisiológicas e de susceptibilidade a antimicrobianos. De acordo com Trabulsi et al. (2002), são conhecideas 19 espécies desse gênero. No entanto, Klein (2003) relatou que atualmente 26 espécies já foram catalogadas entre as quais se destacam: Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium, Enterococcus durans, Enterococcus gallinarum, Enterococcus casseliflavus,

31 Enterococcus avium, Enterococcus malodoratus, Enterococcus mundtii (TRABULSI et al., 2002). Enterococos são cocos gram-positivos que podem se dispor sozinhos, em pares ou em cadeias pequenas. Eles são anaeróbios facultativos, apresentam um metabolismo fermentativo onde convertem carboidratos em ácido lático. São usualmente considerados estritamente fermentadores em decorrência da ausência do ciclo de Krebs na cadeira respiratória. Também produzem um grande número de oxigênio extracelular, sendo uma das poucas bactérias a fazê-lo. Enterococos são geralmente calatase-negativos. Podem crescer em temperaturas que variam de 10 0 C a 52 0 C, se desenvolvem em ambientes hipotônicos, hipertônicos, ácidos ou alcalinos (ph superior a 9,6) e crescem na presença de 6,5% de hipoclorito de sódio (NaCl) (HUYCKE et al., 1998; RINCE et al., 2004a) Enterococos são comensais comuns dos seres humanos e geralmente apresentam-se adaptados aos ambientes ecologicamente complexos, ricos em nutrientes e esgotados de oxigênio que são encontrados na cavidade oral, no trato gastro-intestinal e na mucosa vaginal (LOVE, 2001). Os enterococos são amplamente distribuídos na natureza e participam da microbiota normal do homem e de animais, particularmente, em nível do trato intestinal. Por outro lado, sua participação como agentes etiológicos de infecções humanas e animais é amplamente documentada. Em seres humanos, eles são freqüentemente isolados, em cultura pura ou mista, a partir de infecções clinicamente significativas, tais como bacteremias acompanhadas ou não de endocardite --, infecções dos tratos urinários e biliar, infecções de feridas e infecções pélvicas e intra-abdominais (LOVE, 2001; TRABULSI et al., 2002).

32 Bactérias da espécie Enterococcus faecalis (E. faecalis) estão presentes em alta concentração nas fezes e são expelidas em grande quantidade no meio ambiente. Diante da sua capacidade de sobreviver em uma extensa variação de ph, temperatura e concentrações de sais, E. faecalis está a altura de condições moderadas de estresse e pode ser encontrado na água e em produtos alimentícios (RINCE et al., 2000). Esses microrganismos também são responsáveis por infecções do sistema de canais radiculares, no entanto, eles constituem apenas uma pequena porção da flora microbiana inicial das infecções endodônticas, sendo as espécies gram-negativas as de maior proporção (SUNDQVIST, 1992b; LOVE, 2001). Em contraste, tem sido relatado o freqüente isolamento de enterococos em dentes tratados endodonticamente e que apresentam patologia periapical crônica (SUNDQVIST et al., 1998; MOLANDER et al, 1998.). Acredita-se que diversas condições favoreçam a patogenicidade dos enterococos, contribuindo para a sua atuação como patógenos oportunista. Entre essas estão imunossupressão, a pré-existência de determinadas doenças subjacentes e a antibioticoterapia de amplo espectro. Esses microrganismos são intrinsecamente resistentes ou moderadamente resistentes a vários agentes antimicrobianos comumente utilizados, tais como clindamicina, aminoglicosídeos, e betalactâmicos (TRABULSI et al., 2002). E. faecalis, a qual é responsável por 80-90% das infecções enterocócicas humanas, é a espécie dominante do gênero (SUNDQVIST et al., 1998; MOLANDER et al, 1998.) e é comumente a única espécie encontrada em canais obturados endodonticamente (SUNDQVIST et al., 1998; DAHLÈN et al., 2000). Esses fatos indicam que esse microrganismo desempenha um papel patogênico em casos de insucesso endodôntico (LOVE, 2001).

33 E. faecalis é um coco gram-positivo, anaeróbio facultativo, fermentativo e não forma esporos. Suas células são ovóides e tem diâmetro de 0,5 a 1 µm. Dispõem-se sozinhas, em pares ou em cadeias curtas, e são freqüentemente alongadas na direção da cadeia. A maioria das cepas são não-hemolíticas e não apresentam mobilidade (RÔÇAS et al., 2004a) Virulência Alguns autores sugerem que a virulência do E. faecalis pode estar relacionada à resistência aos medicamentos intra-canais e a uma habilidade de sobreviver no sistema de canais radiculares sem necessitar do auxílio de outras bactérias (HAAPASALO; ØRSTAVIK, 1987; LOVE, 2001). Segundo Rôças et al. (2004a), o principal envolvimento do E. faecalis com casos de doença perirradicular assintomática apóia a suposição que os enterococos são em geral, microrganismos de virulência não tão alta, e o seu aparecimento como patógenos pode estar muito mais relacionado a sua resistência a uma gama de agentes antimicrobianos do que a alta virulência. Os autores concluíram que o E. faecalis é significativamente mais associado a casos de infecção endodôntica assintomática do que casos sintomáticos esses achados estão de acordo com as observações de Molander et al. (1998) e Peciuliane et al. (2001). E. faecalis possui a habilidade de invadir os túbulos dentinários e é provável que células bacterianas dentro dos túbulos que, tenham sobrevivido ao preparo biomecânico e a medicação intra-canal, possam colonizar os canalículos dentinários e reinfectar o canal já obturado. Para que isso ocorra as células teriam que se adaptar ao

34 suprimento nutricional alterado e serem capazes de crescer dentro dos túbulos (LOVE, 2001). Essas bactérias possuem um número de fatores de virulência que podem permitir a invasão dentinária, sendo eles: aderência às células do hospedeiro; expressão de proteínas para a garantia da sobrevivência celular como um resultado de um suprimento nutricional alterado; a habilidade de competir com outras células bacterianas e alterar a resposta do hospedeiro e do meio ambiente (XIAO et al., 1998; LOVE, 2001; KOCH et al., 2004). Apesar da constituição do fluido dentinal em dentes despolpados ainda não ter sido elucidada, é provável que ele seja constituído de fluido intersticial originário do osso alveolar e do ligamento periodontal, e dessa forma assemelhar-se ao soro sanguíneo. É possível que esse fluido possa sustentar as células dentro dos túbulos dentinários e permitir que elas perpetuem a infecção (LOVE, 2001). As condições para a presença e crescimento bacteriano em dentes obturados endodonticamente são completamente diferentes daquelas encontradas nas infecções primárias. A carência de nutrientes e a presença de agentes antimicrobianos podem reduzir ou eliminar as cepas bacterianas sensíveis, enquanto espécies mais resistentes, tais como os Enterococcus, são capazes sobreviver. A influência de tais bactérias por longos períodos de tempo pode induzir ou manter uma lesão periapical (DAHLÈN et al., 2000). Figdor et al., (2003), estudando a sobrevivência, o crescimento e a recuparação do E. faecalis em soro humano, concluíram que esse microrganismo é capaz de resistir a longos períodos de inanição e as células inanes podem se recuperar se soro humano estiver presente. Se o E. faecalis tiver acesso até mesmo a pouca

35 quantidade de soro humano ou fluido semelhante, mesmo uma pequena quantidade de células pode obter o suporte nutricional adequado para a sobrevivência. Fatores de virulência em potencial de interesse incluem aqueles que promovem a adaptação e a sobrevivência em diferentes condições ambientais, tais como proteína de superfície de enterococcus (Esp) e substância de agregação (AS), e fatores que possibilitam a secreção de toxinas (citolisinas) e proteases (gelatinase) (SEDGLEY et al., 2005). Sedgley et al., (2005) identificaram fatores de virulência, especialmente a produção de gelatinase e a resposta a ferormônios em 33 linhagens de Enterococcus sp. isolados de infecção endodônticas Prevalência em Infecções Endodônticas A microbiota endodôntica de dentes com polpa morta é mista, com predomínio de anaeróbios, e apresenta uma grande capacidade de induzir lesões perirradiculares. Porém, apenas algumas bactérias anaeróbias conseguem sobreviver em cultura pura nos canais radiculares. Ao contrario, E. faecalis tem demonstrado ser capaz de sobreviver nos canais radiculares em cultura pura (FABRICIUS et al., 1982; RIBEIRO-SOBRINHO et al., 1998). Peciuliene et al. (2000) pesquisaram a ocorrência de E. faecalis em pacientes Lituanos submetidos a retratamento endodôntico e observaram que os resultados obtidos demonstraram claramente que essa bactéria gram-positiva é a espécie predominante em casos de insucesso endodôntico nessa população. Ela estava presente em 70% (14:20) das culturas positivas, e com exceção de dois casos, era o principal componente da flora microbiana.

36 Sundqvist et al. (1998) analisaram a microbiota de 54 insucessos endodônticos e verificaram que em nove casos (38%) o E. faecalis foi o único microrganismo encontrado. De acordo com os autores, esse fato sugere que essa bactéria vem a ser um importante agente nos casos de tratamentos endodônticos mal sucedidos. A presença freqüente do E. faecalis em canais cujo tratamento endodôntico fracassou é marcante. Esse microrganismo não é isolado comumente em infecções endodônticas primárias e, quando presente, geralmente encontra-se em pequenas quantidades, pois as condições ecológicas disponíveis nessa etapa da infecção do sistema de canais radiculares não são favoráveis ao seu crescimento (SUNDQVIST et al., 1998). Rôças et al. (2004a), em estudo sobre a associação do E. faecalis em diferentes formas de doença perirradicular, observaram que esse microrganismo aparece aproximadamente nove vezes mais em casos de insucesso endodôntico do que em casos de infecção primária. Segundo os autores, isso sugere que essa espécie pode ser inibida por outros membros da flora microbiana mista encontrada comumente em infecções primária. E. faecalis, na maioria das vezes, penetra nos condutos radiculares durante o tratamento. Quando está presente em pouca quantidade inicialmente, ele pode ser geralmente eliminado; no entanto, uma vez estabelecido no sistema de canais radiculares, torna-se um organismo difícil de erradicar (SUNDQVIST et al., 1998). Siren et al. (1997) analisaram a relação entre achados microbiológicos e procedimentos clínico nos tratamentos endodônticos realizados por clínicos gerais na Finlândia e encontraram 34 casos onde E. faecalis e/ou outras bactérias facultativas entéricas foram estavam presentes. O E. faecalis foi o achado mais comum entre as

37 bactérias entéricas (24 de 34 casos) e em 33% dos casos onde foi isolado, este aparecia como monoinfecção. Molander et al. (1998) examinaram a condição microbiológica de 100 dentes, com canais previamente obturados e apresentando lesões periapicals visíveis radiograficamente. As espécies mais freqüentemente isoladas pertenciam ao gênero Enterococcus que foram encontradas em 47% das amostras infectadas (32:68). Gomes et al. (2000) investigaram a flora microbiana intrarradicular de dentes indicados para retratamento endodôntico, em virtude da persistência de lesão periapical. Dos 28 dentes selecionados, 75% abrigavam microrganismos no interior do canal radícula, sendo esta infecção constituída por 1 ou 2 espécies bacterianas. Os gêneros mais freqüentemente encontrados foram Streptococcus (32,1%), Enterococcus (17,9%), Peptostreptococcus e Actinomyces (10,7%) e Prevotella (7,1%). Os autores observaram que a microbiota nestes casos estava representada, principalmente, por bactérias gram-positivas anaeróbias facultativas. Peciuliene et al. (2001) isolaram E. faecalis de 22 dentes de um total de 33 (64%) em um estudo sobre a ocorrência de bactérias entéricas e leveduras em casos de insucesso endodôntico. Siqueira et al. (2004), analisando a ocorrência de várias espécies microbianas em casos de insucesso endodôntico e utilizando PCR (Polimerase Chain Reaction) para a identificação, observaram que todos os casos estudados foram positivos para cultura microbiana e que o microrganismo de maior prevalência foi o E. faecalis. Vários estudos têm relatado que dentes tratados endodonticamente e com lesões perirradiculares persistentes usualmente abrigam uma ou poucas espécies

38 bacterianas e que a flora dominante é de espécies gram-positivas (SUNDQVIST et al., 1998; HANCOCK et al., 2001) Resistência à Terapia Endodôntica Quando E. faecalis é isolado em casos de insucesso endodôntico, ele é difícil de ser erradicar durante o retratamento e a taxa de falha nesses casos é maior do que em casos onde esse microrganismo não está presente (SUNDQVIST et al., 1998). Uma vez estabelecido no sistema de canais radiculares, o E. faecalis enfrenta vários desafios para sobreviver, incluindo a habilidade de resistir aos agentes antimicrobianos usados durante o tratamento e suportar a inanição quando da limpeza e obturação dos canais (EVANS et al., 2002). E. faecalis aparentemente é altamente resistente aos medicamentos usados durante o tratamento e resiste à ação antimicrobiana dos curativos de demora a base de hidróxido de cálcio (HAAPASALO; ØRSTAVIK, 1987; TANRIVERDI et al., 19997; WALTIMO et al., 1999b). Pouco se sabe sobre os mecanismos de sobrevivência do E. faecalis que permitem a sua tolerância ao hidróxido de cálcio. Geralmente, quando uma bactéria encontra-se em uma situação adversa ou potencialmente letal, uma resposta de estresse é arquitetada para que ela tolere a ameaça, sobreviva e se recupere. Essa resposta tem sido observada em uma grande variedade de situações de estresse e, em algumas espécies bacterianas, essa resposta adaptativa pode contribuir para a patogenicidade. Uma resposta de estresse pode conferir uma proteção contra outras formas de estresses, como por exemplo, quando uma resposta adaptativa é provocada pela falta de nutrientes, acaba gerando uma proteção contra estresse provocado pelo calor. O E.

39 faecalis é capaz de sintetizar uma variedade de proteínas de estresses quando exposto a condições ambientais desfavoráveis como alta concentração de sais, sais biliares, ácido, calor, carência de glicose, hipoclorito de sódio e inanição em água de torneira (EVANS et al., 2002). Outro mecanismo que confere uma alta resistência ao E. faecalis em ambientes altamente alcalinos é a bomba de prótons, a qual conduz prótons para dentro da célula e acidifica o citoplasma. Esse sistema tem um papel crítico na sobrevivência do microrganismo em ph alcalino. No entanto, quando a alcalinidade do meio atinge um ph 11.5 ou acima disso, esse mecanismo não consegue desempenhar sua função (EVANS et al., 2002). Evans et al. (2002) investigaram a resposta de estresse do E. faecalis a agentes antimicrobianos pela exposição de células a concentrações sub-letais de hipoclorito de sódio e hidróxido de cálcio. Os autores acreditavam que, em razão da terapia endodôntica envolver o uso da solução de hipoclorito de sodio e do hidróxido de cálcio repetidas vezes e em vários estágios do tratamento, o E. faecalis seria exposto a um ph alcalino sub-letal. Essas condições poderiam adaptar ou pré-tratar as células bacterianas pela indução de uma resposta de estresse que ajudaria na sua sobrevivência. Conseqüentemente, seria razoável suspeitar que a repetida exposição do E. faecalis à solução de hipoclorito de sódio e ao hidróxido de cálcio induziria à resistência a subseqüentes exposições a essas substâncias em concentrações que normalmente seriam letais. No entanto, os resultados do experimento mostraram que o pré-tratamento pelo hidróxido de cálcio e hipoclorito de sódio é de menor importância na habilidade do microrganismo de sobreviver na alta alcanilidade do Ca(OH) 2. Evans et al. (2002) ainda observaram que o E. faecalis sobrevive à terapia com hidróxido de cálcio quando o ph for menor ou igual a 11.1.