Miostatina: Terapia Genética e Doping

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1 Miostatina: Terapia Genética e Doping Sérgio R. S. Veloso Faculdade de Ciências da Universidade de Lisboa srsveloso@gmail.com O doping acompanha lado a lado a evolução da biomedicina e os avanços recentes em terapia genética abrem novas portas a quem procura melhorar o desempenho atlético e driblar os métodos de controlo, sendo a Miostatina um meio promissor para esse objectivo. A Miostatina é um inibidor sintetizado no músculo-esquelético que actua de forma endócrina e parácrina na regulação da miogénese e proliferação/diferenciação de células satélite. É um mecanismo altamente regulado e conservado entre espécies, sublinhando o seu importante papel biológico. Diversas terapias promissoras têm sido estudadas para o tratamento de miopatias, especialmente a distrofia Muscular e sarcopenia, com potencial aplicação também na obesidade e intolerância à glicose. No entanto, a aplicação terapêutica está ainda na sua infância, com questões importantes por resolver. Apesar do conhecimento actual ser ainda superficial, as observações e resultados preliminares são tentadores para a optimização artificial de atletas. Índice 1. Introdução Miostatina Função Biossíntese e Mecanismos de Sinalização Celular Regulação Inibição da Proliferação de Mioblastos e Células Satélite Resposta à Estimulação Mecânica Um Caso Humano Terapia Genética Aplicações Terapêuticas Distrofia Muscular e Sarcopenia Catabolismo Induzido por Glucocorticóides Perda de Massa Muscular Associada à SIDA Pág. 1

2 Obesidade e Intolerância à Glicose MYO O Doping Genético A Miostatina e o Doping Detecção Riscos da Terapia Genética Considerações Finais Referências Introdução Doping é definido como o uso de fármacos ou outros métodos de forma ilegal para aumento de performance física ou psíquica em qualquer actividade (Unal and Unal 2004). A utilização de substâncias dopantes para caça ou combate não é prática recente com referências históricas em várias civilizações do passado. É conhecida a relevância do desporto na Grécia antiga, onde os atletas vencedores dos Jogos Olímpicos eram elevados à classe de heróis. Platão, ele próprio bicampeão Olímpico de pankration, reconheceu que as honras e recompensas pelo sucesso desportivo levariam à corrupção do corpo e mente do atleta (Platão 2005). Já nessa altura, eram recomendadas fórmulas para melhorar o desempenho, como testículos de ovinos e cão ou ginseng (Higgins 2006). É de notar já uma ligação empírica entre a testosterona e a performance desportiva. A ingestão de pedras retiradas do estômago dos vencedores de lutas de galos e urina de animais fortes é entendida como uma tentativa de adquirir os seus altos níveis da hormona (Diamandopoulos 2005). Com o passar dos anos, o treino tornou-se mais especializado com treinadores e fisiólogos a controlar a alimentação e suplementação dos atletas. Desde a descoberta da síntese química da testosterona em 1935 (Butenandt and Hanisch 1935), têm aparecido vários esteróides anabolizantes seus derivados, com diferentes graus de androgenicidade e anabolismo (Hartgens and Kuipers 2004). Mais recentemente, o uso de hormonas peptídicas, nomeadamente Hormona do Crescimento, IGF-1 e Eritropoetina, têm ganho relevância. No entanto, a necessidade de driblar os rigorosos controlos anti-dopagem vigentes hoje em dia levou a uma nova abordagem, a terapia genética. O doping genético é entendido como o uso para fins não terapêuticos de genes ou células manipuladas com potencial de aumento da capacidade física ou mental do atleta (Unal and Unal 2004; WADA 2008), incluído desde 2003 na lista de substâncias e métodos Pág. 2

3 banidos pela Agência Mundial Anti-Dopagem (WADA 2008). Acredita-se que o doping genético possa ser a plataforma de lançamento para um programa de melhoramento genético (Schneider and Friedmann 2006), na selecção de determinados caracteres físicos e intelectuais, com potencial impacto na sociedade e na própria evolução da espécie. Tratase de um assunto sério com implicações éticas, morais e biológicas, com necessidade de regulamentação e implementação de medidas preventivas (Baoutina et al. 2007). Existem vários genes humanos cuja manipulação da expressão, localizada ou sistémica, poderá aumentar a performance atlética. Entre eles merecem destaque os elementos codificantes da Hormona do Crescimento, Eritropoetina, IGF-1 e PPAR-δ, revistos em outros trabalhos (Baoutina et al. 2007; Sweeney 2004; Unal and Unal 2004). Em 1997 foi descoberto o papel de regulação da Miostatina no tecido muscular esquelético (McPherron et al. 1997) e desde então vários estudos têm revelado o seu potencial terapêutico na distrofia muscular e efeitos fisiológicos tentadores para aqueles que procuram ganhar vantagem desportiva por meios ilícitos. Este trabalho pretende rever e compilar o conhecimento actual sobre a manipulação génica da miostatina, abordando aplicações clínicas, papel fisiológico do factor, potencial como agente dopante e riscos associados à reprogramação do alicerce da biologia humana, o nosso DNA. 2. Miostatina O processo de regeneração de tecidos e órgãos há muito que intriga a comunidade cientifica. Segundo a lenda, Prometeus roubou o fogo dos deuses e, como castigo, Zeus ordenou que fosse acorrentado a uma pedra onde, todas as manhãs, uma águia lhe comia parte do fígado. À noite, a porção devorada crescia novamente. Apesar de o processo regenerativo de certos órgãos estar bem documentado, existem questões ainda em debate. Como é que o corpo sabe que perdeu parte da estrutura? Quais os sinais que o levam a parar o processo de regeneração quando o órgão atinge o tamanho original? É evidente que terão de existir processos reguladores já que o tamanho os órgãos se mantém constante entre indivíduos e relativo ao tamanho do animal. Uma possível explicação surgiu à mais de 30 anos por Bullough, especulando sobre a existência de agentes inibidores secretados pelos tecidos que impediam o seu próprio crescimento (Bullough 1965). Apesar de várias tentativas para identificar estas moléculas, nenhuma prova da sua existência foi encontrada, até 1997, o ano em que uma equipa norte-americana descobriu a Miostatina (McPherron et al. 1997). McPherron e seus colaboradores, ao procurarem novos elementos aparentados a Transforming Growth Factors-β (TGF-β), identificaram por PCR uma nova sequência em Pág. 3

4 ratos, à qual chamaram Growth/Diferentiation Factor-8 (GDF-8), encontrada posteriormente em outras espécies animais e apelidada Miostatina (McPherron et al. 1997). Em humanos, o seu gene (Mstn) pertence ao cromossoma 2q.32.2, de apenas 7,7kb organizados em 3 exões e 2 intrões transcritos num único mrna de 3,1kb, codificante de um péptido de 375 aminoácidos (Fig.1) (Gonzalez- Cadavid et al. 1998). Esta proteína primária apresenta uma sequência sinal na região N-terminal, necessária para processamento e secreção, seguida de um Fig.1 Representação esquemática de Mstn e proteína (Patel, 2005) própetido (fragmento-lap, Latency Association Protein) e de uma região de 12kDa C- terminal (Patel and Amthor 2005). Este precursor sofre clivagem, folding e dimerização, após os quais o fragmento-lap continua agregado à porção C-terminal, induzindo um estado latente biologicamente inerte (Wolfman et al. 2003). Como é norma na família TGF-β, a Miostatina aparenta ser bastante conservada entre espécies, com 100% de homologia na região C-terminal entre humanos, ratos, porcos e galinhas (McPherron and Lee 1997). É interessante notar como um gene não essencial à reprodução se manteve inalterado na evolução, denotando a importância da sua função biológica Função Após identificação e caracterização do GDF-8, o passo seguinte era conhecer a sua função. Para tal, foi deletada toda a região C-terminal em ratos (ratos KO), criando mutantes nulos constitutivos para o gene da miostatina (McPherron et al. 1997). Em comparação com o genótipo selvagem e heterozigótico, os mutantes homozigóticos eram 30% mais pesados, com desenvolvimento muscular marcado, especialmente na zona escapular e pélvica, músculo esse responsável por toda a diferença de peso verificada (Fig.2) (McPherron et al. 1997). Análise histológica revelou que este aumento ocorreu tanto por hipertrofia como por hiperplasia, com um aumento do número de fibras (86% no tibialis cranialis), quantidade de DNA (aproximadamente 50% superior), e um aumento de 49% da área transversal das fibras no gastrocnemius (McPherron et al. 1997). Fig.2 Membro posterior. Sup - genótipo selvagem; Inf. mutante. (McPherron et al., 1997) Pág. 4

5 Apesar de se conhecer já grande homologia da miostatina entre espécies, não se sabia se a sua função era conservada e se os seus efeitos no rato eram semelhantes em outros modelos. Crescimento muscular anormal em gado está documentado há pelo menos 200 anos. O fenótipo da raça Belgian Blue (Fig.3) é semelhante ao de ratos KO para Miostatina tendo sido encontrada uma delecção de 11 nucleótidos no gene, resultando numa proteína truncada na zona C-terminal, não funcional (McPherron and Lee 1997). Concordante com a conservação de função e sequência, este gene está presente no cromossoma 2 de Belgian Blue, numa região sinténica à 2q32 em Fig.3 Bovino Belgian Blue (Sweeney, 2004) humanos, onde se mapeou Mstn (McPherron and Lee 1997). Nishi et al. estudaram o efeito de duas mutações bovinas distintas do gene (raça Belgian Blue e Piedmontese) em ratos, concluindo que o processo de aumento muscular é diferente consoante a mutação, hiperplasia em mutação missense (Piedmontese) e hipertrofia em frameshift (Belgian Blue). Isto sugere uma heterogeneidade de fenótipos com pelo menos dois mecanismos de sinalização independentes a regular o número e tamanho das fibras musculares (Nishi et al. 2002). Outro aspecto importante no estudo da função biológica da Miostatina é conhecer o seu efeito quando sobre-expressa. Através da injecção de células modificadas para produção induzida de Miostatina em ratos, Zimmers et al. verificaram um decréscimo de 30% no peso corporal em 16 dias, 50% correspondente a perda de massa muscular, desaparecimento quase total de tecido adiposo e desenvolvimento de hipoglicémia severa (Zimmers et al. 2002). A sobre-expressão de miostatina especificamente no músculo estriado, sobre controlo do promotor da Creatina-cinase (CK), promoveu uma redução de peso na ordem dos 25% em músculos individuais, apenas por decréscimo do tamanho das fibras, com uma redução de 17% na massa do miocárdio (Reisz-Porszasz et al. 2003). Ao contrário dos resultados de Zimmers et al., a sobre-expressão músculo-específica de Miostatina causou um aumento de tecido adiposo. Curiosamente, este aumento apenas se verificou em machos, sugerindo uma função ligada ao sexo ainda não desvendada (Reisz- Porszasz et al. 2003). Pág. 5

6 2.2. Biossíntese e Mecanismos de Sinalização Celular Após síntese, a proteína precursora é processada de forma a atingir o seu estado bioactivo (McPherron et al. 1997). Uma primeira clivagem proteolítica remove a sequência sinal, necessária ao encaminhamento para a via secretória. Uma segunda clivagem separa os fragmentos N-terminal (propéptido) e C-terminal, este último homodimerizando por ligação dissulfido (Wolfman et al. 2003). Após processamento, o própeptido (LAP) liga-se de forma não-covalente à região madura (a Miostatina propriamente dita), mantendo-a num estado latente, incapaz de interagir com os receptores celulares (Lee and McPherron 2001). É desta forma, e em associação com outras proteínas, que a Miostatina se encontra na corrente sanguínea, actuando de forma endócrina (Zimmers et al. 2002). Existem algumas evidências de que LAP pode heterodimerizar com outras proteínas aparentadas, as proteínas TGF-β Latentes (LTBP), capazes de se ligar a elementos da matriz extracelular (ECM), permitindo a concentração de complexo nessa zona. Este facto levanta a questão de que a integridade da ECM pode ser um factor importante na regulação da Miostatina (Patel and Amthor 2005). A activação da Miostatina pressupõe destabilização do complexo latente. Através do padrão de clivagem, Wolfman et al. colocaram a hipótese de a enzima responsável pela dissociação do própeptido pertencer à família das metaloproteínases BMP-1/TLD (Bone- Morphogenetic Protein-1/Tolloid). Incubação do complexo latente purificado com BMP-1/TLD resultou na clivagem completa de LAP e activação da Miostatina (Wolfman et al. 2003). Apesar de ainda não se conhecer ao certo o responsável in vivo pela clivagem proteolítica, a expressão específica de membros da família BMP-1 no músculo-esquelético aponta a mtll-2 como possível candidato (Scott et al. 1999). Como é norma na família TGF-β, a Miostatina sinaliza atrav és de um complexo transmembranar heterodimérico de receptores Serina/Treonina cinase, os receptores de Activina Tipo-II (ActRIIA e ActRIIB), com maior afinidade para ActRIIB (Lee and McPherron 2001). A expressão de um receptor truncado, disfuncional, resulta num aumento de massa muscular semelhante ao KO de Mstn em ratos (Lee and McPherron 2001). ActRII recruta e fosforila coreceptores tipo I ALK-4 e ALK-5, dando inicio à via de sinalização Smad, regulando a transcrição génica (Rebbapragada et al. 2003). A oncoproteína SKI é um conhecido repressor de TGF-β por inibição da via Smad (Chen et al. 2007). Já antes da descoberta de GDF-8 havia conhecimento de que ratos com expressão aumentada de Ski apresentavam hipertrofia muscular acentuada (Sutrave et al. 1990) e que mutantes nulos do mesmo gene tinham menos massa muscular que o normal (Berk et al. 1997). Como tal, parece evidente que SKI bloqueia a Miostatina através da inibição de proteínas Smad. Mais Pág. 6

7 recentemente foi demonstrada uma segunda via de sinalização independente, a TAK1-p38 MAPK, suprimindo a proliferação celular através do inibidor de cinase Ciclina-dependente p21 (Philip et al. 2005). A Miostatina é apenas um dos ligandos dos receptores Activina II, presentes em vários tipos de células, colocando-se a questão de como a especificidade de sinal é atingida. Uma explicação simples é a expressão regulada e localizada de BMP-1/TLD, activando o complexo apenas onde e quando é necessário. Outra hipótese é a expressão restrita de ActRII e do receptor tipo I apropriado. Apesar de várias moléculas sinalizarem através de ActRIIB e ALK-4 (complexo Tipo II-I), é a primeira vez que se demonstra a capacidade de ALK-5 em interagir com ActRIIB (Rebbapragada et al. 2003), sugerindo-o como responsável pela especificidade de sinal Regulação Para além da regulação através do papel das metaloproteinases BMP-1/TLD na clivagem do complexo latente propéptido-miostatina, importante mecanismo in vivo (Hill et al. 2002), existem outros processos responsáveis pelo controlo da sua actividade. Lee e McPherron demonstraram a capacidade da Folistatina em bloquear a ligação de GDF-8 a ActRIIB e que a sua sobre-expressão em ratos induzia aumentos de massa muscular até 327% em certos músculos relativamente ao controlo (Lee and McPherron 2001). Além do mais, co-mutantes nulos para Mstn e que sobre-expressam Folistatina apresentam quase o dobro da massa muscular de mutantes apenas para a Miostatina, sugerindo que existe pelo menos outro ligando TGF-β que exerce uma acção concertada com GDF-8 na regulação do músculo-esquelético (Lee 2007). Concordante com esta hipótese, a administração de receptores solúveis disfuncionais ACVR2B, capazes de sequestrar outros membros da família TGF-β, provoca incrementos de músculo superiores à mutação nula da Miostatina por si só (Lee et al. 2005). A análise do complexo circulante latente revela mais uma proteína capaz de interagir com a Miostatina, a FLRG (Follistatin-Related Gene), ligando-se directamente a esta e inibindo a sua actividade (Hill et al. 2002). É proposto que a ligação do FLRG à MSTN se dê após ligação desta ao receptor. O início do processo de sinalização accionaria um feedback negativo com secreção de FLRG e inibição da Miostatina por ligação física entre ambos (Hill et al. 2002). Outra proteína, GASP-1, foi encontrada em associação com a Miostatina em serum humano e com a capacidade de inactivação (Hill et al. 2003). A expressão de GASP-1 é bastante elevada no músculo-esquelético, sugerindo que esta se poderá ligar ao complexo Pág. 7

8 durante o seu processamento ou pouco depois da secreção. GASP-1 não só se liga a região madura como também ao propéptido de forma independente deixando no ar a possibilidade de existência de outros mecanismos de regulação ainda desconhecidos (Hill et al. 2003). O esclarecimento sobre os mecanismos de regulação da actividade da Miostatina é fundamental para o desenvolvimento de métodos com possível aplicação terapêutica. Tudo indica que vários processos actuam em concerto, sublinhando o importante papel biológico deste factor. Existem ainda várias questões que exigem resposta, como que outros factores actuam com a Miostatina no controlo do desenvolvimento muscular e que efeitos induzem noutros tecidos que não o músculo-esquelético Inibição da Proliferação de Mioblastos e Células Satélite É possível que o processo de hiperplasia muscular potenciado pela Miostatina seja regulado por acção directa no desenvolvimento e diferenciação de mioblastos. C2C12 é uma linha celular miogénica de rato bem caracterizada que simula a diferenciação do tecido muscular in vitro (Rios et al. 2001), tendo sido bastante utilizada no estudo do papel regulador da MSTN na miogénese. A progressão no ciclo celular é regulada positivamente por Ciclinas e cinases Ciclina-dependentes (Cdk), e inibida por membros das famílias p16 e p21. A Miostatina é capaz de bloquear a proliferação de células mioprogenitoras por um aumento de p21 e consequente inibição de Cdk2 (Thomas et al. 2000). No entanto, mrna de Miostatina é induzido no decorrer do processo miogénico, com o estabelecimento de um estado pós-mitótico resistente a apoptose, influenciando tanto a proliferação como a sobrevivência das células em diferenciação (Rios et al. 2001). A inibição do processo de diferenciação parece ser induzido pela regulação negativa de factores miogénicos, nomeadamente a Miogenina e MyoD (Joulia et al. 2003). Como McPherron et al. demonstraram, o aumento de massa muscular em ratos Mstn -/- deve-se tanto a hiperplasia como hipertrofia (McPherron et al. 1997), sugerindo as células satélite como potencial alvo da Miostatina. Elas constituem um reservatório de células estaminais mononucleadas quiescentes associadas às fibras musculares que, após estímulo, se diferenciam e se fundem com estas no processo de hipertrofia (Le Grand and Rudnicki 2007). McCroskery et al., demonstraram que a MSTN é um potente inibidor da activação das células satélite e contribui para a sua manutenção indiferenciada. A maior activação e proliferação destas células em Mstn -/- sugere que pode ser este o principal mecanismo para o aumento de massa muscular pós-natal e hipertrofia (McCroskery et al. 2003). Quando o crescimento ou regeneração musculares são necessários, a Miostatina é inibida (Roth et al. 2003) e as células satélite libertadas do estado quiescente. Pág. 8

9 2.5. Resposta à Estimulação Mecânica Roth et al., demonstraram que o trabalho de força reduz significativamente a expressão de MSTN mrna, independentemente do sexo ou idade (Roth et al. 2003), demonstrando uma resposta directa da Miostatina à carga muscular. Resultados semelhantes foram atingidos mais tarde com exercício isométrico (Kim et al. 2005) e isotónico (Raue et al. 2006), verificando-se agora uma diminuição da resposta com a idade. Da mesma forma, verifica-se uma atenuação de inibidores do ciclo celular e regulação positiva de Ciclina D1 e D2 em células satélite (Kim et al. 2005) que, como vimos, são inibidas pela MSTN (McCroskery et al. 2003). Se o exercício diminui a expressão de Mstn, é lógico pensar que atrofia seja causada por situação inversa. O mrna de Miostatina aumenta na ausência de gravidade (Lalani et al. 2000), descarga muscular (Wehling et al. 2000) ou em casos de osteoartrite (Reardon et al. 2001), tendo sido igualmente detectados níveis elevados de MSTN em pacientes HIV-positivos com sintomas de degeneração muscular (Gonzalez-Cadavid et al. 1998). Outra descoberta interessante foi a regulação da libertação da MSTN por um cap de Titina, molécula capaz de se ligar à Titina, uma proteína encontrada em sarcómeros com função de contracção e manutenção da sua integridade (Nicholas et al. 2002). Pode-se pensar numa possível regulação a este nível, onde a contracção e dano musculares regulam a biodisponibilidade da Miostatina. 3. Um Caso Humano Em 2000, nasce na Alemanha um rapaz mutante homozigótico, cujo gene produz uma Miostatina truncada, com perda de função (Schuelke et al. 2004). É o primeiro caso documentado em humanos. O seu peso à nascença estava situado no percentil 75 e apresentava cerca de metade da gordura subcutânea média para um recém-nascido. A análise morfométrica do quadricipe revelou músculos com maior área de secção transversal, superior à média 7,2 vezes o desvio padrão (6,72cm 2 vs 3,13+/- 0,49), e um fémur de diâmetro normal (Fig.4). Á parte Fig.4 Ultrasom e análise morfométrica do quadricipe. F fémur; VI Vastus Intermedialis, VL Vastus Lateralis; VM Vastus Medialis; RF Rectus Femoris. (Schuelke et al, 2004) Pág. 9

10 dessas características, tudo indica que seja perfeitamente saudável. Com 4 anos de idade, esta criança era capaz de segurar pesos de 3kg com braço estendido em elevação lateral (Schuelke et al. 2004). Curiosamente, é descendente uma antiga atleta profissional, heterozigótica para a mutação (Schuelke et al. 2004). Apesar de o pai ser incógnito, é de esperar que também apresente esta alteração genética. Esta situação levanta a questão da frequência da mutação na população humana em heterozigotia, sem fenótipo óbvio, e, sendo a mãe atleta de profissão, se não haverá mais casos semelhantes e se a presença de um alelo mutante não lhes trará uma vantagem desportiva. O acompanhamento do crescimento e desenvolvimento desta criança pode ajudar a compreender o efeito da ausência de MSTN em humanos e avaliar potenciais riscos de métodos terapêuticos baseados na sua inibição. Esperemos para breve mais noticias sobre o seu desenvolvimento e estado de saúde. 4. Terapia Genética A terapia genética é, por regra geral, uma terapia aditiva, em que se transfere um gene para uma célula que contém uma cópia deficiente. A manipulação incide essencialmente sobre as células somáticas, sem perpetuação do transgene na descendência. Uma outra forma de terapia genética é a regulação e silenciamento de genes endógenos através de técnicas como o RNA de interferência e oligonucleótidos antisense. De grande importância para a terapia anti-miostatina foi o desenvolvimento de anticorpos específicos capazes de a inibir, com resultados positivos quer em humanos, quer em ratos Aplicações Terapêuticas Distrofia Muscular e Sarcopenia A distrofia muscular é uma doença degenerativa, com sintomas semelhantes à sarcopenia, perda de músculo com o avançar da idade, caracterizada pela morte de fibras e sua substituição por infiltrações fibróticas e gordura (Sweeney 2004). Esta patologia é causada pela ausência ou perda de função da Distrofina, uma proteína presente no sarcolema. Até recentemente, pesava-se que esta proteína apenas tinha como função a protecção das fibras musculares do dano gerado durante a contracção, como que amortecendo os choques e canalizando a energia através da membrana (Batchelor and Winder 2006). No entanto, existe também uma função de transdução de sinais e regulação Pág. 10

11 da homeostase do Cálcio intracelular que pode resultar em apoptose e necrose do tecido (Batchelor and Winder 2006). Nesta doença, a destruição do músculo acontece a ritmo muito superior que a regeneração, não estando este processo necessariamente deficiente. Uma terapia que aumente a capacidade regenerativa do músculo poderia ajudar na atenuação dos sintomas da distrofia. A contracção muscular causa danos, microtraumas, que induzem factores estimuladores da proliferação e diferenciação de células satélite, uma reserva de células estaminais intimamente ligada às fibras musculares. Estas diferenciam-se em mioblastos e fundem-se com as fibras já existentes, reparando-as e aumentando o seu diâmetro (Le Grand and Rudnicki 2007; Sweeney 2004). Como vimos, a Miostatina inibe esta proliferação/diferenciação, representando um potencial terapêutico tentador. Experiências com ratos mdx, modelo para a distrofia muscular de Duchenne, caracterizada pela ausência de Distrofina, verificaram isso mesmo. Wagner et al. verificaram um melhoramento significativo da condição histopatológica no músculo do diafragma e regressão do fenótipo distrófico em mutantes nulos para a Miostatina e Distrofina (Wagner et al. 2002). A injecção de anticorpos monoclonais anti-mstn em ratos mdx teve resultados semelhantes, com sinais claros de regeneração muscular e redução dos níveis serológicos de Creatina-cinase (CK) (Bogdanovich et al. 2002). Este tipo de intervenção com anticorpos, menos invasiva que a mutação induzida, apresenta um grande potencial terapêutico em humanos. Da mesma forma, a atrofia muscular por desuso poderá ser atenuada com a intervenção terapêutica, tendo sido encontrados altos níveis de MSTN nessas condições (Reardon et al. 2001) Catabolismo Induzido por Glucocorticóides A perda de músculo verificada com a administração de glucocorticóides está relacionada com a Miostatina (Ma et al. 2003), promovendo a proteólise pelo sistema ubiquitina-proteossoma e lisossoma (Gilson et al. 2007). A sua inibição previne esse mesmo processo degenerativo, evidenciando um potencial mecanismo para atenuar os efeitos secundários da utilização terapêutica de glucocorticóides (Gilson et al. 2007) Perda de Massa Muscular Associada à SIDA Em indivíduos com manifestação do HIV em que se verifica perda de peso foram encontrados níveis mais elevados de Miostatina, existindo uma relação entre esses níveis e a quantidade de massa muscular perdida (Gonzalez-Cadavid et al. 1998). Por razões óbvias Pág. 11

12 não se verificou o efeito da supressão de MSTN mas é lógico pensar num efeito positivo e possível aplicação terapêutica Obesidade e Intolerância à Glicose Em adultos, a Miostatina é predominantemente expressa no músculo-esquelético, tendo sido detectada também no tecido adiposo (McPherron et al. 1997). Ratos KO para a miostatina acumulam menos gordura com a idade, ou por inibição directa da proliferação de adipócitos ou apenas pelas alterações metabólicas inerentes a um aumento de massa muscular. Adicionalmente verificou-se também uma melhoria no metabolismo da glicose, com supressão do desenvolvimento de hiperglicémia em ratos Lep ob/ob, mutantes para a leptina (McPherron and Lee 2002). Da mesma forma, Zhao et al. demonstraram que a inibição da miostatina resulta na prevenção de obesidade e resistência à insulina. Enquanto que ratos de genótipo selvagem em regime alimentar rico em gorduras desenvolveram adiposidade e intolerância à glicose, os parentes transgénicos eram saudáveis. Como esperado, os ratos mutantes revelaram desenvolvimento muscular acentuado, com níveis normais de Insulina, Leptina e Resistina, marcadores de obesidade e desordens metabólicas, quando sujeitos a uma dieta rica em gorduras. O nível serológico de Adiponectina em ratos transgénicos era elevado em comparação com o genótipo selvagem, justificando um maior transporte e oxidação de ácidos gordos no tecido muscular (Zhao et al. 2005). A ideia da extrapolação destes resultados para modelos humanos é tentadora para o tratamento de doenças metabólicas, com as devidas reticências quanto a possíveis efeitos colaterais. Muito pouco se sabe acerca do papel da MSTN na regulação do tecido adiposo MYO-029 O MYO-029 é um anticorpo recombinante humano de alta afinidade para a Miostatina em fase de testes para tratamento de distrofias musculares. Os resultados da fase I/II, com o objectivo de avaliar a segurança do tratamento, saíram em Maio de 2008 e são positivos. De uma forma geral, o MYO-029 aparenta ser bem tolerando com alguns indivíduos a apresentarem reacções cutâneas estranhas, como urticária, em doses mais elevadas da droga. Não se verificaram anomalias no tecido cardíaco ou liso, com um ligeiro aumento de massa muscular, na ordem dos 3%, sem incremento de força (Wagner et al. 2008). Quanto à eficácia do tratamento, outros trials terão de ser feitos para serem tiradas conclusões mas, segundo parece, o MYO-029 apresenta margem de segurança para testes mais alargados. 5. O Doping Genético Pág. 12

13 A Agência Mundial Anti-Doping define doping genético como a utilização não terapêutica de métodos ou genes capazes de melhorar a performance atlética. No entanto a questão coloca-se. O que é o uso não terapêutico? Pacientes submetidos a terapia genética poderão competir? É uma definição ambígua que necessita de ser clarificada A Miostatina e o Doping A raça de cães Whippet (Fig.5) tem sido seleccionada artificialmente para corridas e recentemente foram relatados casos de animais excepcionalmente musculados. A análise genómica encontrou mutação no gene da Miostatina, o que não é de estranhar tendo em conta o fenótico semelhante a outros animais também mutantes (Mosher et al. 2007). Em heterozigotia, esta mutação confere grande vantagem em corridas de cães (Mosher et al. 2007). Neste trabalho foi demonstrada pela primeira vez uma relação positiva entre a Miostatina e a performance atlética. O potencial aumento de massa muscular e capacidade regenerativa dos músculos são atractivos suficientes para se pensar numa utilização adicional ao tratamento clínico, direccionada ao aumento de rendimento desportivo. Fig.5 Wendy, um Bully Whippet mutante homozigótico Detecção A grande vantagem do doping genético é a dificuldade na sua despistagem. Caso o transgene tenha a sua expressão confinada a um determinado tecido é necessária uma biopsia, não prevista no regulamento actual. Foram no entanto desenvolvidas novas técnicas menos invasivas, com recurso a agulhas mais finas e PCR (Guescini et al. 2007), de potencial uso no controlo anti-dopagem. Para além da análise genómica, cara e morosa, existem alguns métodos possíveis para o controlo, como o desenvolvimento de anticorpos específicos para o vector viral utilizado ou microarray, necessitando este último de uma base de dados com o padrão de expressão basal de cada atleta (Azzazy et al. 2005). Quanto à despistagem de substâncias modeladoras ou de silenciamento de determinados genes, como anticorpos no caso da MSTN, não deverá ser problemática já que a sua aplicação terapêutica pressupõe a existência de métodos de quantificação e detecção. Pág. 13

14 6. Riscos da Terapia Genética Existem riscos gerais associados à terapia genética que têm de ser considerados. Primeiro existe a questão das diferenças entre os modelos laboratoriais e o Homem, como, por exemplo, a nível da anatomia e fisiologia, a eficiência do promotor e vector depende do hospedeiro, a taxa metabólica é diferente e não é raro o desenvolvimento de reacções autoimunes quando se passa do modelo rato para primatas de grande porte (Baoutina et al. 2007). Outra questão relevante é o potencial oncogénico do transgene por incorrecta inserção em genes endógenos ou sequências reguladoras (Baoutina et al. 2007). Especificamente em relação à Miostatina, o bloqueio completo leva a um decréscimo da capacidade de gerar força muscular específica. Ratos mutantes, com músculos maiores, não são significativamente mais fortes que os selvagens (Amthor et al. 2007). No mesmo trabalho foi encontrado um aumento da proporção de fibras musculares tipo IIb e um decréscimo da capacidade oxidativa traduzida num menor número de mitocôndrias e redução da actividade enzimática (Amthor et al. 2007). Uma vez que o bloqueio da respiração mitocondrial é causa de fraqueza, é possível que seja essa a explicação para a redução de força músculo-específica verificada em mutantes nulos para a MSTN (Amthor et al. 2007). Da mesma forma, Rehfedlt et al. verificaram uma preferência metabólica para a glicólise e uma redução na capilaridade muscular, com possíveis efeitos adversos (Rehfeldt et al. 2005). Mais recentemente foi descoberta uma possível relação entre a Miostatina e a estrutura e funcinalidade dos tendões. Ratos Mstn -/- apresentam tendões mais pequenos, hipocelulares e frágeis, com redução na expressão de genes activadores da proliferação de fibroblastos (Mendias et al. 2008). Tendões quebradiços, susceptíveis a lesões, são um problema para os atletas e um passo atrás no doping genético. Sharma et al. estudaram a expressão de MSTN no tecido cardíaco e verificaram que esta aumentava após enfarte do miocárdio, representando talvez um papel importante na recuperação pós-trauma (Sharma et al. 1999). A actividade da Miostatina em outros tecidos que não o músculo-esquelético levanta questões acerca de possíveis efeitos secundários ainda não conhecidos. São precisos mais estudos para se poder avaliar a segurança de uma eventual terapia genética em humanos. 7. Considerações Finais É evidente o potencial terapêutico da manipulação da Miostatina em humanos em diferentes quadros clínicos como miopatias e mesmo obesidade e síndrome metabólico. No Pág. 14

15 entanto, muitas questões carecem resposta antes de um tratamento ser disponibilizado. Que influência têm a sua manipulação em outros tecidos? Porquê tantos mecanismos de controlo? Que papel desempenha cada mecanismo num determinado tecido? Certamente que algumas respostas virão em tempos próximos mas até lá apenas se pode especular sobre uma potencial terapia genética segura e eficaz. Apesar de não ser ético utilizar o Homem como modelo de testes, voluntários não faltariam motivados pelo potencial aumento de rendimento desportivo e, porque não, estético. O fisioculturismo é hoje em dia um negócio de milhões e uma droga ou terapia capaz de superar os limites da genética humana é apelativa para quem o tamanho conta. Citando H. Lee Sweeney, fisiólogo e professor na Universidade de Pensilvânia, Things that make your muscles healthy when they are old are going to make them healthier when they are young. Referências Amthor H, Macharia R, Navarrete R, Schuelke M, Brown SC, Otto A, Voit T, Muntoni F, Vrbova G, Partridge T and others Lack of myostatin results in excessive muscle growth but impaired force generation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 104(6): Azzazy HME, Mansour MMH, Christenson RH Doping in the recombinant era: Strategies and counterstrategies. Clinical Biochemistry 38(11): Baoutina A, Alexander IE, Rasko JE, Emslie KR Potential use of gene transfer in athletic performance enhancement. Molecular Therapy 15(10): Batchelor CL, Winder SJ Sparks, signals and shock absorbers: how dystrophin loss causes muscular dystrophy. Trends in Cell Biology 16(4): Berk M, Desai SY, Heyman HC, Colmenares C Mice lacking the ski proto-oncogene have defects in neurulation, craniofacial patterning, and skeletal muscle development. Genes & Development 11(16): Bogdanovich S, Krag TOB, Barton ER, Morris LD, Whittemore LA, Ahima RS, Khurana TS Functional improvement of dystrophic muscle by myostatin blockade. Nature 420(6914): Bullough WS Mitotic and Functional Homeostasis - A Speculative Review. Cancer Research 25(10): Butenandt A, Hanisch G A Method for Preparing Testosterone from Cholesterol. Chemische Berichte 68:1859. Chen WJ, Lam SS, Srinath H, Schiffer CA, Royer WE, Lin K Competition between Ski and CREB-binding protein for binding to Smad proteins in transforming growth factor-beta signaling. Journal of Biological Chemistry 282(15): Diamandopoulos A Medicine and the Olympic Games. Humane Medicine Health Care. Gilson H, Schakman O, Combaret L, Lause P, Grobet L, Attaix D, Ketelslegers JM, Thissen JP Myostatin gene deletion prevents glucocorticoid-induced muscle atrophy. Endocrinology 148(1): Gonzalez-Cadavid NF, Taylor WE, Yarasheski K, Sinha-Hikim I, Ma K, Ezzat S, Shen RQ, Lalani R, Asa S, Mamita M and others Organization of the human myostatin gene and expression in healthy men and HIV-infected men with muscle wasting. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 95(25): Guescini M, Fatone C, Stocchi L, Guidi C, Potenza L, Ditroilo M, Ranchelli A, Di Loreto C, Sisti D, De Feo P and others Fine needle aspiration coupled with real-time PCR: A painless methodology to study adaptive functional changes in skeletal muscle. Nutrition Metabolism and Cardiovascular Diseases 17: Hartgens F, Kuipers H Effects of androgenic-anabolic steroids in athletes. Sports Medicine 34(8): Higgins AJ From ancient Greece to modern Athens: 3000 years of doping in competition horses. Journal of veterinary pharmacology and therapeutics 29(s1):4-8. Hill JJ, Davies MV, Pearson AA, Wang JH, Hewick RM, Wolfman NM, Qiu YC The myostatin propeptide and the follistatin-related gene are inhibitory binding proteins of myostatin in normal serum. Journal of Biological Chemistry 277(43): Hill JJ, Qiu YC, Hewick RM, Wolfman NM Regulation of myostatin in vivo by growth and differentiation factor-associated serum protein-1: A novel protein with protease inhibitor and follistatin domains. Molecular Endocrinology 17(6): Joulia D, Bernardi H, Garandel W, Rabenoelina F, Vernus B, Cabello G Mechanisms involved in the inhibition of myoblast proliferation and differentiation by myostatin. Experimental Cell Research 286(2): Kim JS, Cross JM, Bamman MM Impact of resistance loading on myostatin expression and cell cycle regulation in young and older men and women. American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism 288(6):E1110-E1119. Lalani R, Bhasin S, Byhower F, Tarnuzzer R, Grant M, Shen R, Asa S, Ezzat S, Gonzalez-Cadavid NF Myostatin and insulin-like growth factor-i and -II expression in the muscle of rats exposed to the microgravity environment of the NeuroLab space shuttle flight. Journal of Endocrinology 167(3): Le Grand F, Rudnicki MA Skeletal muscle satellite cells and adult myogenesis. Current Opinion in Cell Biology 19(6): Lee SJ Quadrupling Muscle Mass in Mice by Targeting TGF-beta Signaling Pathways. PLoS ONE 2(8):e789. Pág. 15

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