7) Grade para os tubos de ensaio;

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2 40 Detecta ambas as Imunoglobulinas e baseia-se na reação antígeno-anticorpo, que adere aos glóbulos de gordura do leite, e, como toda gordura permanece em suspensão, forma-se o anel da cor do corante utilizado no antígeno. O antígeno Cepa 1119/ Brucella abortus, contém 4% de células e deve ser conservado sob refrigeração e ph 4,0. Técnica Laboratorial Cuidados com Leite: 1 - Leite in natura (não pode ser utilizado leite congelado, fervido, desnatado, pasteurizado); 2 - Homogeneização; 3 - Refrigerar por 24/72 horas ou Formalina, 1ml (1%). Vantagens do Teste:- Taxa de prevalência no rebanho; vigilância epidemiológica; prova excelente para um tambo; II - MATERIAL 1) Amostra de leite; 2) Antígeno Cepa 1119 Brucella abortus, com 4% de massa bacteriana e corado pelo cloreto de trifeniltetrazólio (vermelho), ou outro corante (Hematoxilina - azul), ph 4,0; 3) Conta-gotas calibrado para 0,03 ml cada gota ou pipeta de 1 ml por 100; 4) Pipeta de 1 ml ou 2 ml; 5) Tubos de ensaio de 13x100mm (1 por amostra); 6) Estufa a 37 C; 7) Grade para os tubos de ensaio; III - TÉCNICA 1) Colocar 1 ml de leite no tubo de ensaio: 1 ml vacas 2 ml vacas 3 ml vacas 2) Adicionar uma gota (0,03) de antígeno para o Ring-Test; 3) Misturar bem durante meio a um minuto, inclinando diversas vezes o tubo; 4) Deixar o tubo em repouso na posição vertical durante meia a uma hora, na estufa, a 37 C, ou 1 a 2 horas à temperatura ambiente; IV - INTERPRETAÇÃO 1) Anel inteiramente corado, de cerca de 2 mm de espessura ou mais, sobre a coluna de leite completamente descorada POSITIVO (+++); 2) Anel semelhante ao descrito, porém a coluna de leite não totalmente descorada POSITIVO (++); 3) Anel sem descoramento apreciável da coluna de leite, coloração quase idêntica do anel de creme e da coluna de leite - SUSPEITO; (Quando a prova for feita com leite individual); 3.1) POSITIVO (+) quando a prova for feita com mistura de leite de várias vacas, (repetir o teste individualmente); 4) O anel branco, de creme, no alto de uma coluna de leite que se apresenta corada pelo antígeno NEGATIVO.

3 39 Técnica Laboratorial: 1- REATIVOS E EQUIPAMENTOS NECESSÁRIOS Todos os reativos e equipamentos estão incluídos no kit de elementos para realizar a prova. Há três tipos de kits: Um não inclui o equipamento para a tomada de plasma e se usa para testar soros no laboratório. Este pode ser usado tanto com soro de suínos como de bovinos. Os outros dois kits contêm equipamentos para a tomada de plasma e servem para obter e examinar plasma no campo. Os elementos para testar soros de suínos diferem dos utilizados para o plasma de bovinos em que as ampolas para o recolhimento de plasma contêm uma lecitina distinta. Como cada lecitina que aglutina os eritrócitos é específica para as espécies, o equipamento para obter plasma não pode ser trocado entre as espécies. III - TÉCNICA Utilizada para realização da prova no laboratório, com o soro. 1) Colocar 0,03 ml de soro sobre um quadrado da placa; 2) Colocar 0,03 ml de Antígeno de Brucella spp Tamponada (ph 3,65); 3) Misturar bem, com o auxílio de um bastão; 4) Proceder movimentos de rotação com a placa durante 4 minutos, à razão de movimentos por minuto; 5) Ler aos 4 minutos; IV - INTERPRETAÇÃO Uma amostra POSITIVA apresentará aglutinação macroscópica (grumos de moderados a grandes). Uma amostra NEGATIVA não apresentará grumos Prova da Antiglobulina ou de Coombs Utiliza-se para detectar anticorpos incompletos os quais são da classe IgG e IgA. Estes anticorpos reagem com o antígeno, mas não aglutinam. Numa segunda fase os anticorpos unidos as Brucellas ssp do antígeno reagem com a anti-globulina específica por espécie animal, ocorrendo a aglutinação. A anti-globulina é bivalente Hemoaglutinação Indireta (HAI) Em desuso por ser um procedimento bastante complexo e não apresentar vantagem em relação às demais provas. 9. PROVA DO ANEL EM LEITE RING TEST (PAL) Utiliza-se um antígeno corado pela hematoxilina ou com sais de tetrazólio com uma concentração celular de 4% e um ph 4,0. É importante considerar que esta prova tem uma maior precisão quando feita com uma mistura de leite de várias vacas. Se o número de animais for igual ou menor que 100 o volume de leite empregado na prova será de 1 ml; de 101 a 200 vacas 2 ml; de 201 a 500, 3 ml; número superior de vacas não é indicado. O complexo antígeno anticorpo se adere à superfície dos glóbulos de gordura e sobe com eles, formando um anel de creme colorido de intensidade variável, segundo o grau de reação, com um descoramento parcial ou total da coluna de leite. É muito importante considerar que em leite desnatado não é possível a realização da prova. Utiliza-se para descobrir rebanhos infectados e para vigilância epidemiológica em rebanhos livres. Rebanhos positivos devem ser examinados por provas sorológicas para identificação dos animais infectados. Podem ocorrer reações não específicas que apresentem falsos positivos em amostras de vacas com mastites ou em fase de produção de colostro e em vacas no período final de lactação.

4 38 II - PREPARAÇÃO DE ANTÍGENO DE PLACA ACIDIFICADO O Antígeno Acidificado não é estável, portanto deve ser preparado diariamente. PH DA MISTURA ANTÍGENO- SORO 4,00 3,75 3,50 3,25 3,00 TIPO DE ÁCIDO Acético Glacial Concentr. Lático Concentrado Lático Concentrado Lático Concentrado Tartárico a 60% QUANTIDADE. DE ÁC. P/ CADA 2ml DE ANTÍGENO 0,16 ml 0,12 ml 0,18 ml 0,28 ml 0,30 ml III - MATERIAL NECESSÁRIO - O mesmo utilizado para a prova rápida em placa. IV - TÉCNICA 1) Deixar que o soro chegue a temperatura ambiente; 2) Pipetar o soro da amostra de sangue, como se faz na prova rápida; 3) Manter a pipeta num ângulo de 45 e tocar com a ponta na superfície da placa no centro do quadrado e verter 0,08; 0,04, 0,02, 0,01 e 0,005 ml sobre a placa; 4) Manter o conta-gotas (calibrado para 0,03 ml), verticalmente, e deixar cair uma gota de antígeno sobre o soro; 5) Misturar bem, com o auxílio de um bastão do maior para o menor título; 6) Proceder 4 rotações com a placa; 7) Colocar a placa na caixa por 8 minutos; a) Depois de 4 minutos proceder 4 rotações; b) Depois de 8 minutos, girar novamente a placa, utilizando uma fonte de luz indireta; V - LEITURA Ainda que se considerem positivas as reações incompletas nesta prova, deve-se comparar os resultados com os das provas de rotina (rápida e lenta) e as demais complementares, bem como, com a história clínica do rebanho e do animal, individualmente. É vantajoso, também, indicar o ph utilizado, pois a quantidade de imunoglobulinas inespecíficas pode muito grande, aglutinando em ph mais alto (4,0, por exemplo), vindo a dar reação negativa, à medida que se baixa o ph Card Test ; Teste de Rosa de Bengala; Prova do Cartão (CT) Tem o mesmo princípio da prova com antígeno acidificado modificado, pois o antígeno utilizado tem um ph de 3,65. Apresenta pequenas diferenças ou seja: corante (Rosa de Bengala); estabilidade (é um antígeno tamponado); a concentração celular (8%) e é uma prova qualitativa e não quantitativa. Tem uma boa sensibilidade e especificidade, porém de acordo com LEVIEUX et al. (1974), às vezes, pode detectar IgM. Por outro lado, detecta as IgGl, mas não as IgG2. Esta prova tem a vantagem de que pode ser utilizada a campo e detecta apenas IgG1, por inibição da IgM, por acidificação. O Antígeno (Cepa 1119/3 Br. abortus) tamponado é mais específico que o usado nas provas de rotina. Deve-se esclarecer que o antígeno não reaciona com certos tipos de aglutininas. Por outro lado a prova não mede títulos de anticorpos. Ou seja, o método não é quantitativo e sim qualitativo. Algumas vezes a prova é positiva em soros com títulos reacionantes de 1:25 ou menores. Em outros casos a prova é negativa, quando pelo método de rotina se obtêm títulos com interpretação de suspeito ou até de positivo.

5 37 4) Com 1 pipeta de 5 ml colocar 1 ml da solução de ME em cada um dos 6 tubos; 5) Colocar 1 ml de antígeno em cada tubo: 6) Agitar os tubos; 7) Levar à estufa a 37 C, por horas; III - INTERPRETAÇÃO Igual a da prova lenta (em tubos), ou seja: - Nos casos POSITIVOS, aparecerá uma tênue camada de precipitado, que se mantém íntegra ao leve toque do tubo; a coluna líquida se clarifica (é ligeiramente leitosa); - Nos casos NEGATIVOS poderá surgir pequeno precipitado, porém, a coluna líquida se manterá leitosa; - Qualquer aglutinação é considerada como resultado POSITIVO Prova do Rivanol (PR) O rivanol tem a propriedade de precipitar as imunoglobulinas de alto peso molecular, portanto as IgM se precipitam e no sobrenadante vamos detectar somente as IgG. Requer um antígeno especial de concentração celular de 4% com um diluente de solução salina ácido cítrico fosfato dibásico com um ph de 5,8 a 6,2. O rivanol pode ocasionar alguma precipitação das IgG, assim sendo ocasiona um leve declínio no título real destas imunoglobulinas. É uma prova semelhante à prova rápida em placa e o soro é tratado previamente com uma solução de rivanol a 1% em quantidades iguais Inativação pelo Calor a 65 C para Bovinos (PIC) É um método similar ao da prova lenta em tubo e baseia-se na termolabilidade das IgM. A incubação é feita por 15 minutos a 65ºC, pois é a maior temperatura em que o soro pode ser aquecido sem efeitos colaterais na coagulação das proteínas. Depois resfriar por 3 minutos, centrifugar por 5 minutos, desprezar o sobrenadante, ressuspender em 1,5 ml de solução fisiológica e fazer a leitura Inativação pelo Calor a 56 C para Suínos (PIC) Diferencia as reações específicas das inespecíficas, bastante comum em suínos. As imunoglobulinas inespecíficas são inativadas a 56 C num período de 16 a 18 horas. A prova é semelhante à lenta em tubo. Tem uma maior especificidade, mas uma menor sensibilidade em relação às provas de aglutinação padrões Prova em Placa com Antígeno Acidificado Modificado (PAM) Baseia-se na mistura soro-antígeno acidificada até que o ph 4.0 iniba as aglutininas inespecíficas especialmente a IgM, mantendo atividade aglutinante de IgG. A ação do ph ácido atua por inibição e não por destruição nem desnaturação. A prova é igual à prova rápida em placa, com a diferença de que o antígeno é acidificado usando-se ácido acético, ac. láctico ou tartárico, de acordo com o ph. O antígeno, em virtude da acidificação, perde sua estabilidade, devendo ser empregado por apenas 1 dia. Técnica Laboratorial I - REATIVOS NECESSÁRIOS 1) Antígeno para a prova rápida em placa; 2) Um ácido como o Ácido Acético glacial concentrado, Ác. Lático e Ác. Tartárico a 60% (60 gramas de Ác. Tartárico em 100 ml de água destilada);

6 Prova de Fixação do Complemento (FC) É uma prova muito eficiente, tem uma boa sensibilidade e especificidade, porém é bastante complexa e exige um laboratório bem equipado e técnicos bem treinados. Permite, com eficiência, distinguir entre títulos vacinais e títulos por infecção natural Prova de Aglutinação com Muco Vaginal (PSA) Utilizada para detectar anticorpos produzidos localmente, os quais são considerados uma indicação de infecção. Podem ocorrer falsos positivos quando o muco é coletado por processos que causam irritação da mucosa genital e também em animais recentemente vacinados. Por outro lado, podem ocorrer falsos negativos quando não há infecção nos órgãos genitais. Utiliza-se esta prova para exame de vacas de rebanho infectado e que tenham parido normalmente. Também em vacas que tenham abortado, após alguns dias de ocorrência do aborto. Coleta-se com uma pipeta e cada parte se dilui em quatro (4) partes de solução fisiológica fenolada, homogeniza-se e deixa-se 12 horas a 4 C, fazendo- se, posteriormente, a Prova de Aglutinação Lenta em Tubo (PLT). Título de 1:25 é considerado significativo. Durante o estro ocorre uma diluição maior, podendo resultar em falsos negativos. O muco catarral ou purulento não é adequado para esta prova. 8. PROVAS COMPLEMENTARES As provas complementares detectam somente as IgG e se baseiam nas propriedades das imunoglobulinas discutidas, anteriormente, na Tabela Redução pelo Mercaptoetanol (RME) É uma prova seletiva que detecta somente a presença das IgG. Baseia-se em que os anticorpos IgM, com configuração pentâmera, se degradam em cinco sub-unidades semelhantes pela redução das ligações dissulfurosas devido a ação de certos compostos que contenham o radical tiol como o 2-mercaptoetanol, a cisteína e o ditiotriol. Pela redução, os anticorpos perdem sua atividade de plurivalentes e se comportam como univalentes. Embora haja a reação antígeno-anticorpo não há a formação das pontes intercelulares não havendo a aglutinação. As IgG não são atacadas. O antígeno usado é o mesmo da prova lenta em tubo. Técnica Laboratorial: I - MATERIAL 1) Antígeno para a prova em tubo, diluído a 2%, em solução fisiológica a 0,85% (duplamente concentrado); 2) Solução de Mercaptoetanol a 0.1M - (0,12 ml de Mercaptoetanol para 15 ml de sol. Fisiológica a 0,85%, com duração de uma semana, na geladeira), ou 7,80 ml ME em 992,20 ml de solução fisiológica; 3) Amostra de soro; 4) Grades para tubos; 5) Seis (6) tubos (13 X 100 mm) ou outro, para cada amostra; 6) Lamparina a álcool; 7) Caneta para retroprojetor; 8) Uma (1) pipeta de Bang (0,2 ml); 9) Duas (2) pipetas de 10 ml ( uma para antígeno, outra para Mercaptoetanol - ME); 10) Estufa a 37 C (Por horas); II - TÉCNICA 1) Colocar os tubos em série de 6, sendo o último tubo o testemunha; 2) Identificar o 1 o tubo da série com o n o da amostra, com caneta para retroprojetor; 3) Com a pipeta de Bang, colocar nos tubos quantidades de soro, amostra de: 0,08 ml - 0,04 ml - 0,02 ml - 0,01 ml ( 0,005 ml nos 5 primeiros tubos);

7 35 Devido ao longo período de incubação da brucelose, quando se testa um rebanho e tem alguns casos positivos é aconselhado que se reavalie este rebanho com um intervalo de 60 a 90 dias. Durante a fase final de gestação e logo após o aborto ou parto alguns animais brucélicos poderão não apresentar títulos ou estes serem baixos, devido à migração das imunoglobulinas para a glândula mamária. No último caso, devese repetir a prova 2 a 4 semanas após. Os animais suspeitos devem ser submetidos a uma nova prova entre 30 e 60 dias depois. Aumentando o título o animal passa a ser considerado positivo, diminuindo, é considerado negativo. Se conservar o título do suspeito temos de considerar os antecedentes clínicos e epidemiológicos do rebanho para dar o destino ao animal. Se não houver antecedentes clínicos e epidemiológicos deverão ser feitas as provas complementares Diagnóstico em Touros Tem-se demonstrado que títulos baixos (1:25 a 1:50) são significativos de infecção, isto porque no touro não ocorrem os estímulos sucessivos pois, nestes não há gestação nem aborto. Poderá ocorrer que a única classe de imunoglobulina presente seja a IgG e em título baixo. É aconselhado realizar, sempre, as provas comp1ementares ou, especialmente, Sêmen Plasma Aglutinação (SPA), devido à localização da Brucella spp nos órgãos genitais. Esta, seguramente, apresentará um título aglutinante mais alto Interpretação da Soro-Aglutinação em Caprinos Em muitos rebanhos com infecção ativa se observam títulos altos embora em rebanhos com infecção crônica é aconselhável eliminar todos os animais com títulos de 1:25 ou superiores. Este título é teoricamente considerado suspeito, aconselhando-se a repetição da prova entre 4 a 6 semanas após. Em áreas endêmicas deve-se repetir a prova a cada 3 a 6 meses e títulos de 50/UI ml devem ser considerados como indicativos de infecção. Entretanto muitos animais com este título podem não estar infectados. Devemos ser mais exigentes na classificação dos reacionantes quando se emprega o antígeno "stander" de Brucella abortus dado sua menor sensibilidade quando se compara com o homólogo. Devemos levar em consideração que em animais recentemente vacinados com Brucella mellitensis, cepa Rev.l, as provas do soroaglutinação não são utilizadas, havendo a necessidade de se esperar, no mínimo, 7 a 8 meses para poder realizá-las. Segundo alguns autores, a fixação do complemento é mais eficiente nestes casos Interpretação da Soro-Aglutinação em suínos e comparação com outras provas sorológicas Qualquer método sorológico é útil nesta espécie para verificar a presença da infecção numa criação, mas nenhuma prova isoladamente é totalmente adequada para o diagnóstico individual nem permite detectar mais de 80 a 90% dos indivíduos infectados. A Prova Rápida em Placa (PRP) não é adequada para ser usado em vigilância pelas numerosas reações hetero-específicas que ocorrem. Para a interpretação da PRP e da Prova Lenta em Tubo deve-se levar em consideração o status do rebanho em relação ao exame anterior, o qual, vai estar classificado, previamente, como infectado ou livre de infecção. Quando um rebanho passa por duas provas negativas consecutivas num intervalo de 90 dias está em condições de ser declarado livre de infecção. Em muitos suínos infectados, os títulos aglutinantes declinam com bastante rapidez, daí a importância de se saber o status anterior do rebanho. Na ausência de infecção pode-se eliminar as reações hetero-específicas pelo uso das provas complementares.

8 34 Os soros hemolisados não servem para a realização da PLT devido a interferência do fenol com a hemoglobina livre que pode ocasionar pseudo-aglutinações. TÉCNICA LABORATORIAL I - MATERIAL 1) Amostra de soro não hemolisado; 2) Antígeno para prova em tubo; 3) Solução fisiológica fenicada a 0,5% para diluir o Antígeno; 4) Grade para tubos de ensaio; 5) Seis (6) tubos de ensaio (13 X 100 mm) para cada amostra; 6) Caneta para retroprojetor para marcar tubos; 7) Um (1) cálice graduado para diluir o antígeno; 8) Uma (1) pipeta de 10 ml; 9) Uma (1) pipeta de 1 ml decimal; 10) Uma (1) pipeta de Bang; 11) Estufa a 37 C; PREPARAÇÃO DA SOLUÇÃO FISIOLÓGICA FENICADA A 0,5%: Cloreto de Sódio 850 mg; Ácido Fênico 0,5 ml ou 500 mg; Água Destilada 100 ml; II TÉCNICA PARA DILUIÇÕES SERIADAS 1) Diluir o Antígeno a 2%, calculando de acordo com o número de amostras e marcar os tubos com o n o da amostra; 2) Colocar 0,16 ml de soro no 1 o tubo da série; 3) Colocar 2 ml de diluente no 1 o tubo da série (com a pipeta de 1 ml), e homogeneizar; 4) Colocar 1 ml do diluente nos demais tubos; 5) Com a pipeta de 1 ml passar 1 ml do 1 o para o 2 o tubo da série, do 2 o para o 3 o etc..., desprezando o último ml no penúltimo tubo, sem colocá-lo, portanto no tubo testemunha. Deve-se agitar antes de transferir (por rinsagem); 6) Acrescentar 1 ml de Ag ou 2% em cada tubo; 7) Levar à estufa por horas a 37 C; III - INTERPRETAÇÃO - Nos tubos com aglutinação completa haverá a clarificação da coluna líquida com formação de grumos no fundo do tubo, que dificilmente se desprendem sob leve agitação; - Nos tubos com aglutinação incompleta haverá uma clarificação parcial, com formação de pouca quantidade de grumos no fundo do tubo; - Nos tubos negativos a coloração permanece branco-leitosa e sem formação de grumos; NOTA: Sangue hemolisado não é utilizado para esta prova, devido à ocorrência de reação da hemoglobina com o fenol do diluente, ficando semelhante à uma aglutinação. Conduzindo, portanto a um falso resultado. Técnica PLT (Resumo, mais usada) 1 o Identificar o primeiro tubo com o n o da amostra; 2 o Colocar 0,08 ml de soro no 1 o tubo; 0,04 2 o tubo; 0,02 3 o tubo; 0,01 4 o tubo; 0,005 5 o tubo; 3 o Colocar 2ml de Antígeno a 1%, em cada tubo; 4 o Tampar os tubos agitando a grade; 5 o Incubar a 37 o C - 40/48 horas Interpretação dos resultados Interpretação da Soro-Aglutinação em Bovinos: Títulos observados em animais infectados nem sempre são significativos e podem ser baixos principalmente em brucelose crônica em que podemos ter unicamente IgG. Também, em infecções crônicas de longa duração a prova pode ser negativa por existir somente a IgG1.

9 33 O antígeno usado é a Cepa 1119/3 de Brucella abortus com uma concentração celular bastante alta (10-12%) e PH é de 6,4 a 7,0. Técnica Laboratorial: I - MATERIAL 1) Antígeno para o diagnóstico da Brucelose pelo método de aglutinação em placas. (Cristal Violeta + Verde Brilhante - Azul); 2) Soro; 3) Caixa de Huddleson completa; 4) Pipetas de Bang (uma para cada amostra); 5) Conta-gotas calibrado para que cada gota tenha 0,03 ml ou pipeta de 1 ml - 1/100 ml; 6) Palitos plásticos para misturar o soro (ou bastões de vidro); 7) Relógio de laboratório; 8) Toalha de papel; 9) Um recipiente com água para a deposição de pipetas; II - TÉCNICA 1) Distribuir as porções do soro no sentido vertical da placa, 0,08-0,04-0,02-0,01-0,005; 2) Colocar uma gota de antígeno em cada quadrado (0,03); 3) misturar com o auxílio de palito a partir do título maior para o menor; 4) Promover 3-4 rotações da placa; 5) Marcar 4 minutos; 6) Promover nova rotação aos 4 minutos; 7) Marcar novamente 4 minutos; 8) Leitura aos 8 minutos; III - INTERPRETAÇÃO DA PROVA RÁPIDA EM PLACA Na Interpretação devem ser consideradas duas situações: Tabela 1- Interpretação do teste do 2-ME para fêmeas com idade igual ou superior a 24 meses, vacinadas entre três e oito meses de idade Teste de soroaglutinação lenta (UI/ml) Teste do 2-ME (UI/ml) Interpretação 25 <25 negativo 50 <25 inconclusivo positivo UI - Unidade Internacional Tabela 2- Interpretação do teste do 2-ME para fêmeas não vacinadas e machos, com idade superior a oito meses. Teste de soroaglutinação lenta (UI/ml) Teste do 2-ME (UI/ml) Interpretação 50 <25 negativo 100 <25 inconclusivo positivo UI - Unidade Internacional 7.2. Prova Lenta em Tubo (PLT) Detecta tanto IgM como IgG, mas apresenta menos reações inespecíficas do que a rápida em placa devido à menor concentração celular do antígeno (0,045%), ph 6,4 a 7,0. A Brucella abortus, cepa lisa inativada apresenta, em cães, reações heterólogas com Brucella melitensis e Brucella ovis (Wright, 1897).

10 32 6. PROPRIEDADES DAS IMUNOGLOBULINAS PROPRIEDADES IgM IgG PROVA EMPREGADA 1) Peso Molecular (daltons) PR 2) Constante de Sedimentação 19S 7S PR (cm/seg.) 3) Termoestabilidade Lábil - 65 C Bov. 15 Estável ( C) IC - 56 C Sui. 16h 4) Ação do ph (3-4) Inibição Estável AAT 5) Ação de Radical Tiol Redução de Pontes S-S Não Redução RME / PLT de pontes S-S 6) Estrutura Pentâmera Dímera 7) Capacidade Aglutinante X > X < 6. REAÇÕES IMUNOLÓGICAS NOS ANIMAIS 6.1. Reações Hetero Específicas (Cruzadas) Podem ocorrer tanto no homem como nos animais. Estas reações que se observam em indivíduos não infectados com Brucella spp. podem ser devido a diversos agentes como (Vibrio cholerae, Pasteurella spp, Francisella spp, Salmonella spp, Proteus vulgaris e Shigella spp), e também em vacinações contra algumas enfermidades, como a cólera humana. Geralmente os títulos não são altos e se podem diferenciar por provas complementares. Os anticorpos são do tipo IgM, têm um caráter transitório e não complicam o diagnóstico. Nos últimos anos se tem comprovado que a Yersinia enterocolitica, tipo IX (O - tipo 9) causa em certas regiões reação cruzada com Brucella spp com título alto. A única maneira de fazer o diagnóstico diferencial é o emprego do Antígeno Específico para a Yersinia enterocolítica. As reações se devem à semelhança dos antígenos lipopolissacarídeos superficiais das bactérias 6.2. Fenômeno de Zona O fenômeno consiste em que um soro não aglutine nas diluições mais baixas porém, nas mais altas ocorre uma aglutinação intensa. Os anticorpos pertencem à classe IgG. Os dois sítios de combinação do anticorpo reagem com dois sítios de reação de uma mesma Brucella spp. Os determinantes antigênicos das Brucellas são rapidamente saturados pelos anticorpos e se forma um complexo primário antígeno-anticorpo mas é bloqueada a formação das pontes intercelulares não aparecendo a aglutinação. Em alguns soros é possível resolver o problema com a adição de NaCl a 5% ao antígeno. Muitas vezes se trata de um fenômeno causado pela má qualidade dos antígenos usados no diagnóstico ou por soros altamente contaminados que ocasionam uma reação aglutinóide. 7. PROVAS DE HEMODIAGNÓSTICO BÁSICAS DE ROTINA 7.1. Prova Rápida em Placa (PRP) Utiliza-se em grande escala. É de alta sensibilidade mas de baixa especificidade, portanto, as reações inespecíficas se apresentam com mais freqüência. Isto se deve por detectar tanto IgM como IgG2 mas não detecta IgG1. Em situações de temperaturas elevadas, ou em ambientes favoráveis à desidratação, as reações poderão ser aceleradas, podendo ocorrer títulos mais elevados, comparativamente, às realizadas a temperaturas ambientais e condições de umidade adequadas (Huddleson e Abe1, 1928).

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12 30 3. PROVAS BÁSICAS Provas com alta sensibilidade e baixa especificidade. Detectam IgG e IgM. - PLT - Prova Lenta em Tubo - PRP - Prova Rápida em Placa - PAL - Prova do Anel em Leite ( Ring Test ). - FC - Fixação do Complemento. 4. PROVAS SUPLEMENTARES Alta sensibilidade e alta especificidade, detectando somente IgG. - AAM - Antígeno Acidificado Modificado, (PRP com inibição de IgM). -AAT - Antígeno Acidificado Tamponado, ph 3,65 Card Test. - RME - Redução por Mercaptoetanol. - PR - Precipitação pelo Rivanol. - IC - Inativação pelo Calor: 65 C - Bovinos; 56 C - Suínos; - HAI - Hemaglutinação Indireta. - COOMBS - Anticorpos Incompletos (Prova da Antiglobulina). - PSA Plasma Sêmen Aglutinação. - AMV - Aglutinação Muco-Vaginal. - ELISA - Enzim Link Immunoassay. - IAG/Imunodifusão em Ágar Gel - Diferenciação de títulos pós-vacinais. 5. MODELO DE PRODUÇÃO DAS IMUNOGLOBULINAS NA BRUCELOSE BOVINA Tem-se demonstrado que terneiras vacinadas com Brucella abortus Cepa B19, na idade de 3 a 8 meses respondem produzindo anticorpos das classes IgM e IgG. As IgM são as primeiras a se formar podendo ser detectadas de 5 a 7 dias depois da vacinação e alcançam seu pico entre os 13 e 21 dias. Depois sua concentração diminui, mas sem que desapareçam totalmente durante vários meses. As IgG se formam mais tarde entre 14 a 21 dias depois da vacinação e alcançam sua máxima concentração entre 28 a 42 dias. No animal vacinado as IgG (7S) declinam rapidamente e desaparecem antes que os anticorpos IgM (19S) (Figura 1). Algo similar ocorre com os bovinos que se infectam com Brucella abortus virulenta, mas a seqüência na produção e persistência das imunoglobulinas nestes animais tem uma importante diferença com a observada no bovino vacinado quando jovem: à medida que a infecção progride as IgG alcançam um nível mais alto e persistem por períodos mais prolongados. As IgM declinam e tendem a desaparecer. As IgG se estabi1izam ou decrescem, mas não desaparecem. Nos casos crônicos de brucelose humana e animal, a classe principal de imunoglobulinas presente e muitas vezes a única é a IgG. As IgG estão ligadas, estreitamente, a um estímulo antigênico forte. Sua presença permanente está relacionada com um estado infeccioso progressivo, ativo, ou com uma enfermidade crônica. Com a repetição do estímulo elas aumentam rapidamente. A resposta secundária das IgM se comporta como um simples estímulo primário. No homem e nos animais o desaparecimento das IgG significa geralmente a eliminação da infecção, ou seja, a cura. Em algumas espécies, particularmente no homem e ovinos, os anticorpos específicos em casos crônicos podem não ser aglutinantes, comportando-se como "anticorpos incompletos" ou univalentes. Estes anticorpos pertencem à classe IgG e IgA e é possível. detectá-los mediante a prova de anti-globulina de Coombs.

13 29 leite, plasma seminal, muco vaginal, etc. Não há nenhuma prova imunológica que, aplicada isoladamente, permita descobrir a totalidade dos casos de brucelose. No diagnóstico individual se obtém os melhores resultados quando se aplicam vários procedimentos que devem ser interpretados em conjunto. Temos excelentes procedimentos de diagnóstico como a soroaglutinação em placa e tubo e fixação de complemento que se usam como provas básicas nos programas de brucelose animal. Outros procedimentos, como a prova do anel em leite se aplicam com êxito na vigilância epidemiológica de áreas controladas e livres de infecção e também para se conhecer a taxa de rebanhos infectados numa bacia leiteira. Em bovinos de corte e em suínos a vigilância pode se realizar a nível de estabelecimentos ou em centros de comercialização (exposições, feiras e remates) e abate (matadouros, frigoríficos) por meio de provas sorológicas sensíveis como o "Card Test". Tem-se desenvolvido várias provas diagnósticas denominadas complementares para resolver diferentes problemas, tais como; c) Eliminar ou diminuir reações heteroespecíficas; d) Detectar a presença de anticorpos incompletos; e) Diagnosticar corretamente um maior número de casos, especialmente os crônicos; f) Diferenciar títulos vacinais dos títulos de infecções; g) Uso em rebanhos problemas; As provas sorológicas complementares têm especial aplicação nos rebanhos problemas. Classificam-se como rebanhos problemas àqueles nos quais a infecção persiste apesar de rigorosa aplicação das provas básicas e eliminação dos positivos. Outra classificação de rebanhos problemas é para aqueles que apresentam prova do anel em leite positiva de forma repetida, mas o exame sorológico individual de todos os animais é negativo. Em outros rebanhos livres de brucelose, há provas sorológicas de títulos baixos, sem evidência epidemiológica de infecção. 2. SUMÁRIO DAS PROVAS MAIS USADAS NO DIAGNÓSTICO DA BRUCELOSE 2.1. Soro Sangüíneo - Prova de aglutinação rápida em placa (Huddleson e Abel, 1928). - Prova de aglutinação em tubo (Wright, 1897). - Prova de fixação do complemento. - Prova de redução por mercaptoetanol. - Prova de precipitação por rivanol. - Prova de inativação pelo calor a 65 C para bovinos, (Suplementar). - Prova de inativação pelo calor a 56 C para suínos, (Suplementar). - Prova de aglutinação em placa com antígeno acidificado (1956). - Prova do antígeno acidificado tamponado ("Card Test" ou Rosa de Bengala) (1965). - Prova da Coombs (anti-globulina). - Prova de hemoaglutinação indireta. - ELISA. - Difusão em Ágar Gel Plasma Sangüíneo - Prova com antígeno acidificado tamponado ("Card Test" ou Rosa de Bengala) Leite - Prova do anel em leite com amostras compostas ( Ring Test ). - Prova do anel em leite de animais individuais ( Ring Test ). - Prova em placa com soro de leite. - Prova do anel com creme de leite Muco Vaginal - Prova de aglutinação em tubo Plasma Seminal - Prova de aglutinação em placa. - Prova de aglutinação em tubo.

14 28 FREQÜÊNCIA: Alguns dados de nossas pesquisas: Suínos abatidos em Santa Maria (1969) 44,9% de positivos; Suínos abatidos em Erechim (1969) 37,7% de positivos; Bovinos abatidos em Tupanciretã (1973) 8,7% suspeitos; Eqüinos estabulados em S. Maria (1973) 3,17% positivos; No ano de 2000, num universo de 57 mil amostras, registrou-se 533 (0,86%) bovinos com teste positivo, sendo quase o mesmo número do ano anterior (528). Homem: 2 por acidente de vacinação; 2 trabalhadores de matadouro de bovinos; 1 acadêmico de veterinária e suinocultor. Nota: Em vista da grande prevalência no rebanho bovino e suíno por que não é mais freqüente no homem? Isto ocorre porque a maioria de nossos clínicos (médicos) pouco pensam em brucelose, dificultando o diagnóstico. SINTOMAS: Período de incubação: 20 a 30 dias. Duas formas: aguda e crônica. Aguda: quadro de infecção prolongada com 2 a 4 meses de duração - simulando gripe, malária, tuberculose e/ou febre tifóide. Crônica: se manifesta com ou sem o surto agudo anterior. O quadro clínico tem muita diversidade e variedade de suas manifestações. Não costuma apresentar nada de característico. Manifestações mais comuns: 1.) Manifestações Gerais: febre intermitente; sudorese; fraqueza; fadiga; dores generalizadas; especialmente da região occipital; perda de peso; anemia; etc. 2.) Manifestações respiratórias: tosse; escarro sanguinolento; hemoptises; pleuriz seco ou com derrame; broncopneumonia; abcessos pulmonares. 3.) Manifestações do aparelho gênito-urinário: piúria; cistite; pielite; orqui-epididinite; prostatite; salpingite; amenorréia; impotência; esterilidade. 4.) Manifestações gastrointestinais: anorexia; náuseas; tensão e dores abdominais; reto-colites; etc. 5.) Manifestações nervosas: nervosismo; neurastenia; cefaléia; insônia; terror noturno; perda de memória; nevralgias; neurites; etc. 6.) Manifestações ósseas, musculares e cutâneas: reumatismo; miosites; artralgias; artrites; espondilites; erupções máculopapulosas; eritemas; etc. De todos, os mais constantes da forma crônica são: astenia; (fraqueza, debilidade orgânica); neurastenia; reumatismo; artralgias; dores na nuca; febre e tosse. Não é lícito a um médico fazer o diagnóstico de uma neurastenia, neurose e reumatismo, sem considerar, entre outras possibilidades, a da brucelose. Nota: Os sintomas foram considerados de caráter ilustrativo, pois não pretendemos entrar em campo de outras áreas profissionais. PROFILAXIA: 5.1.) Sendo raríssima a transmissão inter-humana a profilaxia baseia-se no controlar a doença nos animais; 5.2.) Deve-se legislar; 5.3.) Manipular no laboratório com precaução; 5.4.) Higiene pessoal (roupa, calçado - limpar e desinfetar); 5.5.) Saneamento dos locais (para evitar contato pela via aerógena); 5.6.) Leite e subprodutos - tratamento térmico adequado; 5.7.) Medidas prévias no abate de animais infectados. 5.8.) Uso de luvas para os expostos; 5.9.) Carne e seus subprodutos - tratamento térmico; 5.10.) Na Rússia usa-se vacina como a Cepa 19 BA de Brucella abortus aos expostos; Imunização temporária e as revacinações podem produzir manifestações patológicas. DIAGNÓSTICO SOROLÓGICO DA BRUCELOSE 1. INTRODUCÃO Há uma grande variedade de provas diagnósticas para se detectar anticorpos específicos anti-brucella ssp no soro e plasma sangüíneo e em outros líquidos orgânicos, como

15 27 vigilância sanitária e de monitoramento deste Programa. Art. 91. São atribuições específicas do serviço de inspeção oficial: I - realizar o abate sanitário de animais identificados como positivos para brucelose ou tuberculose; II - cumprir procedimentos higiênico-sanitários e fazer o julgamento e destinação de carcaças e vísceras, conforme previsto na legislação pertinente; III - comunicar ao serviço de defesa oficial os achados de matança, em carcaças e vísceras, sugestivos de tuberculose. Capítulo XXIII - Do controle da brucelose e da tuberculose em suínos Art. 92. O controle da brucelose, causada pela Brucella suis, e da tuberculose, causada pelo Mycobacterium bovis, em suínos, é realizado conforme o disposto na legislação sanitária pertinente, da Secretaria de Defesa Agropecuária, que estabelece regras de certificação de granjas de suínos. Parágrafo único. O Departamento de Defesa Animal poderá baixar normas complementares se a situação epidemiológica o justificar. Capítulo XXIV - Do controle da brucelose e da tuberculose em ovinos e caprinos Art. 93. A brucelose dos caprinos e ovinos, causada por Brucella melitensis, é considerada exótica no Território Nacional, devendo ser mantidas medidas de vigilância sanitária para evitar sua introdução e difusão no país. Art. 94. O Departamento de Defesa Animal poderá baixar normas específicas para o controle e erradicação da tuberculose dos ovinos e caprinos se a situação epidemiológica o justificar BRUCELOSE HUMANA EPIDEMIOLOGIA ANIMAIS COMO FONTE DE INFECÇÃO: Cabras; suínos; bovinos; eqüinos; ovinos; búfalos; cães. MODOS DE TRANSMISSÃO: 2.1.) INGESTÃO: com penetração através do tubo gastrointestinal ou mucosa da garganta ) leite e derivados; ) carne e derivados; ) vísceras; ) medula espinhal; ) legumes crus contaminados pelos animais; ) água. 2.2.) CONTATO: penetração através da pele ou mucosas. Materiais infectados: ) secreções vaginais; ) fetos abortados; ) placentas; ) urina; ) fezes; ) carcaças. a) Pessoas que têm contato mais freqüente: 1.) pessoal de matadouros; 2.) trabalhadores rurais; 3.) trabalhadores de fábricas de embutido; 4.) veterinários; 5.) pessoal de laboratório; 6.) donas de casa. 2.3.) INALAÇÃO: de substâncias dessecadas de origem animal ) pó da lã; ) pó dos veículos de transporte; ) pó da limpeza de matadouros; ) pó da limpeza de explorações pecuárias (tambos, estábulos, pocilgas, etc.); ) pó da limpeza de laboratórios. 2.4.) INOCULAÇÃO ACIDENTAL: ) veterinários; ) vacinadores; ) pessoal de laboratório.

16 26 Parágrafo único. A partir de data a ser determinada pelo Departamento de Defesa Animal, o trânsito interestadual de bovinos e bubalinos destinados à reprodução só será permitido a animais com origem em estabelecimento de criação certificado como livre de brucelose e de tuberculose ou em estabelecimento de criação monitorado para brucelose e tuberculose. Art. 85. A partir do dia 1o de janeiro de 2004, a emissão da GTA para trânsito de bovinos ou bubalinos fica condicionada à comprovação de vacinação contra a brucelose no estabelecimento de criação de origem dos animais, de acordo com o disposto no Capítulo III. Parágrafo único. O prazo especificado neste artigo poderá ser antecipado a critério do serviço de defesa oficial do Estado. Art. 86. O trânsito internacional de animais, sêmen e embriões, reger-se-á pelas normas dispostas no Código Zoosanitário Internacional, da Organização Internacional de Epizootias (OIE), ou conforme normas especificadas em acordos internacionais firmados. Capítulo XXI - Da participação em exposições, feiras, leilões e outras aglomerações de animais Art. 87. Na emissão da GTA para bovinos e bubalinos destinados à participação em exposições, feiras, leilões e outras aglomerações de animais devem ser observados os seguintes requisitos: I - para a brucelose: a) atestado com resultado negativo a teste de diagnóstico para brucelose, efetuado até 60 dias antes do início do evento, para animais acima de oito meses de idade, emitido por médico veterinário credenciado ou, até 30 de junho de 2002, por médico veterinário cadastrado; b) excluem-se dos testes os animais cujo destino final seja o abate, as fêmeas de até 24 meses de idade, desde que vacinadas entre três e oito meses de idade, os animais castrados e os animais procedentes de estabelecimento de criação livre de brucelose; II - para a tuberculose: a) atestado com resultado negativo a teste de diagnóstico para tuberculose, efetuado até 60 dias antes do início do evento, para animais de idade igual ou superior a seis semanas, emitido por médico veterinário credenciado ou, até 30 de junho de 2002, por médico veterinário cadastrado; b) excluem-se do disposto no item anterior os animais cujo destino final seja o abate e aqueles provenientes de estabelecimento de criação livre de tuberculose. Art. 88. A critério do serviço de defesa oficial estadual, os atestados com resultado negativo para brucelose e tuberculose poderão ser dispensados para animais de rebanho geral destinados à participação em leilões. Parágrafo único. A participação de animais de rebanho geral em leilões fica condicionada, a partir do dia 1º de janeiro de 2004, à comprovação de vacinação contra a brucelose no estabelecimento de criação de origem dos animais, de acordo com o disposto no Capítulo III. Art. 89. A partir de data a ser determinada pelo Departamento de Defesa Animal, a emissão de GTA para participação de bovinos e de bubalinos em exposições, em feiras e em leilões de animais registrados fica condicionada à origem em estabelecimento de criação livre de brucelose e tuberculose. Capítulo XXII - Do papel do serviço de Inspeção Oficial Art. 90. O serviço de inspeção oficial participa do Programa Nacional de Controle e Erradicação da Brucelose e Tuberculose Animal, em colaboração com o serviço de defesa oficial, visando melhorar a eficácia das ações de

17 25 Art. 82. O ingresso de fêmeas com idade igual ou superior a 24 meses e de machos reprodutores em estabelecimento de criação monitorado para brucelose e tuberculose fica condicionado a: I - terem origem em estabelecimento de criação livre de brucelose ou em estabelecimento de criação monitorado para brucelose e tuberculose, ou realizar dois testes de diagnóstico para brucelose, cumprindo os seguintes requisitos: a) os dois testes deverão ter resultado negativo; b) o primeiro teste deverá ser realizado durante os 30 dias que antecedem o embarque e o segundo teste até 30 dias após o ingresso no estabelecimento de criação de destino, sendo que os animais deverão permanecer isolados desde o ingresso no estabelecimento até o segundo resultado negativo; c) os testes serão realizados por médico veterinário credenciado, por laboratório credenciado ou por laboratório oficial credenciado. II - terem origem em estabelecimento de criação livre de tuberculose ou em estabelecimento de criação monitorado para brucelose e tuberculose, ou realizar dois testes de diagnóstico para tuberculose, cumprindo os seguintes requisitos: a) os dois testes deverão ter resultado negativo; b) o primeiro teste deverá ser realizado durante os 30 dias que antecedem o embarque e o segundo teste até 90 dias após o ingresso no estabelecimento de criação de destino, num intervalo mínimo de 60 dias entre testes, sendo que os animais deverão permanecer isolados desde o ingresso no estabelecimento até o segundo resultado negativo; c) os testes serão realizados por médico veterinário credenciado. Art. 83. O médico veterinário oficial poderá, em qualquer momento e sem ônus para o proprietário, coletar material biológico para testes de diagnóstico para brucelose ou tuberculose e acompanhar ou realizar testes de diagnóstico para tuberculose, com o objetivo de verificar e validar a condição sanitária do estabelecimento de criação monitorado para brucelose e tuberculose. Capítulo XX - Do controle do trânsito de bovinos e bubalinos Art. 84. Para fins de trânsito interestadual de machos e de fêmeas, das espécies bovina e bubalina, destinados à reprodução, é obrigatória a apresentação de resultados negativos aos testes de diagnóstico para brucelose e tuberculose, obedecendo o que se segue: I - a emissão da GTA fica condicionada à apresentação dos atestados de exames negativos para brucelose e tuberculose, emitidos por médico veterinário credenciado ou, até 30 de junho de 2002, por médico veterinário cadastrado, os quais deverão permanecer anexados à via da GTA que acompanha os animais; II - os testes de diagnóstico devem ter sido realizados por médico veterinário credenciado, por laboratório credenciado, por laboratório oficial credenciado, ou, até 30 de junho de 2002, por médico veterinário cadastrado; III - os atestados de exames negativos para brucelose e tuberculose serão válidos por 60 dias, a contar da data da coleta de sangue para diagnóstico de brucelose e da realização do teste para diagnóstico de tuberculose; IV - os testes de diagnóstico para brucelose são obrigatórios para os animais especificados no artigo 19, excetuando-se os animais com origem em estabelecimento de criação certificado como livre de brucelose ou em estabelecimento de criação monitorado para brucelose e tuberculose; V - os testes de diagnóstico para tuberculose são obrigatórios para animais de idade igual ou superior a seis semanas, excetuando-se os animais com origem em estabelecimento de criação certificado como livre de tuberculose ou em estabelecimento de criação monitorado para brucelose e tuberculose.

18 24 Tabela 6- Tabela de amostragem para o reteste periódico em estabelecimento de criação monitorado. Nº de fêmeas a partir de 24 m de idade e de machos reprod. existentes no estabelec >5000 Nº de fêmeas a partir de 24 m de idade e de machos reprod. que devem ser testados (*) (*) Parâmetros de amostragem: (1) probabilidade de detecção de um ou mais animais reagentes (grau de confiança) = 95%; (2) porcentagem mínima esperada de animais reagentes no rebanho = 1%. Art. 76. No caso de serem detectados um ou mais animais reagentes positivos aos testes de diagnóstico para brucelose durante as amostragens especificadas nos artigos 74 e 75, em outro teste realizado sob responsabilidade de médico veterinário credenciado ou oficial, ou após confirmação de suspeita clínica, todas as fêmeas a partir de 24 meses de idade e todos os machos reprodutores, não incluídos na amostra inicial, devem ser testados para essa enfermidade. Art. 77. No caso de serem detectados um ou mais animais reagentes positivos aos testes de diagnóstico para tuberculose durante as amostragens especificadas nos artigos 74 e 75, em outro teste realizado por médico veterinário credenciado ou oficial, ou após confirmação de suspeita clínica, todas as fêmeas a partir de 24 meses de idade e todos os machos reprodutores, não incluídos na amostra inicial, devem ser testados para essa enfermidade. Art. 78. O certificado de estabelecimento de criação monitorado para brucelose e tuberculose tem validade de 12 meses. Art. 79. A renovação do certificado de estabelecimento de criação monitorado para brucelose e tuberculose deverá ser requerida anualmente na unidade local do serviço de defesa oficial, apresentando resultado negativo nos testes de diagnóstico realizados e na condição de todos os animais reagentes positivos para brucelose e/ou tuberculose serem sacrificados ou destruídos, conforme o disposto no Capítulo IX. Parágrafo único. A renovação do certificado pode ser prorrogada por um período máximo de 90 dias quando da necessidade de realizar novo teste de diagnóstico para brucelose ou tuberculose em animais que apresentem resultados inconclusivos no reteste anual. A prorrogação por igual período poderá ser autorizada se for necessário sacrificar ou destruir animais reagentes positivos. Art. 80. O médico veterinário credenciado deverá informar a unidade local do serviço de defesa oficial da data de realização dos testes mencionados no artigo anterior, com antecedência mínima de 15 dias. Art. 81. A detecção de lesões sugestivas de tuberculose durante a inspeção sanitária postmortem de animais provenientes de estabelecimento de criação monitorado para brucelose e tuberculose implica no envio de amostras de lesões suspeitas a laboratório indicado pelo Departamento de Defesa Animal e, em se confirmando infecção por Mycobacterium bovis, todas as fêmeas com idade igual ou superior a 24 meses e todos os machos reprodutores devem ser submetidos a testes de diagnóstico para tuberculose, destinando os reagentes positivos ao sacrifício ou destruição, conforme o disposto no Capítulo IX.

19 23 Art. 73. O estabelecimento de criação monitorado para brucelose e tuberculose fica obrigado a: I - cumprir medidas de controle e erradicação da brucelose e da tuberculose, previstas neste Regulamento; II - ter supervisão técnica de médico veterinário credenciado; III - utilizar sistema de identificação individual das fêmeas com idade igual ou superior a 24 meses e dos machos reprodutores, indicado pelo Ministério da Agricultura e do Abastecimento, ou, na ausência deste, possuir sistema de identificação animal próprio, desde que aprovado pelo serviço de defesa oficial; IV - vacinar todas as fêmeas, entre três e oito meses de idade, contra a brucelose, com vacina B19; V - submeter a testes de diagnóstico para brucelose e tuberculose as fêmeas de idade igual ou superior a 24 meses e os machos reprodutores, sacrificando ou destruindo os animais reagentes positivos, de acordo com o disposto no Capítulo IX; VI - custear as atividades de controle da brucelose e da tuberculose. Art. 74. O primeiro teste de diagnóstico para brucelose e tuberculose efetuado no estabelecimento de criação monitorado será realizado por amostragem, conforme a Tabela 5, sendo os animais escolhidos por método aleatório: Tabela 5- Tabela de amostragem para o teste inicial em estabelecimento de criação monitorado. Nº de fêmeas a partir de 24m de idade e de machos reprod. existentes no estabelec >5000 Nº de fêmeas a partir de 24 m de idade e de machos reprod. que devem ser testados (*) (*) Parâmetros de amostragem: (1) probabilidade de detecção de um ou mais animais reagentes (grau de confiança) = 99%; (2) porcentagem mínima esperada de animais reagentes no rebanho = 1% Art. 75. Após o primeiro teste por amostragem, especificado no artigo anterior, o estabelecimento de criação deverá manter rotina de diagnóstico, realizando reteste periódico também por amostragem, nas seguintes condições: I - os testes de diagnóstico para brucelose devem ser realizados num intervalo de 10 a 12 meses; II - os testes de diagnóstico para tuberculose devem ser realizados num intervalo de 10 a 12 meses, até obter-se dois resultados negativos consecutivos em todos os animais testados, passando então a ser realizados num intervalo de 18 a 24 meses; III - o reteste periódico será realizado de acordo com a Tabela 6:

20 22 IV - a realização do terceiro teste de rebanho, especificado no item II, deverá ser acompanhada por médico veterinário do serviço de defesa oficial estadual, cabendo ao médico veterinário credenciado informar a unidade local do serviço de defesa oficial da data do teste, com antecedência mínima de 15 dias. Capítulo XVIII - Da certificação de estabelecimento de criação livre de tuberculose Art. 64. O certificado de estabelecimento de criação livre de tuberculose será emitido pela Delegacia Federal de Agricultura, condicionado à obtenção de três testes de rebanho negativos consecutivos, realizados num intervalo de 90 a 120 dias entre o primeiro e o segundo testes e de 180 a 240 dias entre o segundo e o terceiro testes. Art. 65. O certificado de estabelecimento de criação livre de tuberculose tem validade de 12 meses. Art. 66. A renovação do certificado de estabelecimento de criação livre de tuberculose deverá ser requerida anualmente na unidade local do serviço de defesa oficial, apresentando resultado negativo nos testes de diagnóstico para tuberculose, realizados em todos os animais com idade igual ou superior a seis semanas. Art. 67. O médico veterinário credenciado deverá informar a unidade local do serviço de defesa oficial da data de realização dos testes mencionados no artigo anterior, com antecedência mínima de 15 dias. Art. 68. A renovação do certificado pode ser prorrogada por um período máximo de 90 dias quando da necessidade de realizar novo teste de diagnóstico para tuberculose em animais que apresentem resultado inconclusivo no reteste anual. Art. 69. A detecção de um ou mais animais reagente(s) positivo(s) em teste realizado por médico veterinário credenciado ou por médico veterinário oficial, ou após confirmação de suspeita clínica, resultará na suspensão temporária do certificado de estabelecimento de criação livre de tuberculose. Para retorno à condição de livre é necessário obter dois testes de rebanho negativos, realizados com intervalo de 90 a 120 dias, sendo o primeiro realizado 90 a 120 dias após o sacrifício ou destruição do último animal reagente positivo. Parágrafo único. A realização do segundo teste de rebanho, para retorno à condição de livre, deverá ser acompanhada por médico veterinário do serviço de defesa oficial estadual. O médico veterinário credenciado deverá informar à unidade local do serviço de defesa oficial da data da realização do teste, com antecedência mínima de 15 dias. Art. 70. A detecção de lesões sugestivas de tuberculose durante a inspeção sanitária postmortem de animais provenientes de estabelecimento de criação livre de tuberculose, implica na realização de testes de diagnóstico para tuberculose em todos animais de idade igual ou superior a seis semanas, aplicando-se o disposto no artigo 69. Capítulo XIX - Da certificação de estabelecimento de criação monitorado para brucelose e tuberculose Art. 71. O certificado de estabelecimento de criação monitorado para brucelose e tuberculose será emitido pela Delegacia Federal de Agricultura. Art. 72. A certificação de estabelecimento de criação monitorado para brucelose e tuberculose é de adesão voluntária e restrita a estabelecimentos de criação especializados em pecuária de corte, devendo ser formalmente solicitada na unidade local do serviço de defesa oficial, na qual o estabelecimento de criação encontra-se cadastrado.