CULTURA DE TECIDOS APLICADA À MANUTENÇÃO DE GERMOPLASMA IN VITRO E AO MELHORAMENTO GENÉTICO DO MARACUJÁ (Passiflora spp.).

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1 CULTURA DE TECIDOS APLICADA À MANUTENÇÃO DE GERMOPLASMA IN VITRO E AO MELHORAMENTO GENÉTICO DO MARACUJÁ (Passiflora spp.). Dra. Ilene Ribeiro da Silva Passos Pesquisador Científico -VI IAC- CPD Recursos Genéticos Vegetais.

2 Fonte: Matos et al. (2005) INTRODUÇÃO

3 Conservação de Recursos Genéticos Há muito tempo, a conservação de recursos genéticos tem sido reconhecida como um componente essencial no melhoramento de plantas. (Withers & Williams, 1998)

4 Manutenção e Conservação de Germoplasma. a) Evitar a erosão genética (conservação). b) Manter coleção de estudos (manutenção). Estratégias: In vivo In situ In vitro (em cultura/ criopreservação).

5 Manutenção de germoplasma de maracujá no campo. Vantagens: Possibilita a caracterização agronômica. Estabilidade genética. Desvantagem: Vulnerável.

6 Manutenção e conservação de germoplasma de maracujá in vitro. Vantagens: Ocupa menos espaço. Demanda menos mão de obra. Desvantagens: Variação somaclonal..

7 Melhoramento genético do maracujá. Métodos Clássicos: (Visam aumentar os alelos favoráveis na população) a) Seleção massal (alta herdabilidade) quando existe bastante variabilidade Ex. P. alata (Martins, 2002). b) Por meio de cruzamentos e seleção/ teste de progênie Ex. Série IAC -270 e híbridos IAC-275, IAC-273, IAC 277 (Meletti et al.,2000).

8 Métodos Biotecnológicos. Transformação genética. modifica uma característica em cultivar elite. demanda testes moleculares e testes de campo. b) Hibridação somática. recombina genótipos: entre espécies ou gêneros diferentes. demanda caracterização do híbrido/ seleção/ retrocruzamentos/ testes de campo. testes moleculares (fusão assimétrica).

9 ESTUDOS EM PASSIFLORA SPP VISANDO A SUA MANUTENÇÃO IN VITRO. 1. Estabelecimento in vitro de plantas. 2. Organogênese adventícia. 3. Meios de cultura e condições ambientais de clonagem (manutenção). 4. Meios de cultura e condições ambientais para conservação in vitro.

10 Estabelecimento in vitro de plantas de maracujá. a) Por meio de sementes. b) Por meio de explantes vegetativos: explorando gemas pré-existentes. pela organogênese de novo.

11 Por meio de sementes. Embebição prévia. Descontaminação. Meio de cultura. Condições ambientais: luz/ temperatura. Qualidade das sementes: estágio de maturação do fruto/ retirada do arilo/ armazenamento.

12 Embebição prévia: importância Evitar a absorção de agentes descontaminantes faz-se a embebição prévia em água destilada antes da descontaminação. Antecipar a absorção de água pela semente, antes de ser colocada em meio de cultura.

13 ABSORÇÃO DE ÁGUA PELA SEMENTE Fase I embebição, onde há uma rápida absorção de água pela semente. Fase II as sementes, praticamente, param de absorver água. Fase III as sementes voltam a absorver água e a respirar intensamente e o eixo embrionário apresenta crescimento visível. (Carvalho e Nakagawa, 1988)

14 Dormência em sementes de Passiflora nitida. A dormência em P. nitida não está relacionada com a impermeabilidade do tegumento (Melo, 1999). Sementes de várias espécies de Passiflora absorvem água com maior velocidade durante 2 a 3 horas de embebição (fase I). GA 3 Tabela 1 (Passos et al., 2004).

15 Descontaminação. Retirar restos de arilo com pano Perfex ou sapólio, em casos extremos. Hipoclorito de cálcio 2%. Enxágüe com solução ácida para tirar os resíduos de hipoclorito de cálcio. Enxaguar muito bem as sementes com água esterilizada.

16 Passiflora alata Curtis (7,0x).

17 Passiflora foetida L.

18 Passiflora cincinnata Mast (9,0x).

19 Passiflora edulis Sims (8,5x).

20 Passiflora nitida Kunth (8,5x).

21 Sementes de Passiflora alata,p. edulis e P.nitida.

22 Meios de cultura para a germinação de sementes. Murashige e Skoog (1962) na metade das concentrações de sais, vitaminas e açúcar. Solidificado com agar. Condições ambientais:luz/ temperatura P. edulis, P. alata, P. nitida, P. suberosa, P. foetida e P. kermesina (temperatura 28ºC). P.setacea, P. cincinnata (luz). P. quadrangularis.

23 Germinação in vitro de Passiflora alata.

24 Germinação in vitro de P. cincinnata (8,0x).

25 TABELA 1. Número médio de sementes de Passiflora nitida germinadas aos 14, 28 e 50 dias após a semeadura quando tratadas com 3 dosagens (0; 500; 1000 mg.l-1) de GA3 nos tratamentos sob luz (L) e escuro (E) (média ± desvio padrão). Campinas, SP, Tempo/ 14 dias 28 dias 50 dias Tratamento (mg.l -1 GA 3 ). Luz 0 0,10±0,31ab 1,30±1,15ab 2,30±1,15b Luz 500 0,90±0,73c 2,60±0,96bc 3,40±0,96bc Luz ,80±1,31c 4,20±0,63d 4,30±0,67c Escuro 0 0,00±0,00a 0,33±0,50a 0,44±0,72a Escuro 500 0,77±0,83bc 3,00±0,70c 3,33±1,00bc Escuro ,66±1,11c 3,66±1,11d 4,13±0,83c

26 Estabelecimento in vitro por meio de explantes vegetativos. explorando gemas pré-existentes. pela organogênese de novo.

27 Estabelecimento in vitro por meio de explantes vegetativos explorando as gemas já existentes. Explantes: ápices meristemáticos de caule. segmentos nodais. 2. Meio de cultura: MS com ou sem 6-Benzilaminopurina. 3. Limitação: Contaminações material de campo e órgãos mais velhos.

28 Organogênese de novo ou adventícia. Estratégia para estabelecer plantas in vitro. Estratégia para multiplicação de plantas in vitro. Estratégia para obtenção de plantas transformadas. Via principal de regeneração de calos provenientes da hibridação somática.

29 Organogênese de novo Meio de cultura: Murashige e Skoog (1962). Explantes: cotilédones, hipocótilos, discos foliares, segmentos internodais. Aditivos: água de coco, tiossulfato de prata ou nitrato de prata. Hormônio vegetal: 6-BA (0,5 2,0 mg.l -1 ) Condições ambientais: Luz (fotoperíodo de 16 horas)/ Temperatura: 25-30ºC. Frasco com tampa ventilada.

30 Organogênese de novo condições de luminosidade. A quantidade de luz fotossinteticamente ativa, medida em µe.m -2.s -2, tem sido bastante variável entre os trabalhos publicados ( µe.m -2.s -2 ). Alexandre (2002) encontrou uma importante interação entre o nível de irradiância e a concentração de sacarose no meio de cultura.

31 Organogênese de novo luminosidade x concentração de sacarose (Alexandre, 2002). Explante: segmentos de hipocótilo. Melhor resposta organogênica: 1,0 mg.l -1 de BAP + 0,1 mg.l -1 de ANA + 10g.L -1 de sacarose µe.m -2.s -2, de irradiância. Maior comprimento de brotos: 1,0 mg.l -1 de BAP + 20g.L -1 de sacarose + 50µE.m -2.s -2, de irradiância.

32 Organogênese de novo em Passiflora alata. (Discos foliares de 7mm, em meio MS + 0,5mg.L -1 de 6-BA + 5,0 mg.l -1 de AgNO 3 )

33 Organogênese de novo em Passiflora cincinnata (raiz não isolada, de plântula em meio MS/2 + 1,0 mg.l -1 de 6-BA).

34 Organogênese de novo em P. cincinnata (Lombardi et al. 2005). Explantes: a) plântulas; b) discos foliares; c) segmentos de raízes. Melhor resposta organogênica: segmentos de raízes com 0,5 mg.l -1 de 6-BA em meio MS com 5% de água de coco.

35 Organogênese de novo em Passiflora edulis (disco foliar de 7mm em meio MS + 2,0 mg.l -1 de 6-BA) (64% de genótipos regenerativos).

36 Organogênese de novo em Passiflora nitida (disco foliar de 7mm em meio MS + 1,0 mg.l -1 de 6-BA+2,5 mg.l -1 de AgNO 3 ).

37 Hibridação somática. Obtida pela fusão de protoplastos, é uma alternativa para a reprodução sexual a fim de combinar (por meio de tratamentos químicos ou por eletrofusão) dois genomas completos, incluindo as organelas citoplasmáticas (Binsfeld, 1999 e refs.).

38 Hibridação somática. 1) Superar incompatibilidades sexuais. 2) Produzir anfidiplóides (fusão simétrica). 3) Transferir parte de um genoma de uma espécie para outra (fusão assimétrica). 4) Transferir o DNA citoplasmático de uma espécie para outra (por meio da obtenção de cíbridos). Visando à obtenção de plantas resistentes a estresses ambientais ou pragas e doenças. (Davey et al., 2005).

39 Hibridação somática. A hibridação somática obtida pela fusão simétrica de protoplastos, está sendo estudada com vistas ao melhoramento genético do maracujá no CPD de Recursos Genéticos Vegetais do I.A. de Campinas, SP. (Matos et al., 2005). Trabalhos pioneiros sobre a fusão de protoplastos em Passiflora spp., por métodos físicos ou químicos, foram efetuados, respectivamente por Otoni et al. (1995) e Dornelas et al. (1995), respectivamente.

40 Isolamento e cultura de protoplastos em Passiflora spp. Para se aplicar a tecnologia da fusão de protoplastos há necessidade de protocolos de isolamento e cultura, bem estabelecidos, disponíveis na literatura e assimilados nos laboratórios. Vieira e Dornelas (1996) apresentam uma importante revisão sobre protocolos para obtenção de plantas regeneradas a partir de protoplastos de espécies de Passiflora.

41 Isolamento e cultura de protoplastos em Passiflora spp. Passos et al (2004b): modificações em protocolos publicados. 1) Retirou-se o 2,4- D do meio K8, para diminuir o budding. 2) Diminuiu-se o intervalo entre trocas de meios, quando se visa a diminuição da osmolaridade 5 dias 3-4 dias.

42 Isolamento e cultura de protoplastos em Passiflora spp. Eficiências de plaqueamento: (Densidade: 1,0 x 10 5 protoplastos /ml; gotas de agarose; K8P/K8) P. edulis: 45,8% P. alata: 36,8% P. nitida: 24,5 %. (Passos et al. 2004b).

43

44 Idade dos cotilédones e efeito da germinação na luz, no isolamento de protoplastos de P. edulis (Matos et al. 2005). ISOLAMENTO A (PRESENÇA DE LUZ) A (AUSENCIA DE LUZ) B (PRESENÇA DE LUZ) B (AUSENCIA DE LUZ) MÉDIA DA IDADE DO EXPLANTE PESO DO MATERIAL VEGETAL (mg) NÚMERO DE PROTOPLASTOS ISOLADOS 6 dias 140,8 2,0X dias 137,0 4,3X dias 297,0 3,5X dias 063,0 2,0X10 5

45 Influência da luminosidade durante a germinação e da idade dos cotilédones no nº de células em divisão de protoplastos em cultura de P. edulis (30 campos x 3 placas) 1= 6 dias; 2=21 dias. Testes 1 CLARO 1 ESCURO 2 CLARO 2 ESCURO NÚMERODE CÉLULAS VIVAS NÚMERODE CÉLULAS MORTAS NÚMERODE CÉLULAS EM PRIMEIRA DIVISÃO NÚMERODE CÉLULAS ACIMADA PRIMEIRA DIVISÃO NÚMERO DE CÉLULAS TOTAIS x±s 2 % % % % % 7,5±1,3 27,43 19±1,5 68,7 0,96±0,01 3,5 0,08±0,06 0,3 27, ,0±0,8 25,00 11±0,3 70,0 0,57±0,27 3,7 0,23±0,21 1, ,6±4 62,48 9,7±0,7 30,9 2,00±0,20 6,4 0,07±0,09 0,2 31, ,6±0,2 40,50 4,9±0,2 40,5 1,80±0, ,5±0,12 4,

46 Influência da luminosidade durante a germinação e da idade dos cotilédones no nº de células vivas e mortas de protoplastos em cultura de P. edulis (30 campos x 3 placas) Células Vivas + Vivas + Mortas Mortas Tratam. Total % Total % Luz/ 6d 8,5 31,2 19,0 68,7 Esc./ 6d 4,8 30,1 11,0 70,0 Luz/ 21d 21,7 69,1 9,7 30,9 Esc/ 21d 6,9 59,6 4,9 40,5

47 Hibridação Somática (P.edulis + P. cincinnata) (Matos et al. 2005)

48 Equipe PESQUISADORES: Dra. Ilene Ribeiro da Silva Passos Dr. Pedro Canisio Binsfeld. Dr. Marcelo Carnier Dornelas. Dra. Laura Maria M. Molina. Dr. Luís Carlos Bernacci. Dra. Marta Dias Soares Scott. Dra. Beatriz Appezato da Glória. Dra. Haiko H. Sawasaki. Dra. Vera Maria Quecini. Alunas de Mestrado: Simone Pacheco Lombardi Giovana Vesechi da C. Matos Estagiários - Iniciação Científica: FAPESP Giovana Vesechi da C. Matos. Maria Aparecida Ribeiro Vieira Mariana C. Z. Mori Bazzo Milena Binatti Ferrari PIBIC Luciana Kiyomi Kinoshita. FUNDAG Mariana Aparecida B. Rosales Voluntários Luciana Rocha Antunes Leonardo Held. Bruna de Paula. Carlos Marcelo Ribeiro.

49 AGRADECIMENTOS Dra. Maria Lúcia Carneiro Vieira (Esalq/Usp). Dr. João Carlos de Oliveira (Unesp/Jabotic.) Dra. Sigrid Luiza Jung Mendaçolli (IAC). Dr. Augusto Tulmann Neto (Cena/Usp). Dr. Francisco Antonio Passos (IAC). Dra. Neiva Izabel Pierozzi (IAC). Técnica de Laboratório: Rauly Máximo Rabello Moretti (IAC).

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