Apostila de Parasitologia Protozoários - Helmintos. Professora Especialista: Rose Felipe

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1 Apostila de Parasitologia Protozoários - Helmintos Professora Especialista: Rose Felipe 2009

2 Parasitologia - Introdução 2

3 I) EXAME DIRETO EXAME MACROSCÓPICO DE PREPARAÇÕES A FRESCO O diagnóstico é realizado pela observação microscópica dos oocistos entre lâminas e lamínulas. O exame direto a fresco é realizado diretamente das fezes diarreicas, ou após a diluição das fezes pastosas, em solução salina a 0,85% (1:5). Examinar com objetiva de imersão. A microscopia de contraste de fase facilita a observação dos parasitas. Observações: O oocisto no exame direto aparece maior que aqueles observados nos esfregaços fixados e corados. Os oocistos apresentam-se como elemento esféricos de 5 a 6 µm de diâmetro, com membrana externa fina, com um citoplasma finalmente granulado, e com mancha negra proeminente, central ou lateral, quer representa os corpos residuais. Os quatro esporozoítos livres aparecem como pequenas manchas dispostas na periferia em forma de "C". O núcleo é visto no centro do organismo (GARCIA et al., 1983; LEMETEIL, 1987; MEHLHORN, 1988). 2) Método de Faust e cols: centrífugo - flutuação 1) Princípio do teste A pesquisa de cistos nas fezes pode ser realizada por diferentes métodos. O método de Faust está baseado na centrifugação e na flutuação em uma solução de Sulfato de zinco. Uma alíquota de fezes é filtrada e posteriormente centrifugada. O sobrenadante é colocado numa solução de Sulfato de zinco e centrifugado. O material a examinar é retirado da parte superficial, tratado com solução de lugol e observado ao microscópio. 2) Aplicação clínica A principal aplicação do método de Faust é a pesquisa de cistos de protozoários, destacando-se a pesquisa de cistos de Iodameba bütschlii, Entamoeba histolytica, Entamoeba coli, Endolimax nana. Outros cistos de protozoários, ovos e larvas de helmintos podem ser pesquisados. 3) Reagentes 3.1 Lugol 1 g de Iodo é macerada com 2 g de Iodeto de potássio. Medir 200 ml de água Tipo I. Adicionar lentamente pequena quantidade desta água com homogeneização constante. Quando houver solubilização total, adicionar o volume restante desta água. Armazenar em um frasco de vidro âmbar e rotular. Transferir 20 ml para um frasco conta-gotas âmbar, o qual será usado no diaa-dia. 3.2 Sulfato de zinco a 33 % 3

4 Preparar uma solução em água Tipo I de modo produzir uma solução de Sulfato de zinco a 33 % com densidade g/l. Habitualmente a solução de Sulfato de zinco a 33 % apresenta densidade g/l, mas a densidade deve ser medida e corrigida conforme necessário. 4) Outros insumos 4.1 Borrel ou frasco de vidro. 4.2 Funil de plástico pequeno. 4.3 Palito de sorvete 4.4 Tubo cônico de plástico. 4.5 Caneta para marcar tubo. 4.6 Gaze tipo queijo ou tamiz metálico de 80 a 100 malhas/cm Estante. 4.8 Lâmina de vidro. 4.9 Lamínula de vidro Alça de inoculação ou pipeta Pasteur. 5) Equipamentos 5.1 Centrífuga. 5.2 Microscópio. 6) Procedimento detalhado OBS: Para executar este procedimento é indispensável o uso de luvas, máscara e avental. 1 Preparar uma suspensão 1:10 de fezes em água Tipo II num frasco do tipo Borrel, identificado com o número de registro do paciente. 2 Adaptar a gaze ao funil de vidro. 3 Identificar um tubo cônico com o número de registro do paciente. 4 - Filtrar a suspensão para este tubo cônico. 5 Centrifugar a 2500 rpm por 1 minuto. 6 Desprezar o sobrenadante. 7 Adicionar 3 ml de água Tipo II e misturar. 8 Repetir os itens 5, 6 e 7 mais duas vezes. 9 No último sedimento, adicionar 3 ml de solução de Sulfato de zinco. 10 Agitar e completar o volume do tubo com o Sulfato de zinco. 11 Centrifugar a 2500 rpm por 1 minuto. 12 Aspirar a película superior. 4

5 13 Identificar a lâmina de vidro com o número de registro do paciente. 13 Colocar 1 gota na lâmina de vidro. 14 Colocar 1 gota de lugol na lâmina de vidro. 15 Homogeneizar. 16 Colocar a lâminula de vidro. 17 Observar no microscópio, inicialmente com pequeno aumento. 18 Registrar o resultado na Planilha de exame 7) Leitura 1 A riqueza de cistos pode ser verificada com pequeno aumento do microscópio. 2 As características de cada espécie são observadas com grande aumento ou imersão. 3 Observar: o número de nucléolos dos cistos, a sua estrutura, a distribuição, a coloração e o aspecto do glicogênio neles contido. 8) Limitações do método 1 Amostra do paciente contendo poucos cistos pode fornecer resultado falso negativos. 2 A incapacidade do observador em identificar as características morfológicas das diferentes espécies poderá causar resultados enganosos. 5

6 III) Técnica de Coloração por Hematoxilina Férrica A hematoxilina férrica utilizando fezes preservadas é sem dúvida, o método que maior segurança oferece na identificação e no diagnóstico da E. histolytica. Os trofozoítas apresentam uma cor cinza-azulada, diferenciando-se de estruturas de tonalidades escuras. Seu tamanho varia entre 15 a 60 micra. O citoplasma é distinto e observa-se uma nítida diferenciação entre o ectoplasma e o endoplasma, principalmente se a forma observada estava emitindo pseudópodes quando da sua fixação. O ectoplasma apresenta-se hialino com uma coloração cinza-clara, diferenciando-se do endoplasma, que se apresenta granuloso e mais intensamente corado. No seu interior pode-se observar uma ou mais hemácias coradas de negro, evidenciadas nitidamente por um halo claro em toda sua parte externa. O núcleo geralmente não é central, permanecendo em local afastado da emissão dos pseudópodes, corando suas estruturas em negro. O cariossoma geralmente é central, mais corado, os grânulos de cromatina são escuros e distribuídos uniformemente no interior da membrana nuclear. 6

7 A forma pré-cistica é geralmente esférica, podendo apresentar-se oval, corando em azulacinzentado e não apresentando diferenciação entre o ectoplasma e o endoplasma. O vacúolo ocupa 2/3 do parasito, que é o vacúolo de glicogênio, pouco corado. Os corpos cromatóides, corados em negro, se apresentam como um ou dois bastonetes de tamanhos diferentes. O núcleo se apresenta um pouco maior na forma pré-cistica. O cariosoma é grande, de aspecto geralmente uniforme. Já nos cistos pode-se observar uma nítida membrana cística corada em negro e o citoplasma se apresenta em uma cor cinza-azulada contendo um vacúolo de glicogênio grande e não corado. Os corpos cromatóides, mais freqüentes nos cistos imaturos, coram em negro e apresentam-se em quantidades variáveis, porém dificilmente são observados nos cistos tetranucleados. Outros protozoários de interesse nos exames de fezes são: E. coli, E. hartmani, Endolimax nana, Iodamoeba butschlii, Isospora belli, Balantidium coli. Pode usar para pesquisa de Trichomonas vaginalis (secreção vaginal e uretral) Procedimento Prático I) Material para análise: fezes diarréicas obtidas por purgantes (30 gramas de sulfato de sódio dissolvidos em água). Evacuação deve ser feita no laboratório II) Fezes muito pastosas ou endurecidas devem ser colocadas em fixador de preferência o de Schaudinn (veneno). III) Utilizar lamínulas limpas e desengorduradas presas a um suporte de borracha para facilitar a manipulação (figura 1). IV) Com uma pázinha de sorvete espalhar as fezes fazendo um esfregaço e após emergir ema placa de Petri contendo o fixador de Schaudinn. V) Passar esta preparação pelos seguintes líquidos: 1- Álcool iodado - 1 minuto 2- Álcool a 95% - 1 minuto 3- Água corrente para lavagem 1 minuto dentro da cuba 4- Mordente (alumínio de ferro) 3 minutos 5- Água corrente - 1 minuto dentro da cuba 6- Solução de Hematoxilina férrica 5 minutos 7- Água corrente - 1 minuto dentro da cuba 8- Diferenciador (alumínio de ferro) até que o esfregaço adquira uma transparência adequada. (muita experiência): momento crucial 9- Água corrente - 2 minutos dentro da cuba. 10- Álcool absoluto 2 minutos. 7

8 11- Álcool a 95% - 2 minutos 12- Álcool creosoto - 2 minutos 13- Creosoto de Faia - 2 minutos 14- Montar com bálsamo do Canadá: sobre uma lâmina limpa e desengordurada colocar uma gota de bálsamo, e sem deixar bolhas de ar, colocar a preparação com o esfregaço voltado para baixo, sobre o mesmo. A preparação poderá ser colocada em estufa a 37º C para a secagem do bálsamo do Canadá, limpando-se o excesso com auxílio de xilol e papel de filtro. Examinar com objetiva de imersão e ocular 5x ou 10x. Entamoeba histolytica cisto Entamoeba coli (trofozoíto e cisto) Trofozoíto Giardia lamblia cisto Trofozoíto 8

9 Desenhos das Lâminas 9

10 Protozoários sanguíneos Preparação do esfregaço sanguíneo e coloração Método de GIEMSA: (diagnóstico do tripanosomas, dos plasmódios, das leishmanias e Toxoplasma). I) Preparo de esfregaço sanguíneo A) Sangue com EDTA B) Preparam-se esfregaços finos tocando uma lâmina limpa, desengordurada, em uma pequena gota de sangue, de modo que fique próximo de uma extrimidade da lâmina. Uma segunda lâmina espalhadora (lâmina de extensão) é segurada pelas bordas, em ângulo de 30 graus sobre a lâmina que tem o material e recuada sobre a gota fazendo que se espalhe ao longo da borda da lâmina espalhadora. Com suavidez e rapidez, empurre a lâmina espalhadora para frente, de modo que o sangue se espalhe e corra em camada plana. C) Deixe secar ao ar e core conforme a descrição. II) Procedimento de coloração A) Identificação do Trypanosoma cruzi hemoflagelado 10

11 Objetivos da aula: reconhecer as seguintes formas evolutivas: tripomastigotas, amatigostas e epimastigotas de T. cruzi. 1) Tripomastigotas Examinar lâmina de esfregaço sanguíneo corado pelo método Giemsa (visualizar o parasito entre as hemáceas). Descrever a posição do cinestoplasto, posição do núcleo, membrana ondulante e flagelo. Epimastigota de T.cruzi Amastigota de T. cruzi B) Identificação de Leishmania spp. Objetivos da aula: reconhecer as seguintes formas evolutivas: promastigotas e amastigotas de Leishamnia ssp. 1) Promastigotas As promastigotas de Leishmania ssp são encontradas no trato intestinal do mosquisto Flebotomíneo (mosquito palha), mas também podem ser encontrados em culturas in vitro Descrever a posição do cinestoplasto, posição do núcleo e flagelo. 2) Amastigotas 11

12 As amastigotas serão encontradas em células do sistema fagocitário, presentes no sangue circulante ou nos órgãos de indivíduos infectados. Examinar lâminas obtidas de amstigotas obtidas em linfonodo. Descrever a posição do cinestoplasto, posição do núcleo e flagelo. D) Identificação de Plasmódios (Plasmodium sp) Objetivos da aula: reconhecimento das formas sanguíneas dos palsmódios 12

13 D) Identificação de Toxoplasma gondii. \ Objetivos da aula: reconhecimento dos principais estágios parasitários de gondii, diferenciando estágios encontrados na fase aguda (taquizoítos) da fase crônica (bradizoítos em cistos teciduais). 13

14 Taquizoítos Bradizoíto Desenhos das Lâminas 14

15 15

16 Schistosoma mansoni 16

17 17

18 Desenhos das Lâminas 18

19 Método de Lutz ou de Hoffmann (sedimentação espontânea) Princípio do método: Método baseado na sedimentação espontânea, específico para a pesquisa de ovos de Schistosoma mansoni, porém é altamente eficiente e amplamente utilizado para a pesquisa de todos os parasitos. Material necessário: 1. Cálice de decantação 2. Peneira 3. Gaze dobrada em 4 4. Água corrente ou destilada 5. Espátula de madeira (tipo abaixador de língua) 6. Lâmina e lamínula Tomar cerca de 2 g de fezes recém emitidas, dissolvê-las no próprio recipiente de coleta (frasco padrão para coleta de amostra) utilizando um pouco de água. Transferir o material dissolvido para um cálice de decantação fazendo filtrar em peneira contendo gaze em 4. Completar até ¾ do volume de água e deixar repousar em superfície firme e livre de vibrações por no mínimo 2 horas. Retirar o sedimento com um canudo ou pipeta Pasteur e transferir para lâmina de vidro adicionando 2 gotas de solução de Lugol e cobrindo com lamínula. Observar ao microscópio em objetiva de 10x. Taenia sp 19

20 20

21 Desenhos das Lâminas 21

22 Hymenolepis nana 22

23 Ascaris sp Ovo Ovo 23

24 Desenhos das Lâminas 24

25 FLUTUAÇÃO SIMPLES - WILLIS (flutuação em salina saturada) Essa técnica se baseia na propriedade que alguns ovos de helmintos apresentam de flutuarem na superfície de uma solução de densidade elevada e de aderirem ao vidro. Este procedimento é específico para a pesquisa de ovos de Ancilostomídeos. 1. A solução saturada de cloreto de sódio é feita adicionando aproximadamente 40g de NaCl a 100mL de água sob aquecimento até o ponto em que o sal não se dissolva mais na água. A densidade desta solução deve ser de aproximadamente 1,20g/mL. 2. Colocar uma quantidade de fezes (aproximadamente 2 g) coletadas de várias partes do bolo fecal em uma pequena cuba contendo uma parte de solução saturada de cloreto de sódio, dissolver as fezes nesta solução e acrescentar água até a borda. 3. Colocar sob a borda da cuba uma lâmina de vidro quase tocando a solução saturada e deixar de 30 a 45 minutos. Após este tempo, inverter a lâmina rapidamente e observar ao microscópio. Ancylostoma sp 25

26 26

27 Desenhos das Lâminas 27

28 Rugai e cols Barmann Moraes 28

29 Strongyloides stercoralis Desenhos das Lâminas 29

30 COLETA PARA PESQUISA DE ENTEROBIUS VERMICULARIS (TÉCNICA DA FITA ADESIVA OU SWAB PERIANAL NOTURNO) Material necessário 1. Fita de celofane adesiva e transparente (tipo Durex) 2. Toluol (tolueno), Xilol (xileno) ou Iodo-xilol 3. Lâmina para microscopia. Técnica 1. Colocar um pedaço de fita adesiva transparente em uma espátula de madeira tipo abaixador de língua com a parte adesiva voltada para fora 2. Pressionar firmemente a espátula contendo a fita adesiva contra as pregas anais e perianais 3. Colar a fita adesiva em lâmina devidamente identificada 4. No momento da execução do exame, levantar cuidadosamente a fita da lâmina e pingar uma gota de toluol ou xileno e pressionar novamente a fita contra a lâmina. A preparação ficará clara ou levemente corada, tornando os ovos bem visíveis. Caso o material não seja examinado imediatamente, não acrescentar o toluol. Fita gomada ou anal swab Ovos da coleta do anal swab 30

31 Enterobius vermiculares 31

32 Trichuris trichiura Wuchereria bancrofti 32

33 33

34 Desenhos das lâminas 34

35 35

36 Ectoparasitos 36

37 DEPARTAMENTO DE PARASITOLOGIA INSTITUTO DE BIOLOGIA / UNICAMP PROTOZOÁRIOS INTESTINAIS E CAVITÁRIOS AMEBAS PARASITAS E COMENSAIS Entamoeba histolytica cisto Entamoeba histolytica cisto (corado pelo lugol) Entamoeba histolytica cisto Entamoeba histolytica trofozoíta Entamoeba histolytica trofozoíta Entamoeba histolytica trofozoíta Entamoeba coli cisto (corado pelo lugol) Entamoeba coli cisto (corado pelo lugol) Entamoeba coli trofozoíta Entamoeba coli trofozoíta Iodamoeba bütchlii cisto Endolimax nana cisto Endolimax nana trofozoíta FLAGELADOS INTESTINAIS E CAVITÁRIOS Giardia lamblia trofozoíta Giardia lamblia trofozoíta Giardia lamblia cisto Giardia lamblia cisto Trichomonas vaginalis CILIADOS INTESTINAIS Balantidium coli cisto Balantidium coli trofozoíta Balantidium coli em corte de intestino Balantidium coli em corte do intestino grosso 37

38 DEPARTAMENTO DE PARASITOLOGIA INSTITUTO DE BIOLOGIA / UNICAMP PROTOZOÁRIOS DO SANGUE E OUTROS TECIDOS Plasmodium falciparum trofozoíta Plasmodium falciparum gametócitos Plasmodium falciparum microgametócito Plasmodium falciparum macrogametócito Plasmodium vivax trofozoíta Plasmodium vivax esquizonte Plasmodium vivax merozoíto Plasmodium vivax microgametócito Plasmodium vivax macrogametócito Trypanosoma cruzi epimastigota Trypanosoma cruzi tripomastigota Trypanosoma cruzi tripomastigota Trypanosoma cruzi amastigota Leishmania sp. amastigota Leishmania sp. amastigota Leishmania sp. promastigota Toxoplasma gondii trofozoíta Toxoplasma gondii cisto VETORES Barbeiros Triatoma Panstrongylus Rhodnius Anophelini Ovos Larva Pupa Macho Fêmea Adultos Culicini Posição de pouso do adulto Ovos Larvas Pupa Macho Fêmea Adultos DEPARTAMENTO DE PARASITOLOGIA Posição de pouso do adulto 38

39 INSTITUTO DE BIOLOGIA / UNICAMP HELMINTOS INTESTINAIS Ovo de Ancilostomatídeo Ovo larvado de Ancilostomatídeo Ovo de Ancilostomatídeo Ovo de Enterobius vermicularis Ovos de Enterobius vermicularis Ovo de Ascaris (fertilizado) Ovo de Ascaris (fertilizado) Ovo de Ascaris (larvado e decorticado) Ovo de Ascaris (infértil) Ovo de Ascaris (infértil) Ovo de Schistosoma mansoni Ovo de Fasciola hepatica Ovos de Taenia Ovo de Taenia Proglote grávido Taenia solium Ovo de Hymenolepis diminuta Ovo de Hymenolepis nana Ovo de Trichuris trichiura Ovo larvado de Trichuris trichiura Proglote grávido Taenia saginata Cápsula bucal Ancilostoma duodenale Cápsula bucal Ancilostoma duodenale Cápsula bucal Necator americanus Cápsula bucal Necator americanus Bolsa copuladora de A. duodenale 39

40 Bibliografia Consultada - DE CARLI, G.A. Parasitologia Clínica Seleção de Métodos e Técnicas de Laboratório para o Diagnóstico das Parasitoses Humanas Editora Atheneu, São Paulo, CIMERMAN, B. & FRANCO, M.A. - Atlas de parasitologia: artrópodes, protozoários e helmintos. São Paulo, Ed. Atheneu, LEVENTHAL, R. & CHEADLE, R.- Parasitologia Médica. Texto e Atlas. 4ªed. Editora Premiere, NEVES, D.P. - Parasitologia humana. 10ª ed. Editora Atheneu (SP), REY, L. - Bases da parasitologia médica. 2ª ed. Guanabara Koogan (RJ), VALLADA, E.P.; -Manual de Exames de Fezes - coprología e parasitologia. Editora Atheneu São Paulo, NEVES, D.P. - Parasitologia dinâmica. 1ª ed. Editora Atheneu (SP), FERREIRA, M.U. e SCHHUMAKER, T.T.S. Fundamentos Biológicos da Parasitologia Humana. Editora Manole, São Paulo, VERONESI, R. & FOCACCIA, R. - Tratado de Infectologia. São Paulo, Editora Atheneu, 1999 Páginas de internet: : página do Center for Disease Control and Prevention com imagens e textos sobre parasitos de importância em saúde pública

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