1. INTRODUÇÃO. Ribeiro, S.F.F.

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1 1 1. INTRODUÇÃO

2 2 1.1 PEPTÍDEOS ANTIMICROBIANOS Peptídeos antimicrobianos são moléculas de baixa massa molecular com uma vasta atividade inibitória contra bactérias, vírus e fungos (Izadphanah e Gallo, 2005). Pertencem a um grupo diverso e abundante de moléculas que são produzidas por diversas células, tanto em plantas quanto em animais, e que são agrupadas de acordo com a sua atividade antimicrobiana intrínseca (Gallo et al., 2002; Brogden, 2005). Uma característica comum a estes peptídeos é a presença de resíduos de cisteínas em número par (4, 6 ou 8), interconectadas por pontes dissulfeto, conferindo a eles uma alta estabilidade (Broekaert et al., 1997). Além disso, sua composição de aminoácidos, anfipaticidade, carga catiônica e tamanho, fazem com que estes peptídeos tenham a habilidade de se inserirem facilmente nas membranas lipídicas possibilitando então a morte do microrganismo alvo (Brogden, 2005; Izadphanah e Gallo, 2005). Em animais, esses peptídeos antimicrobianos constituem parte do sistema imune inato (Lehrer et al., 1993; Gabay, 1994; Boman, 1995; Hultmark, 1997). Em plantas, proteínas e peptídeos antimicrobianos formam um sistema de defesa similar à imunidade inata em animais, protegendo-as assim do ataque de certos patógenos e pragas (Shewry e Lucas, 1997; Gallo et al., 2002). A base molecular dos mecanismos de ação pelos quais, o peptídeo antimicrobiano age contra o patógeno é pouco definida, mas acredita-se que diferenças na fluidez de membrana e composição lipídica interfiram na associação dos peptídeos antimicrobianos às membranas alvo, podendo levar estas ao seu rompimento (Feder et al., 2001). Izadphanah e Gallo (2005) propuseram um mecanismo de ação para esses peptídeos antimicrobianos onde, o efeito sobre os microrganismos está relacionado tanto à sua carga catiônica quanto à sua estrutura. Esta carga permite que o peptídeo antimicrobiano se ancore a componentes aniônicos presentes na membrana lipídica do microrganismo alvo. Sendo assim, esta atração eletrostática inicial é responsável pela associação do peptídeo antimicrobiano à membrana. Porém, tal ligação se dá de forma inespecífica. Já Brogden (2005) acredita que ao se ligarem à membrana do microrganismo alvo, os peptídeos antimicrobianos formem poros nessas membranas,

3 3 levando assim à morte do microrganismo. Em seu trabalho Brodgen (2005) cita três diferentes modos de ação pelo qual esses peptídeos, agindo sobre a membrana, levam a morte do microrganismo. São eles: canal transmembrana, poro toroidal e modelo tapete (Figura 1). Estudos recentes vêm observando também a capacidade de diferentes peptídeos de penetrarem células alvo, podendo também interagir com outras membranas intracelulares. Foi observado que os peptídeos pvec e (KFF) 3 K são capazes de penetrar o envelope celular das leveduras Saccharomyces cerevisiae e Candida albicans e que a entrada desses se dá de forma muito variada (Holm et al., 2005). Devido a essa capacidade que os peptídeos antimicrobianos possuem de interagir com determinadas membranas celulares e, dessa forma, exibirem uma eficiente atividade antimicrobiana contra determinados agentes patogênicos, é que temse observado, nos últimos anos, um grande interesse em se estudar esse grupo de proteínas (Gallo et al., 2002). A seleção de um número cada vez maior de microrganismos resistentes a antibióticos e a outros agentes antimicrobianos tem despertado a atenção de muitos pesquisadores na tentativa de se desenvolverem novos agentes terapêuticos (Gallo et al., 2002). O potencial terapêutico dos peptídeos antimicrobianos é valorizado graças à capacidade destes compostos de matarem rapidamente um grande número de microrganismos incluindo bactérias, vírus e fungos que são multiresistentes a drogas. Na tabela 1 podemos observar de forma simplificada, por exemplo, uma lista de alguns peptídeos antimicrobianos que possuem atividade biológica contra várias espécies fúngicas (Reddy et al., 2004).

4 4 A B C Figura 1 O mecanismo de interação e permeabilização de AMPs em membranas de microrganismos. Regiões hidrofóbicas do peptídeo (azul escuro) alinham-se com a região lipídica central da bicamada e regiões hidrofílicas do peptídeo (vermelha) formam a região interior do poro. (A) Canal transmembrana; (B) Poro toroidal e (C) Modelo tapete (Reproduzido de Brodgen, 2005).

5 5 Tabela 1 Peptídeos antimicrobianos com atividade contra fungos. PEPTÍDEO FONTE MODO DE AÇÃO ATIVIDADE ANTIFÚNGICA Gallinacina-1 Galinha Lise C. albicans Lactoferricina-B Humano, boi Lise C. albicans Defensina NP-1 granulócitos de coelho Lise C. neoformans Defensina HNP-1 Neutrófilo humano Lise C. albicans Protegrina Humanos Lise C. albicans Tripticina Humanos Lise A. flavus Magainina-2 Xenopus laevis Lise C. albicans Drosomicina Drosophila Lise F. oxysporum Dermaseptina Phyllomedusa sauvagii Lise C. neoformans Fonte: Reddy et al., PEPTÍDEOS ANTIMICROBIANOS DE PLANTAS As plantas, por serem organismos sésseis, estão constantemente expostas aos diversos tipos de fatores físicos e químicos desfavoráveis no ambiente, incluindo a presença de um grande número de organismos fitopatogênicos. Sendo assim, a sua sobrevivência nessas condições exige uma rápida resposta de defesa (Castro e Fontes, 2005). Durante seu processo evolutivo as plantas desenvolveram eficientes sistemas de defesa os quais envolvem um reconhecimento específico e uma alta sensibilidade a organismos patogênicos. O grande número de estratégias de defesa selecionadas pela planta faz com que a resistência passe a ser uma regra enquanto a suscetibilidade, uma exceção (Shewry e Lucas, 1997). Diversos mecanismos estão envolvidos na defesa de plantas contra seus agressores tais como acúmulo de componentes fenólicos, de alcalóides, de aminoácidos não protéicos, de glicosídeos ou proteínas e peptídeos com atividades antimicrobianas e inseticidas (Wittstock e Gershenzon, 2002; Castro e Fontes, 2005). Um grande número de peptídeos antimicrobianos tem sido isolado de plantas, especialmente de sementes, local em que podemos encontrá-los em nível elevado se

6 6 compararmos às folhas, flores e demais órgãos da planta (Broekaert et al., 1997; Wang et al., 2001). Os peptídeos antimicrobianos podem ser divididos em 10 famílias, levando-se em consideração, principalmente, suas características estruturais, como pode ser observado na tabela 2. Geralmente, esses peptídeos presentes em plantas possuem estrutura tridimensional globular, estabilizada pela presença de pontes dissulfeto. Dentre estes podemos citar: (1) as proteínas transportadoras de lipídeos (LTPs), as quais inicialmente acreditava-se participarem no transporte de lipídeos entre organelas; (2) as snakinas, que foram inicialmente isoladas de batata (Solanum tuberosum); (3) as defensinas de planta, inicialmente isoladas de sementes de cevada (Hordeum vulgare); (4) as tioninas, sendo a purotionina, isolada de trigo (Triticum aestivum), a primeira proteína cuja atividade contra patógenos de plantas foi detectada in vitro; (5) os peptídeos tipo-heveína, descritos inicialmente como os peptídeos mais abundantes do látex de seringueiras; (6) os peptídeos tipo-knotinas, isolados inicialmente de sementes de maravilha (Mirabilis jalapa); (7) as seferdinas, únicos peptídeos antimicrobianos de plantas descritos que não possuem pontes dissulfeto, representados por cadeias polipeptídicas lineares ricas em glicina e histidina, e isolados de raiz de bolsa-depastoros (Capsella bursa-pastoris); (8) peptídeos MBP-1, isolados de milho (Zea mays); (9) peptídeos macrocíclicos purificados de várias plantas da família Rubiaceae, como o café (Coffea arabica) e (10) pequenos peptídeos denominados Ib-AMPs isolados de sementes de balsamina (Impatiens balsamina) (García-Olmedo et al., 2001).

7 7 Tabela 2 Peptídeos e pequenas proteínas de plantas com atividade antimicrobiana. FAMÍLIA Nº DE RESÍDUOS DE Nº DE PONTES ATIVIDADE AMINOÁCIDOS DISSULFETO LTPs Antibacteriana; antifúngica Snakinas Antibacteriana; antifúngica Defensinas Antibacteriana; antifúngica; inibem α- amilase Tioninas Antibacteriana; antifúngica Tipo heveína 43 4 Antibacteriana (Gram +); antifúngica Tipo knotina Antibacteriana (Gram +); antifúngica Seferdinas Antibacteriana; antifúngica MBP Antibacteriana; antifúngica Peptídeos Antibacteriana (Gram +) Macrocíclicos Ib-AMPs 30 2 Antibacteriana (Gram +); antifúngica Fonte: García-Olmedo et al., Dentre os principais peptídeos antimicrobianos de plantas estudados encontramos principalmente as tioninas, as defensinas e as LTPs. As tioninas são pequenas proteínas básicas, possuindo em sua maioria 45 a 47 resíduos de aminoácidos e apresentam de 6 a 8 resíduos de cisteína, formando 3 ou 4 pontes dissulfeto (Garcia e Olmedo et al., 1989). Podem ser classificadas em 2 subgrupos, um contendo 8 cisteínas conectadas por 4 pontes dissulfeto e outro com 6 cisteínas interligadas por 3 pontes dissulfeto (Broekaert et al., 1997). As tioninas foram isoladas principalmente a partir de sementes de trigo, no entanto, proteínas relacionadas têm sido purificadas a partir de várias outras sementes de cereais (Garcia e Olmedo et al., 1989). Em cevada a sua expressão foi detectada no endosperma de sementes, onde foi isolada uma tionina com propriedade antimicrobiana denominada α-hordotionina (α-ht). Thevissen et al. (1996) demonstraram que essa tionina altera a permeabilidade da membrana do fungo Neurospora crassa causando

8 8 um aumento da entrada de Ca +2, do efluxo de K +, além de causar a alcalinização do meio. Estudos de imunolocalização desses peptídeos em plantas revelaram que as tioninas estão localizadas principalmente dentro dos vacúolos, embora também tenha sido observada a sua presença na parede celular (Broekaert et al., 1997). As tioninas são tóxicas para bactérias Gram positivas e negativas, para os fungos filamentosos e também para leveduras. Stuart e Harris (1992) mostraram que as tioninas inibem o crescimento in vitro de fungos e bactérias. Posteriormente, esses efeitos foram confirmados em ensaios utilizando diversas bactérias patogênicas assim como nos fungos Colletotrichum langenarum e Fusarium solani, que foram fortemente inibidos por tioninas isoladas de diferentes espécies de plantas como trigo, cevada, batata e rabanete (Molina et al., 1993; Moreno et al., 1994 e Terras et al., 1996). As defensinas de plantas são proteínas pequenas, com 45 a 54 resíduos de aminoácidos, altamente básicas, ricas em cisteínas, sendo estruturalmente relacionadas a defensinas encontradas em outros tipos de organismos, incluindo insetos e humanos (Thevissen et al., 1999; 2003). Os primeiros membros da família das defensinas de plantas foram isolados de grãos de trigo e cevada (Colilla et al., 1990; Mendez et al., 1990). Estas foram originalmente denominadas γ-tioninas por apresentarem um tamanho similar (5 kda) e o mesmo número de pontes dissulfeto (Broekaert et al., 1995). Contudo, trabalhos subseqüentes estabeleceram que as tioninas e γ-tioninas são estruturalmente não relacionadas (Terras et al., 1992; Bruix et al., 1993; Bohlmann, 1994; Pelegrini e Franco, 2005). Terras et al. (1995) verificaram que defensinas encontradas em plantas desempenham um papel importante na proteção dos tecidos de plantas jovens durante os primeiros estágios de emergência. A expressão das defensinas nos vários tecidos das diferentes espécies de plantas, como repolho (Park et al., 2002); ervilha (Almeida et al., 2002); tabaco (Lay et al., 2003); batata (Segura et al., 1999); espinafre (Terras et al., 1995); tomate (Brandstadter et al., 1996) e Arabidopsis (Penninckx et al., 1996 e Thomma et al., 2002) foi estudada e, observou-se que não estão presentes somente nas sementes, mas também nas camadas celulares periféricas das frutas e dos órgãos

9 9 florais. Esta localização periférica está relacionada com a função de proteção dos órgãos contra os ataques microbianos (Thevissen et al., 2003). As defensinas de plantas podem ser agrupadas dentre as que possuem e as que não possuem atividade antimicrobiana. As que possuem atividade antimicrobiana in vitro contra determinados fungos filamentosos, podem ou não causar algum tipo de alteração morfológica (Thomma et al., 2002). Interessantemente, muitas defensinas podem ser ativas contra vários tipos de patógenos fúngicos humanos, dentre eles a levedura Candida albicans (Thomma et al., 2003; Thevissen et al., 2004). Estudos demonstraram também que defensinas isoladas de sementes de Medicago sativa (alfafa), denominada alfafp, possui uma forte atividade contra o patógeno fúngico de grande importância agronômica Verticillium dahlial, sendo capaz de inibir o crescimento de 50 % de esporos pré-germinados, quando presente numa concentração de 5µg.mL -1 e de inibir 100 %, quando presente a 15 µg.ml -1. Além deste fungo, esta defensina também foi capaz de inibir outros patógenos fúngicos como Alternaria solani e Fusarium culmorum (Gao et al., 2000). Estudos envolvendo defensinas purificadas de sementes de Dahlia merckii denominada Dm-AMP1, determinaram um possível mecanismo de ação das defensinas de planta. Foram realizados experimentos em que se demonstrou que essa Dm-AMP1 é capaz de alterar a permeabilidade da membrana fúngica, promovendo um aumento no efluxo de K + e no influxo de Ca +2, além de permitir a entrada do Sytox Green, um corante fluorescente que penetra apenas as células que estão com sua membrana plasmática comprometida (Thevissen et al., 1996; 1999). Esta Dm-AMP1 também possui atividade antifúngica contra a levedura Saccharomyces cerevisiae e, seu mecanismo de ação depende da composição lipídica de sua membrana plasmática (Thevissen et al., 2003a). Estudos mais recentes demonstraram que a Dm-AMP1 é capaz de interagir de forma dose dependente com esfingolipídeos isolados da membrana de S. cerevisiae e que essa interação é aumentada na presença de concentrações equimolares de ergosterol, o principal esterol fúngico (Thevissen et al., 2003b). As proteínas transportadoras de lipídeos (LTPs) são proteínas básicas, com massa molecular em torno de 10 kda, possuindo um alto ponto isoelétrico e observa-se a presença de 8 resíduos de cisteína ligados por 4 pontes dissulfeto. As LTPs facilitam

10 10 a transferência de lipídeos através das membranas in vitro e estão localizadas basicamente na parede celular da planta e parcialmente em compartimentos ligados ao metabolismo de lipídeos, como os glioxissomos (Kader, 1996). O papel de defesa das LTPs é suportado por evidências de sua localização na parede periclinal externa das células epidérmicas por toda a planta mas também pelo aumento da expressão de seus genes em resposta à presença de patógenos (Kader, 1996). Muitas LTPs foram identificadas por possuírem atividade antifúngica in vitro, estando envolvidas no processo de inibição do crescimento de fungos e bactérias (Terras et al., 1992; Molina et al., 1993). Estudos têm demonstrado que as LTPs apresentam a capacidade de inibir o crescimento de muitos fitopatógenos como Pseudomonas solanacearum, Claribacter michiganensis, Fusarium solani, Rhizoctonia solani, Trichoderma viride e Cercospora beticola (Terras et al., 1992; Molina et al., 1993; Kader, 1996; Carvalho et al., 2001). Regente e de la Canal (2000) isolaram e caracterizaram um peptídeo antifúngico básico, denominado Ha-AP10, apresentando aproximadamente 10 kda e que demonstraram pertencer a família das LTPs de planta. A caracterização molecular de um clone de cdna (Regente e de la Canal, 2003) mostrou que esta Ha-AP10 é homóloga a ltp4 de Arabidopsis thaliana (Arondel et al., 2000) apresentando um peptídeo sinal que a direciona para uma via secretória. Em 2005 (Regente e de la Canal) também demonstraram que o peptídeo Ha-AP10 é capaz de induzir uma permeabilização da membrana plasmática de esporos fúngicos e isso pôde ser observado pelo uso do corante Sytox green. Uma LTP presente em sementes de feijão-de-corda (Vigna unguiculata) foi isolada e pôde-se observar uma eficiente atividade antifúngica in vitro em sinergismo com uma defensina contra os patógenos fúngicos Fusarium oxysporum e F. solani, provocando alterações morfológicas em suas hifas. Foram também realizados ensaios de imunolocalização onde foi mostrada a localização dessa LTP na parede celular e em compartimentos citosólicos nas sementes de feijão (Carvalho et al., 2001; 2004). Outros trabalhos também mostraram a presença e o isolamento de uma LTP com massa molecular de aproximadamente 9 kda, presente em exsudados de sementes de feijão-de-corda (Vigna unguiculata) (Diz et al., 2003; Rose et al., 2006).

11 11 Estes resultados podem estar relacionados com a função de proteção destas proteínas durante a germinação da semente contra o ataque de determinados microrganismos. 1.3 OUTRAS PROTEÍNAS DE BAIXA MASSA MOLECULAR, PRESENTES EM PLANTAS, COM ATIVIDADE ANTIMICROBIANA INIBIDORES DE PROTEINASES SERÍNICAS Os inibidores de proteinases constituem um largo e diverso grupo de proteínas de planta capazes de formar complexos proteína-proteína reversíveis com determinadas enzimas resultando na sua inativação (Mosolov et al., 2001). Esses inibidores são considerados reguladores de proteinases endógenas, proteínas de reserva e finalmente agentes de defesa de plantas contra certos patógenos e pragas (Antcheva et al., 2001; Mosolov et al., 2001). Contudo, existem evidências do envolvimento de inibidores de proteinases em muitos outros processos importantes, além dessas 3 principais funções (Mosolov et al., 2001). Um dos grupos de inibidores de proteinases melhor estudados é o grupo dos inibidores de proteinases do tipo serínica, pertencentes à família do tipo II isolados de batata (PT-II). Os membros deste grupo possuem aproximadamente 50 resíduos de aminoácidos, sendo polipeptídeos ricos em cisteína que inibem tanto tripsina quanto α- quimiotripsina. São expressos em vários tecidos de plantas da família Solanaceae, algumas vezes em altos níveis nas folhas (Antcheva et al., 2001). Um outro inibidor de proteinase isolado, caracterizado e seqüenciado a partir de sementes de pimenta (Capsicum annuum), foi denominado PSI-1.2 e também mostrou ser um membro da família de inibidores do tipo II já isolados de batata. Este inibidor possui 52 resíduos de aminoácidos, é um polipeptídeo rico em resíduos de cisteína que tem a capacidade de inibir tanto tripsina quanto quimiotripsina (Antcheva et al., 2001). Inibidores denominados Bowman-Birk (BBI) pertencentes ao grupo dos inibidores de proteinases serínicas, foram primeiramente isolados de sementes de soja. São encontrados em diversas espécies de planta, especialmente em sementes de mono e dicotiledôneas. BBIs de dicotiledôneas geralmente possuem uma massa molecular entre 7 e 8 kda. São formados a partir do produto de uma família multigênica dentro de

12 12 algumas espécies e, conseqüentemente, muitas isoformas podem ser identificadas (Ragg et al., 2006). A atividade de inibidores tripsínicas (TIs), encontrados em sementes e em tubérculos, sempre esteve associada à defesa contra herbívoros inibindo as suas proteinases (Jouanin et al., 1998). Mais recentemente, foi demonstrado que certos TIs atuam como inibidores do crescimento fúngico fazendo com que estes inibidores façam parte do conjunto de proteínas relacionadas a defesa de plantas, fornecendo uma barreira à entrada de determinados patógenos (Chen et al., 1998; Yang et al., 2006). Os inibidores de proteinases são considerados agentes antimetabólicos, já que causam deficiência protéica no patógeno. Logo, o comportamento desses inibidores como antibióticos está atribuído à sua interferência na digestão protéica, a qual reduz a disponibilidade de aminoácidos, impedindo a síntese de proteínas necessárias para o crescimento, desenvolvimento e reprodução do patógeno (Soares-Costa et al., 2002) Uma proteína de 16 kda denominada SAP16 foi isolada de flores de Helianthus annuus, exibindo atividade associada a inibidores de tripsina. Foi demonstrado que esta proteína possui a habilidade de inibir a germinação de esporos do fungo Sclerotinia sclerotiorum em concentrações de 5 µg.ml -1 e uma redução evidente do crescimento micelial em concentrações de 3 µg.ml -1, indicando uma alta atividade antifúngica contra este patógeno. Além de inibir o desenvolvimento das hifas do fungo S. sclerotiorum, a proteína SAP16 foi capaz de inibir o fungo Fusarium solani f. sp. eumartii (Giudici et al., 2000). Também foi visto que uma outra proteína, de massa molecular de 18 kda, obtida de sementes de Psoralea corylifolia, denominada Psc-AFP, possui atividade associada a inibidores de tripsina e que também foi capaz de inibir o crescimento dos fungos Alternaria brassicae, Aspergillus nurger, Fusarium oxysporum e Rhizoctonia cerealis sugerindo também um papel de defesa para esta proteína (Yang et al., 2006) PROTEÍNAS DO TIPO NAPINA As albuminas 2S de Crucíferas, também denominadas napinas, estão entre as proteínas mais estudadas, particularmente as de sementes do gênero Brassica e Arabidopsis (Ericson et al., 1986).

13 13 As napinas são proteínas pertencentes à classe das albuminas 2S e constituem uma família de proteínas de reserva de sementes. Estas proteínas possuem baixa massa molecular, são solúveis em água e possuem alto conteúdo de cisteína e nitrogênio. Proteínas do tipo napina exibem um alto grau de polimorfismo e isso ocorre devido ao fato de serem codificadas por uma família multigênica e também por estarem sujeitas a um processo proteolítico diferencial. Devido à presença de muitas isoformas, é difícil se obter uma preparação pura de uma dada espécie. A maioria destas proteínas é composta por 2 subunidades, uma subunidade maior de 8 kda e uma menor de 3 kda derivadas de uma dada molécula precursora única e ligadas por pontes dissulfeto (Vashishta et al., 2006). As napinas também fazem parte do grupo das proteínas que possuem atividade antifúngica (Terras et al., 1992). É importante se determinar a interação bioquímica pela qual estas proteínas estão atuando, especialmente levando-se em consideração que a maioria das proteínas com atividade antifúngica possuem vários modos de ação. As napinas com atividade antifúngica fornecem um bom exemplo de proteínas de defesa que possuem múltiplas funções evidentes e as quais têm sido mostradas por interagirem com mais de uma entidade bioquímica. As napinas apesar de pertencerem à família das albuminas 2S apresentam propriedades inibitórias para determinadas proteinases. Complexos oxidados de napinas que podem atuar como inibidores de proteinases efetivos contribuem para a atividade biológica dessas proteínas, agindo como potentes agentes antifúngicos. As napinas também causam alteração na membrana fúngica e atuam sinergisticamente com outras proteínas (Wijaya et al., 2000). Napinas de rabanete assim como α-purotioninas de trigo podem causar danos na membrana de fungos promovendo a permeabilização da membrana da hifa (Neumann et al., 1996). As albuminas 2S são proteínas de reserva e têm sido descritas por estarem entre 20 e 60 % do total de proteínas de sementes de dicotiledôneas, fazendo delas uma das três maiores classes de proteínas de reservas de sementes. Elas são metabolizadas durante a germinação, sendo consideradas uma fonte de nitrogênio e de enxofre para o desenvolvimento do embrião (Youle e Huang, 1981). Constituem, em sua maioria, uma complexa mistura de proteínas de baixo peso molecular com propriedades físicoquímicas semelhantes. A seqüência de aminoácidos das albuminas 2S apresenta uma

14 14 série de características comuns: uma alta concentração de cisteínas, de resíduos básicos, bem como a Pro (15 %) e Gli (30 %). Onze proteínas purificadas da fração albumínica correspondendo a proteínas 2S apresentaram pesos moleculares similares, todos em torno de 14,500 Da (Scofield e Crouch, 1987; Monsalve e Rodriguez, 1990). Vários trabalhos vêm mostrando o potencial inibitório das albuminas 2S sobre diferentes patógenos. A partir de sementes de Malva parviflora foram purificadas e caracterizadas duas proteínas, mostrando alta homologia com albuminas 2S. Essas são compostas de duas diferentes subunidades de 3 e 5 kda apresentando a propriedade de inibir o crescimento de fungos fitopatogênicos como Fusarium graminearum e Phytophthora infestans (Wang e Bunkers, 2000; Wang et al., 2001). Outro exemplo foi uma proteína de 5 kda, denominada Pe-AFP1, isolada de sementes de Passiflora edulis, que apresenta a capacidade de inibir o desenvolvimento dos fungos filamentosos Trichoderma harzianum, F. oxysporum e Aspergillus fumigatus em concentrações de 32, 34 e 40 µg.ml -1 (Pelegrini et al., 2006). Foi também isolada uma proteína homóloga a albuminas 2S a partir de sementes de Passiflora edulis f. flavicarpa. Essa proteína de peso molecular em torno de 12 kda, com 2 cadeias, de aproximadamente 8 e 4 kda, inibiu in vitro, o crescimento de fungos fitopatogênicos como Colletotrichum lindemuthianum e F. oxysporum, além da levedura Saccharomyces cerevisiae. Além de estar envolvida na inibição, esta proteína está relacionada ao fato de promover a permeabilização da membrana desses fungos (Agizzio et al., 2003; 2006). 1.4 AS LEVEDURAS As leveduras são microrganismos unicelulares que crescem pela formação de novas células, seguida de um aumento no volume celular (Johnston et al., 1977; Posten e Cooney, 1993; Duboc e von Stockar, 1996). Certas espécies ocorrem em superfícies de frutas frescas ou então apodrecidas, enquanto outras podem aparecer em superfícies expostas da planta. Algumas podem ser encontradas no solo, água, esgoto e até no trato digestivo de mamíferos (Alexopoulos et al., 1996).

15 15 As leveduras possuem uma parede celular bem rígida capaz de preservar a integridade osmótica da célula, além de determinar a morfologia celular durante os diferentes estágios do seu ciclo de vida. Em S. cerevisiae, a parede celular é essencialmente feita de proteínas e possui 3 diferentes cadeias polissacarídicas: uma cadeia predominante e linear de β-1,3 glucanos; uma menor mas altamente ramificada de β-1,6 glucanos e uma cadeia de quitina (Baladrón et al., 2002). Em células de Candida, o glucano é o polissacarídeo mais abundante da parede, compondo de % do total de polissacarídeos e, mananos compõe aproximadamente de %. O componente que aparece em menor quantidade é a quitina, sendo de aproximadamente 5 % do total de sacarídeos presentes na parede celular (Ruiz-Herrera et al., 1994). A membrana das leveduras é composta de lipídeos (fosfolipídeos e lipídeos neutros) e também de proteínas, sendo o ergosterol o principal componente lipídico neutro e o mais importante para a vida da levedura (Bossche e Koymans, 1998). Diversas espécies de leveduras, como, por exemplo, as pertencentes ao gênero Candida, podem ou não apresentar alguns tipos de patogenicidade aos humanos. Espécies pertencentes a este gênero podem produzir infecções localizadas ou disseminadas como a candidíase, a meningite, infecções no sangue dentre outras, que são causadas pelo patógeno humano C. albicans. Existem ainda outras espécies do gênero Candida que são consideradas patógenos facultativos como, por exemplo, a C. tropicalis, C. parapsilosis e a C. globrata sendo estas leveduras isoladas de habitats naturais como o solo, água e também de frutas (Alexopoulos et al., 1996). A espécie C. albicans exibe uma variedade de formas morfológicas, classificando-se desde leveduras unicelulares de brotamento até leveduras com habilidade de formar hifas (Sudbery et al., 2004). Esta propriedade de dimorfismo, ou seja, esta transição morfogênica entre as formas leveduriforme e filamentosa é considerada uma característica relevante para se determinar a virulência no momento da infecção (Gow et al., 2002). Estas mudanças morfológicas podem ser induzidas por uma variedade de condições ambientais sejam elas temperatura, ph e também pela composição de nutrientes do meio de crescimento (Sudbery et al., 2004). Estudos recentes têm demonstrado que altas concentrações de fosfato também podem induzir a formação de pseudohifas uniformes em leveduras (Hornby et al., 2003).

16 16 Tanida et al. (2006) observaram que múltiplos genes estão envolvidos no crescimento e na virulência de leveduras do gênero Candida. Dentre estes destacam-se os genes 1 e 2 de resistência a drogas, denominados CDR1 e CDR2 e o gene 1 de resistência a multidrogas (MDR1). Foi visto que algumas espécies de Candida que expressam altos níveis de CDR1 e CDR2 são resistentes a algumas drogas que utilizam alguns transportadores ligados ao transporte de ATP e também a novos agentes antimicrobianos os quais não são eliminados por bombas de efluxo dependente de ATP, podendo assim permitir novos tratamentos de infecções fúngicas e bacterianas. 1.5 PIMENTAS (Capsicum annuum L.) O gênero Capsicum tem aproximadamente 27 espécies e pertence à família das Solanaceae. Este gênero contém 5 espécies, por exemplo, C. annum, C. frutescens, C. baccatum, C. pubescens e C. chinense. C. annuum é conhecida tanto como pimenta como pimentão e é cultivada globalmente para consumo in natura e pelo seu uso como tempero, corante e também como produto medicinal (Sugita et al., 2006). Existe um grupo cujos frutos não possuem pungência e a eles denominamos pimentão, já o outro é caracterizado pela presença de alcalóides (capsaicinóides) que conferem pungência aos seus frutos, a este grupo denominamos pimentas (Bosland, 1996). A pungência ou ardência das pimentas deve-se aos alcalóides ou, mais especificamente, a dois capsaicinóides: a capsaicina e a diidrocapsaicina. São substâncias encontradas quase que exclusivamente na placenta e nas sementes e, em menor quantidade, no pericarpo sendo que as variedades de pimentas possuem diferentes teores de capsaicinóides (Reifschneider et al., 2000). Cinco espécies de Capsicum são consideradas cultivadas em todo o mundo: C. annuum, C. frutescens, C. chinense, C. baccatum e C. pubescens (Casali e Couto, 1984). Todas estas espécies apresentam possibilidade de troca de genes de forma natural (Reifschneider et al., 2000). Além destas 5 espécies domesticadas, existem cerca de 20 espécies silvestres, a maioria delas encontradas na América do Sul (Heiser Jr., 1976).

17 17 Um dos aspectos mais relevantes das espécies de Capsicum está relacionado a sua ampla utilização, quer seja como alimento in natura ou processado como princípio ativo para a indústria farmacêutica ou cosmética, dentre outros (Viñals et al., 1996; Reifschneider et al., 2000). Para fins medicinais, as pimentas também são usadas em algumas regiões do mundo,como estimulante digestivo, como afrodisíaco, no combate a disenteria e infecções intestinais e, ainda, como antiparasitário e cicatrizante, dentre outros (Viñals et al., 1996). Os frutos de Capsicum são importantes fontes de 3 antioxidantes naturais: a Vitamina C, os carotenóides e a Vitamina E. Também são fontes de vitaminas do complexo B (tiamina, riboflavina, niacina, B-6 e ácido fólico), além da Vitamina A. Há evidências de que os antioxidantes ajudam na prevenção de doenças degenerativas, de doenças cardiovasculares, catarata, mal-de-parkinson e mal-de-alzreimer, uma vez que são capazes de seqüestrar radicais livres (Reifschneider et al., 2000). Os frutos de Capsicum são também importantes fontes protéicas. Atualmente, são vários os números de genes identificados nesta planta e que estão relacionados à expressão de proteínas com efeitos antimicrobianos, podendo estes virem a servir como ferramentas úteis para o desenvolvimento de novos agentes terapêuticos (Reifschneider et al., 2000). Em recentes estudos envolvendo plantas de C. annuum, foi observada a presença de dois membros da família de genes que codificam proteínas do tipo defensina, denominadas j1-1 e j1-2, possuindo estruturas altamente similares. A análise da seqüência dos íntrons dentro do gene j1-2 revelou a existência de um exon adicional (exon 2ji) o qual também codifica uma proteína do tipo defensina. É muito provável que este exon tenha sido derivado da troca genômica de um gene jx, pertencente a uma outra subfamília, a qual permanece não identificada (Houlne et al., 1998). Em outro trabalho, também envolvendo genes de plantas de C. annuum, três clones denominados CALTPI, CALTPII e CALTPIII foram identificados como correspondentes a genes que codificam LTPs. Estes foram isolados de uma biblioteca de cdna de plantas infectadas com Xanthomonas campestris pv. Vesicatoria exibindo respostas de hipersensibilidade (HR). Os transcritos dos 3 genes CALTP acumulam-se diferentemente em folhas, caules e frutos de pimenta infectada por X. campestris pv. vesicatoria, Phytophthora capsici e Colletotrichum gloesporioides (Jung et al., 2003).

18 18 Estudos mais recentes descreveram também o isolamento de um clone de cdna, denominado CaAFP de pimenta, o qual codifica uma pequena proteína de 85 aminoácidos, incluindo 8 resíduos de cisteína. Foi demonstrado que CaAFP consiste de 3 domínios: um peptídeo sinal, um domínio de ligação a quitina e um domínio C- terminal. Os autores também demonstraram, através de Northern blots, que este clone é altamente expresso em folhas e em brotos florais, mas não em raízes. A proteína heteróloga super expressa em Escherichia coli foi purificada e mostrou inibir a germinação de esporos e a formação do apressório de muitos fungos patogênicos de plantas incluindo Fusarium oxysporum e Colletotrichum gloesporioides (Lee et al., 2004). Recentemente, Diz et al. (2006) obtiveram a partir de sementes de C. annuum um extrato rico em peptídeos, o qual após processos de purificação resultou em três diferentes frações, denominadas F1, F2 e F3. Estas foram utilizadas em testes antifúngicos que demonstraram que todas as frações possuíam atividade inibitória sobre o crescimento da levedura Saccharomyces cerevisiae. Através de processos de caracterização, os autores observaram a presença de 3 peptídeos com diferentes massas moleculares na fração F1 e um desses peptídeos apresentou alta homologia com LTPs de plantas. Devido a alta atividade encontrada nos peptídeos presentes nestas frações sobre leveduras é que focamos nosso trabalho na fração F3, fração esta também enriquecida em peptídeos com alta atividade antimicrobiana.

19 19 2. OBJETIVOS

20 Objetivo Geral Este trabalho tem por objetivo geral o isolamento, a caracterização e o estudo da atividade antimicrobiana de peptídeos de sementes de pimenta, (Capsicum annuum) cultivar UENF 1381, sobre células de leveduras. 2.2 Objetivos Específicos - Isolar e caracterizar peptídeos antimicrobianos presentes em sementes de pimenta, cultivar UENF 1381; - Estudar o efeito inibitório de frações ricas em peptídeos sobre o crescimento de diferentes espécies de leveduras; - Estudar o efeito desses peptídeos sobre a acidificação do meio, por células de leveduras, estimulada por glicose; - Avaliar o efeito dos peptídeos sobre a morfologia e ultraestrutura de células de levedura.

21 21 3. MATERIAS

22 MATERIAIS BIOLÓGICOS SEMENTES Sementes de pimenta (Capsicum annuum L.), cultivar UENF 1381, foram fornecidas pelo Laboratório de Melhoramento Genético Vegetal, do Centro de Ciências e Tecnologias Agropecuárias da Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro, Campos dos Goytacazes, Rio de Janeiro, Brasil LEVEDURAS As espécies de levedura Candida parapsilosis (CE001), Candida parapsilosis (CE002), Candida guilliermondii (CE004), Candida tropicalis (CE006) Candida guilliermondii (CE007), Pichia anomala (CE009), Candida krusei (CE010), Candida guilliermondii (CE013), Pichia membranifaciens (CE015), Candida rugosa (CE016), Candida tropicalis (CE017), Candida krusei (CE019), Candida albicans (CE022), Candida guilliermondii (CE023), Kluyveromyces marxiannus (CE025), Kluyveromyces lactis-similar (CE026), Candida guilliermondii (CE027), killer-saccharomyces cerevisiae (K1), Saccharomyces cerevisiae sensível a K1 (CE055), Candida glabrata sensível a K1 (CE1006) e a levedura Saccharomyces cerevisiae (1038) foram cedidas pela Profª Dra Vânia Maria Maciel Melo, do Laboratório de Microbiologia da Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, Ceará, Brasil. Todas as cepas foram mantidas em cultura e conservadas no Laboratório de Fisiologia e Bioquímica de Microrganismos, do Centro de Biociências e Biotecnologia da Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro, Campos dos Goytacazes, Rio de Janeiro, Brasil.

23 REAGENTES E OUTROS MATERIAS - REAGENTES PARA A EXTRAÇÃO DE PROTEÍNAS DAS SEMENTES - NaH 2 PO 4, Na 2 HPO 4, KCl, EDTA e (NH 4 ) 2 SO 4 foram obtidos da Merck S/A Indústrias Químicas e Sigma Co, St Louis, U.S.A. - PROTEÍNAS - BSA foi obtida através de Sigma Co, St Louis, U.S.A. - RESINAS PARA CROMATOGRAFIAS - CM-Sepharose foi adquirida da Pharmacia Fine Chemicals, Suécia. C2/C18 foi adquirida da Pharmacia Fine Chemicals, Suécia. - REAGENTES UTILIZADOS NA CROMATOGRAFIA - Foram utilizados para CM- Sepharose, NaH 2 PO 4 e NaCl obtidos da Sigma Co, St Louis, U.S.A.e para C2/C18 foram utilizados TFA, obtido da Sigma Co, St Louis, U.S.A. e ACN, obtido da Merck S/A. Indústrias Químicas. - MATERIAIS PARA ELETROFORESE - Acrilamida, N -N metilenobisacrilamida, SDS, azul de bromofenol, persulfato de amônio, Tris-base, TEMED, tricina, glicerol e marcadores de peso molecular foram adquiridos da Sigma Co, St Louis, U.S.A. - MATERIAL PARA DIÁLISE - Membranas de celulose para diálise que retém moléculas com massas moleculares acima de Da foram adquiridas da Sigma Co, St Louis, U.S.A. - MATERIAS PARA ELETROTRANSFERÊNCIA - Membrana PVDF Immobilon-P SQ, glicina e Ponceau S foram adquiridas da Sigma Co, St Louis, U.S.A. - MEIOS DE CULTURA - O Caldo Sabouroud e o Ágar Sabouroud foram adquiridos de Merck S/A Indústrias Químicas.

24 24 - REAGENTES USADOS PARA ENSAIOS ANTIFÚNGICOS E ACIDIFICAÇÃO - Glicose, NaH 2 PO 4 e NaCl foram adquiridos da Sigma Co, St Louis, U.S.A. e da Merck S/A Indústrias Químicas. - MATERIAS E REAGENTES UTILIZADOS PARA MICROSCOPIA - Glutaraldeído e paraformaldeído foram adquiridos da Sigma Co, St Louis,U.S.A., metanol foi adquirido da Merck S/A Indústrias Químicas e lâminas e lamínulas foram adquiridas comercialmente da Fisher Instrumental Ltda. Todos os demais reagentes utilizados foram de grau analítico e adquiridos comercialmente.

25 INSTRUMENTAL EQUIPAMENTOS MARCA MODELO Autoclave FABBE PRIMAR Balança Sartorius 2100 Balança Sartorius 110S Banho-maria FANEM 102 Bomba peristáltica Pharmacia RediFrac Capela de fluxo laminar vertical com lâmpada germicida VECO VLFS 12 Célula de transferência W.E.P. company IMM-1, Semi-dry Blotting System Centrífuga Hitachi Himac Cr 21 Environ Shaker Lab-line 3527 Estufa QUIMIS Q Espectofotômetro Zeiss Specol UV Vis Faca de diamante Diatome MS 118 RP-HPLC SHIMADSU LC-10AD Liofilizador Labconco Freeze dry system/freezone 4.5 Microcentrífuga não refrigerada Eppendorf 5415C Microscópio binocular AusJENA JENAMED 2 Microscópio óptico confocal de Zeiss LSM varredura a laser Microscópio eletrônico de transmissão Zeiss EM 900 Microscópio eletrônico de varredura Zeiss DSEM 962 phmetro QUIMIS 400-A Placa agitadora/aquecedora CORNING PC 220 Sistema para eletroforese Biorad 150A - Gel Electrophoresis Cell Ultramicrótomo Leica Ultracut Reichest S

26 26 4. MÉTODOS

27 OBTENÇÃO DA FARINHA Sementes de pimenta, Capsicum annuum L., foram maceradas em presença de nitrogênio líquido até a obtenção de uma farinha de fina granulação. Após a obtenção da farinha seguiu-se imediatamente a extração das proteínas. 4.2 EXTRAÇÃO E OBTENÇÃO DE PROTEÍNAS DE BAIXA MASSA MOLECULAR A farinha obtida foi extraída em tampão fosfato (Na 2 HPO 4 10 mm, NaH 2 PO 4 15 mm, KCl 100 mm, EDTA 1,5 %) ph 5,4 na proporção de 1:10 (farinha:tampão de extração) e deixado sob agitação constante por 3 h a 4 C. Essa metodologia foi desenvolvida segundo Diz et al. (2004), com algumas modificações (ESQUEMA 1). Após homogeneização o extrato foi submetido a centrifugação a x g por 30 min a 4 C e o sobrenadante resultante submetido a precipitação com sulfato de amônio a 90 % de saturação. Após 16 horas este material foi submetido a uma nova centrifugação a x g por 30 min a 4 C e o precipitado resultante foi ressuspenso em 10mL de água destilada. Finalmente este material foi aquecido a 80 C por 15 min e em seguida centrifugado a x g por 10 min a 4 C. O precipitado resultante desta última centrifugação foi descartado e o sobrenadante dialisado contra água destilada e em seguida liofilizado para ser utilizado na purificação dos peptídeos. Este material ao final deste processo foi denominado extrato rico em peptídeos (ERP), para então ser utilizado no isolamento dos peptídeos.

28 28 HOMOGENEIZADO - centrifugação a x g / 30 RESIDUO SOBRENADANTE - Sulfato de amônio a 90% de saturação - 4 C; 16 h - centrifugação a x g / 30 min PRECIPITADO SOBRENADANTE - Ressuspenso em água destilada - 80 C / 15 min - centrifugação a x g / 10 min PRECIPITADO SOBRENADANTE DIÁLISE EXTRATO RICO EM PEPTÍDEOS (ERP) ESQUEMA 1 Fracionamento com sulfato de amônio dos homogeneizados obtidos a partir da extração da farinha (Diz et al., 2004).

29 ISOLAMENTO DOS PEPTÍDEOS CROMATOGRAFIA DE TROCA CATIÔNICA (CM-SEPHAROSE) Uma coluna catiônica CM-Sepharose (1,5 x 50 cm) foi primeiramente empregada para o isolamento dos peptídeos. A resina foi empacotada com fluxo constante, sendo lavada seqüencialmente com água destilada, HCl 0,1 M, novamente água destilada, NaOH 0,1M, água destilada e por fim foi equilibrada com tampão fosfato de sódio 20 mm ph 8,0. Após sua ativação, 20 mg do extrato rico em peptídeos (ERP) foram pesados e dissolvidos em 10 ml de tampão fosfato 20 mm ph 8,0 (tampão de equilíbrio da coluna). A solução foi centrifugada por 5 minutos a x g em temperatura ambiente e aplicada na coluna. Foram coletadas frações de 3 ml a um fluxo constante de 30 ml.h -1. Os primeiros 15 tubos (cada um contendo 3 ml) foram eluídos com tampão fosfato de sódio 20 mm ph 8,0, em seguida, foi feito um gradiente com molaridades crescentes de 0.1 a 1.0 de NaCl, de 15 em 15 tubos (3 ml cada). As absorbâncias das frações foram lidas em comprimentos de onda de 280 nm. A fração F3 obtida nesta cromatografia foi submetida a cromatografia de fase reversa em coluna C2/C CROMATOGRAFIA DE FASE REVERSA EM HPLC Uma coluna de fase reversa C2/C18 equilibrada com 0,1 % de TFA foi empregada seqüencialmente no processo de isolamento dos peptídeos. A fração F3 obtida na cromatografia em coluna de CM-Sepharose foi solubilizada em TFA 0,1 % e, 150 µl (120 µl de amostra + 30 µl de TFA) desta mistura foram injetados na coluna de fase reversa. A cromatografia foi desenvolvida utilizando-se um fluxo de 0,7 ml.min -1 a temperatura de 32 C em sistema de HPLC. Para a eluição das proteínas da coluna foi utilizado um gradiente de acetonitrila de 0 a 80 %. Inicialmente (10 primeiros minutos) a coluna foi lavada com TFA 0,1 % em água ultrapura (solvente A), e em seguida um gradiente foi sendo formado através da mistura do solvente A e 80 % de acetonitrila em TFA 0,1 % (solvente B) por cerca de 48 min. Após esse período a coluna foi lavada com

30 % do solvente B totalizando 60 min. A eluição da coluna foi acompanhada por um detector do tipo DAD, sendo as absorbâncias lidas a 220 nm. 4.4 QUANTIFICAÇÃO DE PROTEÍNAS As determinações quantitativas de proteínas foram feitas através do método de Bradford (1976) sendo a BSA utilizada como padrão. 4.5 ELETROFORESE EM GEL DE TRICINA NA PRESENÇA DE SDS A eletroforese em gel de tricina foi feita segundo metodologia de Schagger e Von Jagow (1987). Foram usadas placas de vidro de 7 x 10 cm e 8 x 10 cm e espaçadores de 0,5 mm. O gel de separação foi preparado numa concentração de 16,4 % de Acrilamida/bis-acrilamida e o gel de concentração numa concentração de 3,9 % PREPARO DAS AMOSTRAS E CONDIÇÃO DE CORRIDA As frações protéicas obtidas nas cromatografias foram concentradas por liofilização, ressuspensas em tampão de amostra (Tris 0,125 M, SDS 2,5 %, azul de bromofenol 0,25 %, β- mercaptoetanol 5% e sacarose 15 %), aquecidas por 5 min a 100 C e centrifugadas a x g por 2 min. Após este procedimento, 20 µl das amostras foram aplicadas no gel de concentração. A eletroforese foi feita a uma voltagem constante de 18 V por um período de aproximadamente 16 horas. Foram usados os seguintes marcadores de massa molecular: mioglobina ( Da), mioglobina I + II ( Da), mioglobina I + III ( Da), mioglobina I (8.460 Da), mioglobina II (6.200 Da), glucagon (3.400 Da) e mioglobina III (2.500 Da). 4.6 COLORAÇÃO E DESCOLORAÇÃO DO GEL Após o término da corrida, o gel foi cuidadosamente retirado das placas de vidro e colocado em uma solução corante (Coomassie Blue R 0,05 %, ácido acético 70 % e metanol 40 %) por duas horas. Após esse período, o gel foi transferido para uma

31 31 solução descorante (metanol 40 % e ácido acético 7 %) e mantido nesta até a visualização das bandas de proteína. 4.7 WESTERN BLOTTING Após o término da eletroforese, o gel foi retirado das placas e imerso em tampão de transferência (glicina 182 mm, Tris 25mM e metanol 20 %) por 20 min. Uma membrana de nitrocelulose, cortada nas mesmas dimensões do gel, foi também imersa no tampão de transferência por 20 min. Após este período foi montado, sobre uma célula de transferência, um sanduíche com quatro folhas de papel de filtro Whatman 3 MM, previamente embebidas em tampão de transferência. Sobre essa camada de papel foi colocada a membrana e acima da membrana o gel, sendo então o sanduíche finalizado com mais uma camada de quatro folhas de papel de filtro Whatman 3 MM, já embebidas no tampão de transferência. Durante a montagem desse sanduíche as bolhas de ar foram evitadas e/ou removidas entre as camadas, para que não interferissem com a transferência das proteínas. Após esse procedimento, a célula de transferência foi fechada e foi aplicada uma corrente constante de 1 ma/cm 2 por 2 h no sentido gel-membrana. Após a transferência o sanduíche foi cuidadosamente desfeito e a membrana submetida à coloração com Ponceau S (0,1 %) para confirmação da transferência. Nessa análise foram empregados os procedimentos descritos por Towbin et al. (1979) REVELAÇÃO DA MEMBRANA Após coloração com Ponceau S 0,1 %, a membrana foi bloqueada com tampão bloqueador (Tris-HCl 50 mm, ph 8,0; NaCl 150 mm contendo Tween 20 0,05 %) por 30 min para facilitar a ligação dos anticorpos as proteínas. Após o bloqueio, a membrana foi incubada com anticorpo primário (1:1000 diluído em tampão bloqueador) contra LTP presente na fração F1 de sementes de Capsicum annuum L. por 18 h a 4ºC. Após esta incubação com o anticorpo primário, foram feitas 10 lavagens de 5 min em tampão de lavagem (Tris-HCl 50 mm, ph 8,0 e NaCl 150 mm. Ao término desta lavagem a

32 32 membrana foi imersa novamente em tampão bloqueador contendo o anticorpo secundário (1:2000), conjugado com peroxidase por 2 h a temperatura ambiente. Após esta incubação, foram feitas mais 10 lavagens de 5 min em tampão de lavagem. Ao término das lavagens foi feita a revelação com diaminobenzidina (DAB) imergindo a membrana na solução reveladora (Tris-HCl 40 mm, ph 7,5, DAB 1 mg.ml -1, imidazol 100 mm e peróxido de hidrogênio 0,03 %) até a visualização das bandas marcadas. Nessa análise também foram empregados os procedimentos descritos por Towbin et al. (1979). 4.8 PRECIPITAÇÃO COM NITRATO DE PRATA A precipitação por nitrato de prata foi feita segundo método descrito por Morrissey (1998) PREPARO DAS SOLUÇÕES Solução 1: foi preparada utilizando-se 10 % de ácido acético, 40 % de etanol absoluto para um volume total de 40 ml de água ultrapura; Solução 2: foi preparada utilizando-se 5 % de glutaraldeído para um volume total de 40 ml de água ultrapura; Solução 3: foi preparada utilizando-se 20 % de etanol absoluto para um volume total de 120 ml de água ultrapura; Solução 4: chamada de Solução de Coloração, foi preparada utilizando-se 20 % de etanol, 20 % de nitrato de prata, 30 % de hidróxido de amônio e 4 % de hidróxido de sódio para um volume total de 73 ml de água ultrapura. Os reagentes foram colocados nessa ordem e sob agitação. Essa solução foi preparada imediatamente antes do uso e protegida da luz; Solução 5: chamada de Solução Reveladora, foi preparada utilizando-se 20 % de etanol, 37 % de formaldeído e 2,3 M de ácido cítrico para um volume total de 100 ml de água ultrapura. O formaldeído deve ser preparado antes do uso;

33 33 Solução 6: chamada Solução de Fixação, foi preparada utilizando-se 5 ml de ácido acético e 500 µl de glicerol para um volume total de 50 ml de água ultrapura. Esta solução foi preparada juntamente com a solução PRECIPITAÇÃO Ao término da corrida, o gel foi cuidadosamente retirado das placas de vidro e: incubado na solução 1 por 40 min; lavado em água ultra pura por 5 min; incubado na solução 2 por 20 min; lavado novamente em água ultra pura (2 lavagens de 10 min cada); incubado na solução 3 por 20 min; incubado na solução 4 (ao abrigo da luz) por 20 min; incubado na solução 3 por 20 min (2 lavagens de 10 min cada); colocado na solução 5 até obter coloração desejada; deixado na solução 6 por 10 min para fixar a coloração; e armazenado em água destilada. 4.9 SEQÜENCIAMENTO DE PROTEÍNAS PREPARO DE AMOSTRAS PARA SEQÜENCIAMENTO Amostras contendo os peptídeos antifúngicos das frações FR1, FR2, FR3 e FR4, obtidas em coluna C2/C18 (FP-HPLC), foram secas e ressuspensas em 20 µl de acetonitrila 40 % e logo após aplicadas diretamente sobre uma membrana de PVDF e então submetidas ao seqüenciamento N-terminal DETERMINAÇÃO DA SEQÜÊNCIA DE AMINOÁCIDOS Foi empregada a metodologia introduzida e desenvolvida por Edman (1950) utilizando em um seqüenciador automático de proteínas. Este é um processo cíclico de três etapas onde os resíduos de aminoácidos são clivados um a um, a cada ciclo, a partir do N-terminal da proteína e são identificados como derivados fenilisotiocianato (PITC) com resíduo N-terminal; a segunda, a clivagem do resíduo N-terminal via ciclização em meio ácido; a terceira, a conversão do derivado tiozolinona (ATZ) formado