PRÁTICA 4: FORMAS NUCLEARES

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1 PRÁTICA 4: FORMAS NUCLEARES INTRODUÇÃO: As células apresentam uma variedade muito grande, quanto ao número, tamanho, forma e posição de seus núcleos. Em geral o número e tamanho dos núcleos estão relacionados à atividade metabólica da célula. Células que apresentam uma alta taxa de síntese protéica e células muito grandes podem ter mais de um núcleo e/ou núcleos maiores. A diferença de tamanho dos núcleos deve-se à duplicação da cromatina sem a ocorrência da divisão celular (poliploidia). O aumento também pode ser resultante de uma descondensação de cromatina, acompanhada de intensa síntese de RNA, como ocorre em neurônios e em ovócitos. Certos tipos celulares apresentam a cromatina altamente condensada, como a maioria dos leucócitos de mamíferos e as hemácias nucleadas de aves. Nestes casos, a atividade de síntese de RNA é muito reduzida ou inexistente. Outras células, altamente especializadas, como as hemácias (eritrócitos) de mamíferos, são anucleadas quando caem na corrente sanguínea. A formação das hemácias ocorre na medula óssea, a partir de células nucleadas (eritroblastos). O núcleo do eritroblasto inicial apresenta cromatina descondensada e nucléolo evidente. Durante a sua maturação, observa-se uma condensação progressiva da cromatina, acompanhada de redução do volume nuclear, sendo o núcleo eliminado por extrusão no final deste processo. Isto resulta num eritrócito anucleado, portanto, incapaz de se reproduzir o que determina sua curta vida média (em torno de 20 dias). Geralmente, os núcleos dos diferentes tipos celulares ocupam uma posição central. No entanto, em certos casos o núcleo é deslocado do centro, em conseqüência do acúmulo de materiais no citoplasma. Por exemplo, em células secretoras de glicoproteínas os núcleos estão localizados na porção basal (céls. acinosas do pâncreas e as caliciformes do intestino), em células musculares esqueléticas estriadas, devido a grande quantidade de microfilamentos, os numerosos núcleos ovóides são periféricos como ocorre nas células vegetais devido à presença dos grandes vacúolos citoplasmáticos. Já em adipócitos, o acúmulo de gordura desloca o núcleo para a periferia da célula. Normalmente a forma o núcleo acompanha a forma da célula. Células com formato cúbico apresentam núcleos esféricos e células cilíndricas têm núcleo alongado. Entre os leucócitos observamos núcleos multiformes e irregulares. Por exemplo, os neutrófilos apresentam núcleos polimórficos, com 2 a 5 lóbulos ligados variam de ovóide a reniforme, de acordo com o estádio de maturação da célula. A presença do núcleo é a principal característica que distingue uma célula eucarionte de um procarionte. A maior parte da informação genética da célula está acumulada no DNA do núcleo, existindo apenas uma pequena porção fora dele, nas mitocôndrias e cloroplastos. Além da informação genética da célula, o núcleo controla o metabolismo celular através da transcrição do DNA nos diferentes tipos de RNAs, (mensageiro, ribossomal e transportador). Todos eles participam da síntese de proteínas no citoplasma da célula. 17

2 CÉLULAS DO SANGUE: O sangue é a massa líquida num compartimento fechado, o aparelho circulatório, que a mantém em movimento regular e unidirecional, devido essencialmente as contrações rítmicas do coração. O volume total de sangue num homem normal, pesando 70 kg, é de aproximadamente 5,5 litros. A absorção microscópica in vivo dos capilares (na conjuntiva ocular do homem; no mesentério dos animais) mostra que a homogeneidade do sangue é apenas aparente. Ele é formado de duas fases: os glóbulos sanguíneos e o plasma, fase líquida na qual os primeiros estão suspensos. Quando o sangue é removido da circulação, o fibrinogênio do plasma transforma-se em fibrina, que forma um coágulo. Este contém glóbulos sanguíneos presos às malhas de fibrina. Durante a coagulação, separa-se do coágulo um líquido amarelo-claro, o soro sanguíneo. A citologia sanguínea é geralmente estudada por uma técnica chamada de Esfregaço, que consiste em espalhar uma gota de sangue sobre uma lâmina de microscopia (Fig. 1). As células ficam estiradas e separadas, o que facilita a observação da sua estrutura. A coloração de rotina dos esfregaços de sangue é feita com corantes especiais, baseados na mistura de Romanowsky. Este pesquisador observou que as soluções envelhecidas de azul-de-metileno coravam em púrpura os núcleos dos leucócitos e certos parasitas do sangue. Hoje sabemos que esse fato decorre por causa da oxidação dos azures-de-metileno. As misturas tipo Romanowsky contêm eosina, além dos corantes mencionados, sendo, portanto, soluções de eosinatos de azures-de-metileno. Atualmente os corantes usados para estudar as células sanguíneas são corantes de Leishman, Wright Giemsa, todos contendo azul-de-metileno, eosina e azures-demetileno e por isso, conhecido como misturas tipo Romanowsky. Após a aplicação da mistura tipo Romanowsky, observam-se basicamente quatro tipos de coloração, segundo a afinidade das estruturas celulares pelos respectivos corantes da mistura. A afinidade pelo azul-de-metileno indica basofilia (azul); 2. A afinidade pelos azures, azurofilia (púrpura); 3. A afinidade pela eosina, acidofilia ou eosinofilia (rosa-amarelado); 4. A afinidade por mistura complexa chamada neutrofilia (salmão). Os glóbulos sanguíneos são os eritrócitos ou hemácias, leucócitos e as plaquetas. Os eritrócitos ou hemácias dos mamíferos são anucleados e, no homem, têm a forma bicôncava proporciona grande superfície em relação ao volume das hemácias, o que facilita as trocas de gases. A concentração normal de eritrócitos no sangue é de aproximadamente 4,5 e 5,5 milhões por mm³, na mulher e no homem respectivamente. As anemias são doenças caracterizadas por baixa concentração de hemoglobina no sangue. Muitas vezes a anemia é conseqüência de uma diminuição do número de eritrócitos. No entanto, o número de eritrócitos pode ser normal, mas cada um deles pode conter pouca hemoglobina. Neste caso os eritrócitos se coram mal e, por isso, este tipo de anemia é denominada Hipocrômica. As anemias podem ser causadas por 1; Perda de sangue, isto é, hemorragia. 2; Produção insuficiente de eritrócitos pela medula óssea; 3; Produção de 18

3 eritrócitos com hemoglobina insuficiente, geralmente por deficiência de ferro na alimentação; 4; Destruição acelerada dos eritrócitos. Devido à sua riqueza em hemoglobina, uma proteína básica, os eritrócitos são acidófilos, corando-se pela eosina como fantasmas e têm sido utilizados para o estudo da membrana celular. Ao contrário, quando os eritrócitos são submetidos a condições de hipertonicidade, eles encolhem irregularmente deixando protuberâncias na superfície recebendo o nome de hemácias crenadas. Ao penetrarem na corrente sanguínea vindas da medula óssea vermelha onde são formados, os glóbulos vermelhos contém ainda certa quantidade de ribossomos. Quando corados, estes corpúsculos apresentam uma cor azulada, devido à basofilia do RHA, que se superpõe à acidofilia de hemoglobina. Certos corantes, como o azul brilhante de cresil, precipitam este RNA, dando origem a uma delicada rede de material basófilo que aparece bem corado em azul. Estes corpúsculos são chamados reticulócitos e sua concentração no sangue normal é em torno de 1% do número total de hemácias. Os leucócitos ou células brancas do sangue são corpúsculos incolores implicados nas defesas celulares e imunocelulares do organismo. São células esféricas, quando em suspensão no sangue circulante, porém capazes de tomarem um aspecto amebiforme ao encontrarem um substrato sólido. Estas células são classificadas em 2 grupos: granulócitos e agranulócitos. Os leucócitos granulócitos têm forma irregular e mostram no citoplasma grânulos específicos. De acordo com afinidade tintorial de seus grânulos citoplasmáticos, distinguem-se 3 tipos de granulócitos: neutrófilos, eosinófilos e basófilos. O grânulo é específico quando têm características próprias (dimensões, forma, afinidade tintorial e ultra-estrutural) e está presente de modo constante num determinado tipo de leucócito e seus precursores. Os núcleos dos agranulócitos têm forma mais regular e o citoplasma não possui granulações específicas, podendo, porém, apresentar grânulos inespecíficos, presentes também em outros tipos celulares. Há 2 tipos de agranulócitos: Os linfócitos e os monócitos. Os neutrófilos têm núcleos formados por 2 e 5 lóbulos, mais frequentemente por 3 lóbulos, ligados entre si por finas pontes de cromatina. A célula muito jovem tem núcleo não segmentado em lóbulos, sendo chamada de neutrófilo com núcleo em bastonete ou simplesmente bastonete. Nessas células o núcleo tem a forma de um bastonete curvo. O núcleo dos diversos granulócitos mostra um padrão cromatínico semelhante, neles são observadas massas densas de cromatina, distribuídas principalmente em sua periferia, aplicados contra a membrana nuclear. As zonas de cromatina de arranjo frouxo localizam-se, sobretudo no centro do núcleo. Dependendo do número de lóbulos nuclerares, os neutrófilos dividem-se em bi, tri, tetra, pentalobulados etc. As formas com mais de 5 lóbulos são chamados hipersegmentadas e representariam células envelhecidas. Os eosinófilos são menos numerosos do que os neutrófilos, constituindo apenas 2-3% do total de leucócitos. Geralmente, o seu núcleo é bilobulado. A principal característica para a identificação do eosinófilo é a presença de granulações ovóides que se coram pela eosina (granulações acidófilas). Essas granulações são maiores do que a dos neutrófilos. Ao nível da microscopia eletrônica os eosinófilos apresentam uma unidade de membrana. O citoplasma é quase que inteiramente ocupado pelos grânulos específicos. O retículo 19

4 endoplasmático, as mitocôndrias e o Complexo do Golgi são pouco desenvolvidos. Os grânulos específicos dos esinófilos são lisossomos, porque neles já detectadas as enzimas: fosfatase ácida, peroxidase, beta-glicuronidase, sulfatase, ribonuclease e desoxirribonuclease. Os basófilos têm um núcleo volumoso, com forma retorcida e irregular, geralmente com o aspecto da letra S. O citoplasma dos basófilos é carregado de grânulos maiores do que os dos outros granulócitos, os quais muitas vezes obscurecem praticamente o núcleo. Constituem menos de 1% dos leucócitos do sangue, sendo por isso, difíceis de encontrar nos esfregaços de sangue. Seus grânulos medem 0,15 a 0,5 µm de diâmetro, são eletrondensos e estão envolvidos por uma membrana unitária, apresentando com freqüência no seu interior filamentos ou partículas alongadas. A membrana dos basófilos possui receptores para a imunoglobulina E (Ig E). Os linfócitos são células esféricas, com diâmetro variável entre 6 e 8 µm. Linfócitos com estas dimensões são conhecidos como linfócitos pequenos. No sangue circulante ocorre ainda uma pequena percentagem de linfócitos maiores, que podem atingir 18 µm de diâmetro. O linfócito tem núcleo esférico, às vezes com uma indentação. Sua cromatina se dispõe em grumos grosseiros, de modo que o núcleo aparece escuro nos preparados usuais, características, que favorece a identificação do linfócito. O citoplasma desta célula é muito escasso, aparecendo nos esfregaços como um anel delgado em volta do núcleo. Apresenta basofilia discreta, corando-se em azul claro nos esfregaços. Às vezes, o citoplasma não é visível, contendo grânulos que se coram em púrpura pelo azul das misturas tipo Romanowsky. Esses grânulos são ditos azurófilos, não sendo exclusivos dos linfócitos, pois aparecem também nos monócitos e granulócitos. Ao microscópio eletrônico, o citoplasma dos linfócitos mostra-se pobre em organela, contendo moderada quantidade de ribossomos livres. Os monócitos têm o núcleo ovóide, em forma de rim ou de ferradura, sendo geralmente excêntrico. Os monócitos mais jovens são os que apresentam núcleo ovóide. Os núcleos de forma de rim e de ferradura representam estágios mais avançados do amadurecimento dessas células. A cromatina aparece em arranjo mais frouxo e delicado do que nos linfócitos, que são células sanguíneas com as quais poderiam ser confundidas, embora geralmente os monócitos sejam maiores. O núcleo do monócito contém 2 ou 3 nucléolos, que algumas vezes podem ser vistos nos esfregaços comuns corados por misturas do tipo Romanowsky. O citoplasma do monócito é basófilo e contém grânulos azurófilos muito finos dos quais estão no limite de resolução do microscópio óptico. Estes grânulos podem preencher todo o citoplasma, conferindo-lhe uma coloração acinzentada. Foi detectado através de estudos, que o conteúdo enzimático desses grânulos são lisossomos. Ao nível da microscopia eletrônica o citoplasma dos monócitos possui uma quantidade média de ribossomos, reticulo endoplasmático e Complexo de Golgi bem desenvolvidos e poças mitocôndrias alongadas. Nas áreas próximas à reentrância nuclear, geralmente se observam microtúbulos e microfilamentos. Os monócitos do sangue representam uma fase na maturação da célula mononucleada fagocitária originada na medula óssea. Esta célula passa para o sangue, onde permanece apenas por alguns dias, e atravessando a parede dos capilares e vênulas, penetra no tecido conjuntivo, como também alguns órgãos transformando-se em 20

5 macrófagos, o que constitui uma fase mais avançada da célula mononucleada fogocitária. Assim, o monócito faz parte do sistema mononuclear fagocitário ou sistema histiocitário. As plaquetas são corpúsculos anucleados com a forma de disco, medindo cerca de 3 µm e diâmetro, derivados de células gigantes da medula óssea, os megacariócitos. Nos esfregaços de sangue, as plaquetas tendem a aparecer em grupos (aglutinação). Elas apresentam uma parte transparente, azul-claro e hialômero, o qual contém grânulos corados em púrpura e cromômero. A ultra-estrutura das plaquetas exige fragmentos citoplasmáticos apresentando um sistema de túbulos e vesículas derivadas de invaginações da membrana. Observam-se também feixes de microtúbulos contribuindo para manter a forma ovóide desses corpúsculos. Os microfilamentos de actina e miocina também estão presentes, responsáveis pela formação de filopódios (prolongamentos finos) e pela contração das plaquetas. O plasma corresponde a solução aquosa contendo componentes de pequeno e grande peso molecular, que correspondem a 10% do seu volume. As proteínas plasmáticas correspondem a 7%, os sais inorgânicos a 0,9%, sendo o restante formado por compostos orgânicos diversos, tais como aminoácidos, vitaminas, hormônios, lipoproteínas, etc. Entre as proteínas do plasma, podemos citar a Albumina, as Alfa, Beta e Gamaglobulinas, e o Fibrinogênio. A albumina é a proteína mais abundante do plasma sanguíneo e representa um papel fundamental na manutenção da pressão osmótica do sangue. As gamaglobulinas são anticorpos e, por isso, chamadas de Imunoglobulinas. O fibrinogênio é necessário para a formação de fibrina na etapa final da coagulação. Diversas substâncias que são insolúveis ou pouco solúveis em água podem ser transportadas pelo plasma devido ao fato de se combinarem com a albumina ou com as alfa e betaglobulinas, as quais atuam como transportadoras. Por exemplo, as proteínas carregam lipídios devido ao fato de terem em suas moléculas partes hidrofóbicas e partes hidrofílicas. Os lipídios prendem-se às porções hidrofóbicas, enquanto as partes hidrofílicas ligam-se à água mantendo o complexo em solução. HEPATÓCITOS: O fígado é constituído principalmente por células hepáticas ou hepatócitos. Estas células apresentam forma poliédrica com 6 ou mais faces e medem 20 a 30µm de diâmetro. O hepatócito apresenta um núcleo (às vezes 2) central, arredondado, com 1 ou 2 nucléolos bem evidentes. A organela mais evidente é o retículo endoplasmático, tanto na sua forma rugosa como na lisa. O RR rugoso se apresenta como acúmulos dispersos no citoplasma, formando os corpos basofílicos. É nessa organela que ocorre a síntese das várias proteínas plasmáticas produzidas pelo fígado, entre as quais a albumina e o fibrinogênio do sangue. Outro componente da célula hepática é o glicogênio, que ao microscópio eletrônico, se apresenta sob a forma de grãos grosseiros, freqüentemente acumulados na zona do retículo endoplasmático liso. A quantidade de glicogênio presente nos hepatócitos é muito variável. O glicogênio funciona como um depósito que a célula hepática mobiliza quando ocorre uma queda da glicose no sangue circulante (hipoglicemia). 21

6 Junqueira & Carneiro Histologia Básica 11ª Edição. 22

7 Objetivo: Observar as diversas formas nucleares. Material de Estudo: Sangue. Obtenção da amostra: Obtém-se por punção da polpa do dedo, que pode ser feita com o auxílio de lanceta. O instrumento é flambado numa lâmina de álcool ou desinfetado com algodão embebido em álcool. A colheita de sangue será feita levando-se em consideração que a gota de sangue a ser encostada na lâmina invertida, que só toca na gota emergente, evitando assim o contato com a pele. Procedimento: 1. O material fresco, geralmente fluido, é pingado próximo a uma das extremidades da lâmina (aproximadamente a um ou dois centímetros da extremidade da mesma), ou então se pode tocar com a borda da lâmina o material a ser estudado. 2. Coloca-se uma segunda lâmina com a qual se fará o esfregaço, sobre a face superior da primeira lâmina, de modo que se forme um ângulo de 45º. 3. Faz-se um ligeiro movimento da segunda lâmina para trás, até encostar-se ao material em estudo, deixando que este material se difunda uniformemente, ao longo de toda a borda, por capilaridade. 4. Leva-se a segunda lâmina para frente, de forma que ela carregue o material, que se estenderá numa camada delgada e uniforme sobre toda a extensão da primeira lâmina. É essencial escorregar a segunda lâmina sem deter-se. O movimento de extensão deve ser uniforme. O material deverá ser puxado pala segunda lâmina e não empurrada pela mesma, afim de que sejam evitados danos às células. 5. A seguir, seca imediatamente o esfregaço, agitando a lâmina no ar ou com o auxílio de um ventilador. A dissecação rápida é indispensável para uma boa conservação morfológica dos glóbulos e outros elementos, eventualmente existentes. Não se deve esquecer o esfregaço para secá-lo. Logo após, o material é fixado por 5 segundos no álcool metílico. Secado à temperatura ambiente e submetido à coloração Panótipo Rápida, ou seja, 5 segundos no corante 1 (vermelho), escorrer o excesso do corante e em seguida colocar o corante 2 (azul) por 5 segundos. Dar uma lavada rápida na água torneiral. Secar à temperatura ambiente e montar em Entelan. 23

8 Atividade Prática: Observar e fazer o desenho esquemático de todos os núcleos das células sanguíneas (técnica do espelhamento), objetiva de 100x. Aumento: Aumento: Aumento: Aumento: Aumento: Aumento: 24

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