Mini Curso # 4: Estatística para Bioquímica e Biotecnologia. Ministrado por: Dr. Marcelo Caldeira Viegas marcelo.viegas@unopar.br

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1 Mini Curso # 4: Estatística para Bioquímica e Biotecnologia Ministrado por: Dr. Marcelo Caldeira Viegas marcelo.viegas@unopar.br

2 CONSIDERAÇÕES INICIAIS A competitividade e o alto custo tornam, a cada momento, mais difícil pensar em desenvolvimento de produtos e processos sem agregar uma metodologia científica de trabalho.

3 ALIMENTOS QUíMICA Algumas áreas de aplicações PETROQUíMICA FARMACÉUTICA... ENGENHARIA BIOTECNOLOGIA

4 Limitações da Estatística: 1 o ) Toda a informação está contida nos dados. A conclusão, no máximo, terá a qualidade dos dados que a geraram. Se os dados forem iniciados ou coletados inadequadamente, qualquer conclusão que deles advenham está comprometida. A estatística não serve para corrigir erros grosseiros ou técnica defeituosa 2 o ) A Estatística apenas auxilia o pesquisador, mas não dispensa o espírito científico crítico e cético, nem o conhecimento profundo do processo em estudo.

5 Teste de Hipóteses

6 Teste de Hipóteses Regra de decisão estatística que permite, com base em informações contidas nos dados amostrais, concluir sobre parâmetros da população (Estatística Inferencial).

7 Hipótese Estatística É uma suposição sobre algum parâmetro da população, que será posta à prova através do teste de hipóteses. Consideram-se, sempre, duas hipóteses: H 0 e H 1, denominadas, respectivamente, hipótese nula e hipótese alternativa.

8 Hipótese Nula (H 0 ) H 0 é a hipótese que está sendo colocada à prova (exemplo: o ph médio da população alvo é igual a 5,0).

9 Exemplos: Hipótese Alternativa (H 1 ) H 1 é a hipótese que será aceita, se for rejeitada no teste. H 1 : O ph médio da população alvo é diferente de 5,0 Teste bilateral H 1 : μ5,0 H 1 : O ph médio da população alvo é menor que 5,0 Teste unilateral à esquerda H 1 : μ<5,0 H 1 : O ph médio da população alvo é maior que 5,0 Teste unilateral à direita H 1 : μ>5,0

10 Teste de Hipóteses Escolha do Tipo de Distribuição Amostral Distribuição Normal ou t-student? - Distribuição Normal (Teste Z) Se n>30 Se n<30 e o desvio padrão populacional () for conhecido - Distribuição t-student (Teste t) Se n<30 e o desvio padrão populacional () for desconhecido

11 Teste de Hipóteses - Valores Críticos(Tabelados): Distribuição Normal (Teste Z) Se o nível de confiança for de 90%, Z crit =±1,65 Se o nível de confiança for de 95%, Z crit =±1,96 Se o nível de confiança for de 99%, Z crit =±2,57 Distribuição t-student (Teste t) O valor de t crit depende do tamanho da amostra (n). Anexo 1

12 Mecanismo dos erros Testes de Hipóteses Como o teste de hipóteses é baseado em amostras aleatórias, há sempre algum risco de erro. É importante lembrar que uma outra amostra retirada poderia fornecer valores diferentes daquela utilizada na realização do teste.

13 Erro do tipo I ou de primeira espécie: rejeitar H 0, quando H 0 é verdadeira. A probabilidade de cometermos um erro do tipo I, também conhecida como nível de significância do teste, é denotada por α e escolhida a priori pelo pesquisador. Em geral, o nível de significância α = 0,05 (5%) é muito bem aceito pela comunidade científica. α = P (erro tipo I) = P (rejeitar H 0, quando H 0 é verdadeira).

14 Teste de Hipóteses O nível de confiança, 1 - α, varia de acordo com o interesse e a exigência do pesquisador, devendo ser fixado a priori. Um valor bem aceito universalmente é 1 - α = 0,95 ou, em termos de porcentagens, (1 - α)% = 95% e será aqui adotado.

15 Erro do tipo II ou de segunda espécie: não rejeitar H 0, quando H 0 é falsa. A probabilidade de cometermos um erro do tipo II é denotada por β. β = P (erro tipo II) = P (não rejeitar H 0, quando H 0 é falsa).

16 Mecanismo dos erros num teste estatístico Realidade na População Resultado do Teste Estatístico Aceita H 0 Rejeita-se H 0 H 0 é verdadeira H 0 é falsa Resultado correto: não há erro Erro do Tipo II Erro do Tipo I Resultado correto: não há erro

17 Testes de hipóteses Regra dos 4 passos a. Enunciar claramente as hipóteses H 0 : μ = μ 0 e H 1 : μ μ 0 ; b. Fixar o nível de significância α e determinar as regiões críticas do teste: de aceitação (RA) e de rejeição (RR) de H 0, definidas pelo valor tabelado de t (n-1; α/2). Em geral α = 0,05 (5%); c. Calcular o valor da estatística do teste d. Decisão Estatística: Comparar o valor calculado (item c) com o valor que delimita as regiões críticas (item b). Dependendo do resultado a hipótese nula (H 0 ) será aceita ou rejeitada. x s 0 t Calc n

18 Regiões Críticas São as regiões de aceitação de H 0, que denotaremos RA H 0, e de rejeição de H 0, que denotaremos RR H 0. Teste bilateral: Se -t (n-1; α/2) < t Calc < t (n-1; α/2), aceita H 0, ou equivalentemente, através do p-valor, rejeita-se H 0 se p-valor α. Figura 01: Esboço de um teste bilateral, para a média de uma população normal, H 1 : μ μ 0

19 Regiões Críticas Teste Unilateral a Direita: Aceita H 0, quando t Calc < t Tab ou, equivalentemente, quando p valor > α = 0,05 (95% de confiança). 4 2 R A Ho : 1 - alfa = 0,95 p - valor > 0,05 R R Ho : alfa = 0, t Calc t Tab 6 Figura 02: Esboço de um teste unilateral para a média de uma população normal, H 1 : μ > μ 0. p-valor >.

20 Regiões Críticas Teste Unilateral a Direita: Rejeita-se H 0, quando t Calc t Tab ou, equivalentemente, quando p valor α = 0,05 (95% de confiança). 4 2 R A Ho : 1 - alfa = 0,95 R R Ho : alfa = 0,05 p - valor < 0, t Tab 4 t Calc 6 Figura 03: Esboço de um teste unilateral a direita para a média de uma população normal, H 1 : μ > μ 0. P-valor<

21 Planejamento Experimental Design of Experiments (DOE) e Otimização de Processos Livro Texto: Planejamento de Experimentos e Otimização de Processos autores: M. Isabel Rodrigues e Antonio Francisco Iemma, Campinas, 2ª. edição, 2009

22 NOÇÕES SOBRE EXPERIMENTOS FATORIAIS Os Planejamentos Experimentais Fatoriais se baseiam na Estatística, mas a atividade estatística mais importante não é a análise dos dados, e sim o planejamento dos experimentos em que esses dados devem ser obtidos.

23 Para se atingir os objetivos desejados utilizando-se esta ferramenta estatística e necessário uma interação entre: PROCESSO ESTATÍSTICA BOM SENSO

24 Em diversas situações, é imediato estabelecer conclusões a partir de um experimento bem planejado, empregando apenas técnicas de análise bastante elementares. Por outro lado, mesmo a análise estatística mais sofisticada não pode salvar um experimento que tenha sido mal planejado. (Box, Hunter & Hunter)

25 Porque aprender Planejamento de Experimentos? Desenvolvimento de um novo produto e/ou processo Melhorar o produto que já está no mercado Conhecer o efeito das variáveis do processo Melhorar metodologias analíticas Otimização do processo Redução de custos

26 O sucesso de um planejamento de experimentos dependerá em grande parte da forma com que este é estruturado e como será realizado. Entender claramente quais são os objetivos de realizar um experimento é necessário antes de qualquer ação para executá-lo. Montgomery (2009)

27 Vantagens do Planejamento Experimental: Reduz o número de experimentos, com melhor qualidade de informação nos resultados; É possível detectar o erro experimental e avaliá-lo; A análise multivariável permite verificar e quantificar efeitos sinérgicos e antagônicos entre as variáveis estudadas; É possível otimizar mais de uma resposta ao mesmo tempo;

28 Roteiro para elaboração de um planejamento de experimentos: a) Análise do processo; b) Escolha dos fatores (variáveis independentes) e dos níveis que serão avaliados; c) Seleção das variáveis resposta; d) Escolha do planejamento experimental mais adequado; e) Realização dos ensaios conforme indicado pelo delineamento experimental (item d); f) Análise dos dados (Modelo Obtido, ANOVA, Superfície de Respostas e Curvas de Contorno); g) Conclusões e Recomendações;

29 Variáveis Independentes: Fatores a serem estudados ou avaliados num processo (que podem ser controladas) Ex.: Formulação, temperatura, ph, agitação, aeração, tempo de residência, vazão de alimentação, pressão, etc... Variáveis Dependentes: Respostas desejadas (determinadas experimentalmente) Ex.: Rendimento, produtividade, índice de expansão, atributos sensoriais, fator de pureza, atividade enzimática, etc...

30 R 1,2,...j = f (F 1, F 2,... F k ) Estabelecer uma função matemática que correlacione as variáveis estudadas em função da(s) resposta(s) determinada(s).

31 Tabela 01: Nº. de ensaios experimentais de alguns delineamentos fatoriais completos Fatores Níveis K=2 K=3 K=6 K =4 2 3 =8 2 6 =64 2 k =9 3 3 = =729 3 k N N 2 N 3 N 6 N K Como pode ser visto pela Tabela 01, o nº. de ensaios cresce exponencialmente, praticamente inviabilizando a utilização de delineamentos completos para 6 ou mais fatores com dois níveis e para 4 ou mais fatores com 3 níveis.

32 Comparação entre o planejamento fatorial versus estudo de um fator por vez. Estudo de caso em bioprocessos

33 Estudo de Caso: AVALIAÇÃO DO EFEITO DO ph e TEMPERATURA NA ATIVIDADE DE UMA ENZIMA Augusto, A C.S.; Costa, F.A.A. e Rodrigues, M.I. Laboratório de Engenharia de Bioprocessos FEA UNICAMP, 2002

34 a) Estudo de uma variável por vez (10 ensaios): Ensaios a 40 o C a diferentes valores de ph Ensaios a ph 4,0 e diferentes valores de temperatura ph Atividade (U/mL) Temperatura ( o C) Atividade (U/mL) 3, , , , ,

35 300 Atividade (U/mL) Atividade enzimática em função 50 2,5 3,5 4,5 5,5 6,5 7,5 ph 500 (a) ph (temperatura de 40 o C) 400 Atividade (U/mL) Temperatura ( o C) (b) da temperatura (ph igual a 4,0)

36 b) Estudo Fatorial (25 ensaios): T=30 o C T=40 o C T=50 o C T=60 o C T=70 o C ph Ativ. (U/mL) ph Ativ. (U/mL) ph Ativ. (U/mL) ph Ativ. (U/mL) ph Ativ. (U/mL)

37 Comportamento da atividade enzimática em diferentes ph e temperaturas ( o C) Atividade (U/mL) ,5 3,5 4,5 5,5 6,5 7,5 ph

38 Delineamento Experimental Fatorial 2 K (dois níveis)

39 Experimentos com Delineamento Fatorial 2 K Os delineamentos com esquema fatorial 2 K, ocorrem quando temos K fatores, todos com dois níveis (-1 e +1). Delineamentos deste tipo são muito utilizados em laboratórios e locais onde as fontes externas de variação são, geralmente muito bem controladas. Eles apresentam uma vantagem incontestável: fornecem o maior número possível de graus de liberdade para o resíduo (erro).

40 a.1) Delineamento Fatorial 2 K com repetições (replicatas genuínas) : Suponha um experimento para estudar a atividade enzimática em função do ph (fator A) e da temperatura (fator B), ambos avaliados em dois níveis que denominaremos apenas de baixo (-1) e alto (+1), realizados em triplicata (três repetições), conforme descrito na Tabela 02. Tabela 02: Atividades Enzimáticas (U/mL), segundo o ph e a temperatura Ensaios Fatores Repetições ph (A) Temp. (B) Tratamentos Totais Ativ. Enzim. (Média) 1 3 (-1) 30 (-1) (+1) 30 (-1) a (-1) 70 (+1) b (+1) 70 (+1) ab

41 Uma descrição esquemática dos resultados desse experimento pode ser visualizado na Figura 04. Figura 04: Representação Esquemática dos Resultados Obtidos

42 a.1.1) Delineamento Fatorial 2 K com repetições (Cálculo dos Efeitos Principais dos Fatores e da Interação sobre as Respostas) - O efeito principal de um fator A pode ser entendido como a variação causada na resposta, quando percorremos todos os níveis de A, independente dos demais fatores. No exemplo em questão podemos estimar o efeito principal do ph como a diferença entre as atividades enzimáticas médias no nível alto e o nível baixo do ph. Considerando a Figura 04, podemos obter: Figura ph A Figura ph A y y ph y y ph ph ph a ab 2 (1) b 2 161,00 302,00 141,00 A passagem do ph do nível (-1) para (+1), levou uma diminuição de 141,00 U/mL na média da atividade enzimática.

43 a.1.1) Delineamento Fatorial 2 K com repetições (Cálculo dos Efeitos Principais dos Fatores e da Interação sobre as Respostas) - De modo análogo, para o efeito principal da temperatura (fator B): Figura Temp. Bˆ y T y T b ab 2 (1) a 2 Figura Temp. Bˆ y y 327,00 136,00 191,00 T T A passagem da Temp. do nível (-1) para (+1), levou uma acréscimo de 190,00 U/mL na média da atividade enzimática.

44 a.1.1) Delineamento Fatorial 2 K com repetições (Cálculo dos Efeitos Principais dos Fatores e da Interação sobre as Respostas) - Neste modelo simples, temos apenas uma interação de primeira ordem, isto é, uma interação entre os níveis de dois fatores. A estimativa do efeito da interação pode ser obtida através da Figura 04 como a diferença entre as médias determinadas pelas diagonais principal e secundária. Figura ab 1 a b 1 a b ab ph x Temp. AB Figura ˆ ph x Temp. AB 2 13 Efeito de Interação entre os fatores ph e Temperatura.

45 a.1.2) Ajuste do Modelo O modelo linear em relação aos parâmetros estudados é dado pela equação: y x x x. x ijr j 2 2 j 12 1 j 2 j Onde: x 1 e x 2 são as variáveis independentes.

46 a.1.2) Ajuste do Modelo Os parâmetros 0, 1, 2 e 12 do modelo de regressão, que serão estimados através do método dos mínimos quadrados. Para fins práticos, a estimativas de 0 é a média geral das respostas: y 231,50 As estimativas dos demais parâmetros são iguais às metades das estimativas dos efeitos correspondentes: A 141, , Assim, o modelo ajustado é: B ,50 y ijr,50 70,50pH 95,5Temp 2 2 AB , ,50pH * Temp.

47 a.1.3) Análise de Variância (Contrastes e Soma dos Quadrados) As somas dos quadrados podem ser obtidas elevando-se ao quadrado a estimativa do contraste e, dividindo-se o resultado pelo produto entre a soma de quadrados dos coeficientes do contraste e o número de repetições (Tabela 03). Tabela 03: Atividades Enzimáticas (U/mL), Contrastes Totais (Considerando Repetições) Contrastes Totais Valor dos Contrastes Soma dos Quadrados do Coeficiente A a ab (1) b B b ab (1) a AB ab (1) a b

48 a.1.4) Análise de Variância (ANOVA) Assim, com base na Tabela 03, calcula-se diretamente: SQ(A) SQ(pH) 2 A 846 4r SQ(B) SQ(Temp) 2 B r SQ(AB) SQ(pH x Temp.) 4* 3 4* 3 2 AB 78 4r , , 00 4* , 00 A Soma Quadrática (SQ) Total Corrigida e a SQ Resíduo são calculadas conforme segue: SQT c y ijr 2 ijr SQ Re s SQT ny c 2 SQ ,00 12*(231,50) A SQB SQAB 2736, ,00

49 a.1.4) Delineamento Fatorial 2 K com repetições (Análise de Variância - ANOVA) Anexo 2 A Tabela 04 apresenta a análise de variância (ANOVA) calculados anteriormente. Tabela 04: ANOVA - Atividades Enzimáticas (U/mL) Fonte de Variação Soma dos Quadrados (SQ) Graus de Liberdade Média dos Quadrados (MQ) F cal Hipóteses ph (A) 59643, ,00 174,39 H 0 : 1 =0 (rejeitada) Temp. (B) , ,00 320,01 H 0 : 2 =0 (rejeitada) ph x Temp. (AB) F tab (1,8 ; 95%)= 5,32 507, ,00 1,48 H 0 : 12 =0 (aceita) Resíduo 2736,00 (n-p) 8 342,00 R 2 =98,41% Total ,00 (n-1) 11 - n: nº. total de ensaios; p: nº. de parâmetros do modelo 2 Variação Explicada pelo Modelo R % 100* , 41% Variação Total

50 a.1.4) Análise de Variância (Interpretação) Observa-se pela Tabela 04 que o efeito de interação ph x temperatura não foi significativo (F tab < F cal ) e que os efeitos principais de ph e da temperatura foram altamente significativos. Em outras palavras, se aceita a hipótese H 0 : 12 =0 (aceita). Se, e apenas se, o efeito de interação não for significativo poderemos interpretar isoladamente cada efeito principal.

51 a.1.5) Delineamento Fatorial 2 K com repetições (Estimativas das Variâncias e Erro Padrão Efeitos) A estimativa das variâncias para as variáveis codificadas é dada pela equação abaixo: QM Re s 342 Var( Aˆ) Var ph ph r 3 y y 114, 00 Assim, uma estimativa do erro padrão da estimativa do fator A (ph), é dado por: ep Aˆ 114,00 10, 68

52 a.1.5) Delineamento Fatorial 2 K com repetições (Estimativas das Variâncias e Erro Padrão Efeitos) De modo análogo podem ser obtidas as estimativas dos erros padrões das estimativas de B (temperatura) e de AB (interação), conforme valores apresentados na Tabela 05. Para a constante (média), temos: Var ( y) ep QM Re s n y 28,50 5, , ,50

53 a.1.6) Delineamento Fatorial 2 K com repetições (t calculado e Intervalo de Confiança Efeitos) Os valores de t calc são obtidos pela equação abaixo: t calc ep Então, para a média, o ph, a temperatura e a interação temos, respectivamente: t calc y ep y 231,50 5,34 43,36; t calc A ep A -141,00 10,68-13,21 t calc B ep 191,00 10,68 17,89 ; t AB calc B epab -13,00 10,68-1,22

54 a.1.6) Delineamento Fatorial 2 K com repetições (t calculado e Intervalo de Confiança Efeitos) Para a estimativa do intervalo de confiança, aplica-se a equação abaixo: t tab (8 g.l. ; 95%)= 2,31 Anexo 1 IC θ t ep θ ICy95 % 23150, 2, 31. 5, , 12, 33 ph 95 % 14100, 2, , , 24, 67 ICTemp. 95 % 19100, 2, , , 24, 67 phxtemp. 13, 00 2, , 68 13, 00 24, 67 IC 95% IC θ 95% 8; 95%

55 a.1.6) t calculado e Intervalo de Confiança Estimativa dos Efeitos A Tabela 05 apresenta o erro padrão, t calc e os limites de confiança dos efeitos de cada fator calculados anteriormente. Tabela 05: Erro padrão e limites de confiança dos Efeitos Fatores Efeitos Erro Padrão t calc Limite Inferior (95%) Limite Superior (95%) Média 231,50 5,34 43,36 219,19 243,81 ph -141,00 10,68-13,21-165,62-116,38 Temperatura 191,00 10,68 17,89 166,38 215,62 ph x Temp. -13,00 10,68-1,22-37,62 11,62 t tab (8 g.l. ; 95%)= 2,31

56 a.1.7) Delineamento Fatorial 2 K com repetições - Diagrama de Pareto Pelos dados da tabela 05 pode-se notar que o único valor de t calc que pertence à região de aceitação de H 0 é aquele relativo à interação. Tais resultados podem ser descritos no Diagrama de Pareto. Os valores absolutos de t calc, também denominados efeitos padronizados, fornecem as alturas das barras que por sua vez são dispostas de modo decrescente. O valor de t tab (2,31) completa o diagrama fornecendo o valor a partir do qual os efeitos são significativos, como pode ser visto na Figura 04.

57 a.1.7) Delineamento Fatorial 2 K com repetições - Diagrama de Pareto Pareto Chart of Standardized Effects; Variable: Atividade Enzimática (U/mL) 2**(2-0) design; MS Pure Error=342, DV: Atividade Enzimática (U/mL) (2)Temp. (ºC) 17,88879 (1)pH -13,2059 1by2-1,21756 p=,05 Standardized Effect Estimate (Absolute Value) Figura 04: Diagrama de Pareto

58 a.1.8) Delineamento Fatorial 2 K com repetições (Valores preditos pelo modelo) Observed vs. Predicted Values 2**(2-0) design; MS Pure Error=342, DV: Atividade Enzimática (U/mL) Predicted Values Observed Values Figura 05: Valores Preditos versus Observados

59 a.1.9) Delineamento Fatorial 2 K com repetições - Superfície de Respostas e Curvas de Contorno A descrição gráfica do modelo ajustado anteriormente é conhecida como superfície de repostas (Figura 06), bem como a projeção de seus cortes sobre o plano dos fatores gerando as curvas de contorno (Figura 07), é muito útil na interpretação dos resultados e na otimização do processo em questão.

60 Experimentos Fatoriais a.1.9) Delineamento Fatorial 2 K com repetições - Superfície de Respostas e Curvas de Contorno Fitted Surface; Variable: Atividade Enzimática (U/mL) 2**(2-0) design; MS Pure Error=342, DV: Atividade Enzimática (U/mL) 500 Atividade Enzimática (U/mL) Temp. (ºC) ,5 Figura 06: Superfície de Resposta 3,0 3,5 4,5 4,0 5,0 5,5 6,0 ph 7,0 6,5 7,5 > 400 < 340 < 240 < 140 < 40 z=128;375-27;125*x+5;5875*y-;1625*x*y+0;

61 Experimentos Fatoriais a.1.9) Delineamento Fatorial 2 K com repetições - Superfície de Respostas e Curvas de Contorno Temp. (ºC) Fitted Surface; Variable: Atividade Enzimática (U/mL) 2**(2-0) design; MS Pure Error=342, DV: Atividade Enzimática (U/mL) > 400 < 390 < 340 < 290 < 240 < 190 < 140 < 90 z=128;375-27;125*x+5;5875*y-;1625*x*y+0; < ,5 3,0 3,5 4,0 4,5 5,0 5,5 6,0 6,5 7,0 7,5 ph Figura 07: Curvas de Contorno

62 a.1.9) Delineamento Fatorial 2 K com repetições - Superfície de Respostas e Curvas de Contorno Pelas Figuras 06 e 07 observa-se que nos intervalos estudados, as maiores atividades enzimáticas ocorreram para níveis baixos de ph e altos níveis de temperatura. Condições Otimizadas: ph: 2,5 ~4,5 Temp.: 50 ~ 75ºC

63 a.2) Delineamento Fatorial 2 K sem repetições: Para apresentar os conceitos que serão expostos neste item, estaremos supondo que no exemplo anterior o pesquisador tenha feito o experimento apenas uma única vez, ou registrado apenas as médias das observações. Neste contexto temos apenas quatro respostas conforme apresentado na Tabela 06. Tabela 06: Atividades Enzimáticas (U/mL), segundo o ph e a temperatura Ensaios ph (A) Fatores Temp. (B) Tratamentos Ativ. Enzimática Média (Totais) 1 3 (-1) 30 (-1) (+1) 30 (-1) a (-1) 70 (+1) b (+1) 70 (+1) ab 250

64 a.2.1) Delineamento Fatorial 2 K sem repetições (Efeitos e Coeficientes): É fácil verificar, utilizando os conceitos empregados no item a.1, que as estimativas dos efeitos e os coeficientes do modelo são idênticas àquelas já obtidas considerando as repetições (triplicata), como pode ser visto na Tabela 07. Tabela 07: Atividades Enzimáticas (U/mL), Efeitos e Coeficientes (Sem Repetições) Fatores Efeitos Coeficientes do Modelo Média (Constante) 231,50 231,50 ph -141,00-70,50 Temperatura 191,00 95,50 ph x Temp. -13,00-6,50

65 a.2.2) Delineamento Fatorial 2 K sem repetições (Contrastes e Soma dos Quadrados): O valor dos contrastes e a soma dos quadrados são apresentados na Tabela 08. Tabela 08: Atividades Enzimáticas (U/mL), Contrastes Totais (sem repetições) Contrastes Totais Valor dos Contrastes Soma dos Quadrados do Coeficiente A a ab (1) b B b ab (1) a AB ab (1) a b

66 a.2.3) Delineamento Fatorial 2 K sem repetições (ANOVA): Assim, com base na Tabela 08, calcula-se diretamente: SQ(A) SQ(pH) 2 A 282 4r SQ(B) SQ(Temp) 2 B 382 4r SQ(AB) SQ(pH x Temp.) 4* 1 4* 1 2 AB 26 4r * A Soma Quadrática (SQ) Total Corrigida e a SQ Resíduo são calculadas conforme segue: SQT c ijr SQ Re s y 2 ijr SQT ny c 2 SQ *(231,50) A SQB SQAB zero 2

67 a.2.3) Delineamento Fatorial 2 K sem repetições (ANOVA): A Tabela 09 apresenta a análise de variância (ANOVA), sem considerar as repetições. Tabela 09: Tabela ANOVA - Atividades Enzimáticas (U/mL) sem repetições Fonte de Variação Soma dos Quadrados (SQ) Graus de Liberdade Média dos Quadrados (MQ) F cal Hipóteses ph (A) 19881, , Temp. (B) 36481, , Ph x Temp. (AB) 169, , Resíduo 0 (n-p) 0 0 R 2 =100,00% Total 56531,00 (n-1) 3 - n: nº. total de ensaios; p: nº. de parâmetros do modelo 2 Variação Explicada pelo Modelo R % 100* , 00% Variação Total 56531

68 a.2.3) Delineamento Fatorial 2 K sem repetições (ANOVA): A partir dos dados da Tabela 09 podemos observar que não temos graus de liberdades para o resíduo, indicando é impossível efetuar qualquer inferência sobre as repostas, evidenciando que apenas a estatística descritiva é permitido em tal situação. Em outras palavras, se não há resíduo então não há erro padrão e, portanto, não é possível construir estimativas por intervalos, testes de hipótese (t e F) ou obter previsões. Assim sendo, mesmo que possamos apresentar o modelo com os coeficientes da Tabela 07 e construir as superfícies de respostas e as curvas de contorno, mas não há qualquer valor científico nisso, além da descrição da amostra.

69 a.2.4) Delineamento Fatorial 2 K sem repetições (Diagrama de Pareto) Pareto Chart of Effects; Variable: Atividade Enzimática (U/mL) 2**(2-0) design DV: Atividade Enzimática (U/mL) (2)Temp. (ºC) 191, (1)pH -141, 1by2-13, Effect Estimate (Absolute Value) Figura 08: Diagrama de Pareto

70 a.3) Delineamento Fatorial 2 K com adição de ponto central: Para tornar possível o uso, ao menos aproximada, da inferência estatística, é usual serem feitos alguns ensaios no ponto central do espaço experimental. Com tal procedimento estaremos viabilizando o cálculo dos resíduos, e consequentemente do erro padrão e das estimativas por intervalo, viabilizando assim os testes de hipóteses (t e F). Suponhamos que no exemplo anterior sejam feitos três ensaios no ponto central, conforme indicado na Tabela 10.

71 a.3) Delineamento Fatorial 2 K com adição de ponto central: Tabela 10: DOE - Adição de Ensaios no Ponto Central Fatores Ensaios ph (A) Temp. (B) Tratamentos Atividade Enzimática (U/mL) 1 3 (-1) 30 (-1) (+1) 30 (-1) a (-1) 70 (+1) b (+1) 70 (+1) ab (C) 5 (0) 50 (0) (C) 5 (0) 50 (0) (C) 5 (0) 50 (0) Média 196,57

72 a.3.1) Delineamento Fatorial 2 K com adição de ponto central (Ajuste do Modelo): Observa-se que agora, torna-se possível estimar algum resíduo, embora de modo rudimentar, pois temos apenas 3 repetições adicionais. Para estimar os resíduos são mantidos os coeficientes de regressão obtido anteriormente no item a.1.2, exceto a constante, que é calculada com a nova média geral das atividades enzimáticas (resposta). O modelo é dado pela equação abaixo: Atividade 196,57 70,50pH 95,5Temp 6,5 ph * Temp.

73 a.3.2) Delineamento Fatorial 2 K (ANOVA): com adição de ponto central A Soma Quadrática (SQ) Total Corrigida e a SQ Resíduo são calculadas conforme visto anteriormente: SQT c ijr y 2 ijr ny * 196, , 71 SQ Re s SQ Re s SQT c SQ A SQB SQAB 68117, , , , , 71

74 a.3.2) Delineamento Fatorial 2 K com adição de ponto central (ANOVA - SS Residual): Tabela 11: ANOVA - Atividades Enzimáticas (U/mL) Ponto Central Fonte de Variação Soma dos Quadrados (SQ) Graus de Liberdade Média dos Quadrados (MQ) F cal Hipóteses ph (A) 19881, ,00 5,14 H 0 : 1 =0 (aceita) Temp. (B) 36481, ,00 9,45 H 0 : 2 =0 (aceita) ph x Temp. (AB) F tab (1,3 ; 95%)= 10,13 169, ,00 0,04 H 0 : 12 =0 (aceita) Resíduo 11586,71 (n-p) ,24 R 2 =82,99% Total 68117,71 (n-1) 6 - n: nº. total de ensaios; p: nº. de parâmetros do modelo 2 Variação Explicada pelo Modelo R % 100* , 99% Variação Total 68117,71 Anexo 2

75 a.3.3) Delineamento Fatorial 2 K com adição de ponto central (Erros): Os erros padrões, para a constante e para os demais efeitos são calculados de modo análogo aos já obtidos anteriormente. Para a constante, temos: QM Re s 3862,24 ep( y) n 7 23,49 Para os demais efeitos, temos: QM Re s 3862,24 ep( A) ep( B) ep( AB) r 1 62,15

76 a.3.3) Delineamento Fatorial 2 K com adição de ponto central (Erros): A Tabela 12 apresenta o erro padrão, t calc e os limites de confiança dos efeitos de cada fator calculados anteriormente. Tabela 12: Erro padrão dos Efeitos (delineamento com ponto central) Fatores Efeitos Erro Padrão tcalc Média 196,57 23,49 8,37* ph -141,00 62,15-2,27 Temperatura 191,00 62,15 3,07 ph x Temp. -13,00 62,15-0,21 t tab (3 g.l. ; 95%)= 3,18 Anexo 1 * Significativo ao nível de 95%

77 a.3.4) Delineamento Fatorial 2 K com adição de ponto central (Gráfico de Pareto): Pareto Chart of Standardized Effects; Variable: Atividade Enzimática (U/mL) 2**(2-0) design; MS Residual=3862,238 DV: Atividade Enzimática (U/mL) (2)Temp. (ºC) 3, (1)pH -2, by2 -, p=,05 Standardized Effect Estimate (Absolute Value) Figura 09: Gráfico de Pareto (SS Residual)

78 a.3.2) Delineamento Fatorial 2 K com adição de ponto central (ANOVA Erro Puro): Tabela 13: ANOVA - Atividades Enzimáticas (U/mL) - Ponto Central Fonte de Variação F 0,95; 1; 2 = 18,51 Soma dos Quadrados (SQ) Anexo 2 Graus de Liberdade Média dos Quadrados (MQ) ph (A) 19881, ,00 198,81 Temp. (B) 36481, ,00 364,81 ph x Temp. (AB) 169, ,00 1,69 Falta de Ajuste 11386,71 (m-p) ,71 113,87 Erro Puro 200,00 (n-m) 2 100,00 Total 68117,71 (n-1) 6 F cal R 2 =82,99% nº. total de ensaios (n=7); nº. de parâmetros do modelo (p=4); nº de níveis distintos (m=5)

79 a.3.4) Delineamento Fatorial 2 K com adição de ponto central (Gráfico de Pareto): Pareto Chart of Standardized Effects; Variable: Atividade Enzimática (U/mL) 2**(2-0) design; MS Pure Error=100, DV: Atividade Enzimática (U/mL) (2)Temp. (ºC) 19,1 (1)pH -14,1 1by2-1,3 p=,05 Standardized Effect Estimate (Absolute Value) Figura 10: Gráfico de Pareto (Erro Puro)

80 DELINEAMENTO COMPOSTO CENTRAL ROTACIONAL Central Composite Design

81 Planejamento Composto Central (Central Composite Design): Um Delineamento Composto Central que tem pontos axiais definidos é denominado de Delineamento Composto Central Rotacional (DCCR). O Planejamento composto central (Central Composite Design) deve ser utilizado quando se quiser verificar a curvatura de um plano; ou seja; quando se quiser verificar a existência de termos quadráticos no modelo de regressão. De modo geral este tipo de planejamento consiste de uma parte referente ao planejamento fatorial com 2 K ensaios fatorias + 2K ensaios em pontos axiais ou estrelas (n s ) + um número arbitrário de repetições no ponto central (n c ).Onde: K nº. de fatores

82 Planejamento Composto Central (Central Composite Design) A rotabilidade () depende do nº. de pontos na porção fatorial do planejamento, e é dado pela equação abaixo: 1 2 K 4 Tabela 14: Valor de em função do nº. de fatores Nº. da Fatores (k) Porção Fatorial /4 = 1, /4 = 1, /4 = 2, /4 = 2,378

83 Planejamento Composto Central (Central Composite Design): A Figura 10 apresenta os pontos do planejamento composto central para o caso de 2 fatores (variáveis independentes). Figura 11: Pontos experimentais para o planejamento composto central

84 Planejamento Composto Central Rotacional ESTUDO DE CASO 1 (Atividade Enzimática) Ensaios ph Temperatura (ºC) Atividade Enzimática (U/mL) 1-1,00 (3,6) -1,00 (36) ,00 (3,6) 1,00 (64) ,00 (6,4) -1,00 (36) ,00 (6,4) 1,00 (64) ,41 (3,0) 0,00 (50) ,41 (7,0) 0,00 (50) ,00 (5,0) -1,41 (30) ,00 (5,0) 1,41 (70) (C) 0,00 (5,0) 0,00 (50) (C) 0,00 (5,0) 0,00 (50) (C) 0,00 (5,0) 0,00 (50) (C) 0,00 (5,0) 0,00 (50) 371

85 Planejamento Composto Central Rotacional: Ajuste do Modelo O modelo quadrático que correlaciona os parâmetros estudados é dado pela equação: Atividade ,72 ph 90,44 ph 2 49,40T 86,19T 2 63pH * T

86 Planejamento Composto Central Rotacional: ANOVA Tabela 15: Tabela ANOVA - Atividades Enzimáticas (U/mL) DCCR Fonte de Variação Soma dos Quadrados (SQ) F 0,95; 5; 6 = 4,4 e F 0,95; 3; 3 = 9,28 Graus de Liberdade Média dos Quadrados (MQ) Regressão ,5 (p-1) ,70 25,29 Resíduo 11820,8 (n-p) ,13 Falta de Ajuste 10966,8 (m-p) ,60 129,06 Erro Puro 854 (n-m) 3 284,67 Total ,3 (n-1) 11 Anexo 2 F cal R 2 =95,47% nº. total de ensaios (n=12); nº. de parâmetros do modelo (p=6); nº de níveis distintos (m=9)

87 Planejamento Composto Central (Central Composite Design) Pareto Chart of Standardized Effects; Variable: Atividade Enzimática (U/mL) 2 factors, 1 Blocks, 12 Runs; MS Residual=1970,132 DV: Atividade Enzimática (U/mL) (1)pH(L) -8,13854 ph(q) -5,15455 Temperatura (ºC)(Q) -4,91232 (2)Temperatura (ºC)(L) 3, Lby2L -2,83872 p=,05 Standardized Effect Estimate (Absolute Value) Figura 12: Gráfico de Pareto (Central Composite Design)

88 Planejamento Composto Central (Central Composite Design) 500 Observed vs. Predicted Values 2 factors, 1 Blocks, 12 Runs; MS Residual=1970,132 DV: Atividade Enzimática (U/mL) Predicted Values Observed Values Figura 13: Valores Preditos versus Observados

89 Planejamento Composto Central (Central Composite Design) Fitted Surface; Variable: Atividade Enzimática (U/mL) 2 factors, 1 Blocks, 12 Runs; MS Residual=1970,132 DV: Atividade Enzimática (U/mL) Atividade Enzimática (U 0 /ml) Temperatura (ºC) ,5 3,0 > 400 < 300 < 100 < -100 < -300 < -500 Figura 14: Superfície de Resposta (Central Composite Design) 3,5 4,0 5,0 4,5 5,5 6,5 6,0 ph 7,0 7,5

90 Planejamento Composto Central (Central Composite Design) 75 Fitted Surface; Variable: Atividade Enzimática (U/mL) 2 factors, 1 Blocks, 12 Runs; MS Residual=1970,132 DV: Atividade Enzimática (U/mL) Temperatura (ºC) ,5 3,0 3,5 4,0 4,5 5,0 5,5 6,0 6,5 7,0 7,5 ph > 400 < 300 < 100 < -100 < -300 < -500 Figura 15: Curvas de Contorno (Central Composite Design)

91 REFERÊNCIAS: BARROS NETO, B.; SCARMINIO, I. S.; BRUNS, R. E. Planejamento e Otimização de Experimentos. Campinas: Editora da UNICAMP, MONTGOMERY, D. C. Introdução ao Controle Estatístico da Qualidade, 4º edição, Rio de Janeiro: Editora LTC, Rodrigues, M. Isabel e Iemma, A. Francisco. Planejamento de Experimentos e Otimização de Processos, Campinas: Editora Casa do Pão, 2ª. edição, 2009.

92 ANEXO 1 (Tabela t Student) Slide 11 Slide 54 Slide 78

93 ANEXO 2 (Tabela F de Fisher - 95% confiança) Slide 49 Slide 74 Slide 78 Slide 86