ESTUDO DOS FATORES FÍSICO-QUÍMICOS QUE INFLUENCIAM NA DIGESTÃO DO COLAGENO PRESENTE EM SEROSA BOVINA. Freitas, E. C.; Moreira, J. C.; Beltrame Jr, M.

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1 ESTUDO DOS FATORES FÍSICO-QUÍMICOS QUE INFLUENCIAM NA DIGESTÃO DO COLAGENO PRESENTE EM SEROSA BOVINA. Freitas, E. C.; Moreira, J. C.; Beltrame Jr, M. Faculdade de Ciências da Saúde, Curso de Farmácia - Universidade do Vale do Paraíba Avenida Shishima Hifumi, 2911 Urbanova - São Jose dos Campos SP CEP: elisangela_freitas@yahoo.com.br; beltrame@univap.br; julio@univap.br Resumo O fio de categute, derivado do intestino bovino, é usado, há décadas, com sucesso no ligamento de vasos sanguíneos e aproximação de tecidos. Durante o processo de fabricação da sutura de categute, são necessários banhos de purificação que consistem num procedimento manual, sob temperatura controlada. Nesse processo, as fitas de categute são imersas em banho químico e/ou enzimático, os quais removem as impurezas do colágeno que incluem gorduras, açúcares e também proteínas não colagenosas, presentes na matéria prima. Após esta operação, amostras do produto são coletadas e enviadas para teste em laboratório químico com a finalidade de verificar a efetividade da purificação. Atualmente, a análise de determinação das impurezas não colagenosas, presentes na serosa bovina, leva aproximadamente 150 minutos para ser concluída. A proposta deste trabalho de pesquisa é avaliar o desempenho da serosa com a metodologia de qualificação alterada, comparando-a com o método atualmente usado. A partir dessa comparação, busca-se verificar se os fatores para realização do teste podem ser interpretados como de grande impacto na determinação das impurezas presente na serosa bovina. Palavras-chave: Sutura categute, purificação, digestão, controle de qualidade. Área do Conhecimento: Farmácia. Introdução Os fios de sutura cirúrgica foram conceituados como materiais utilizados para selar vasos sangüíneos e aproximar tecidos, em ações de ligar e suturar. Eles surgiram e foram desenvolvidos ao longo dos séculos em função da necessidade de controlar hemorragias e também de favorecer a cicatrização de ferimentos ou incisões por primeira intenção (GOFFI, 1996). Desde a antiguidade, um grande número de materiais de sutura foi testado e utilizado, tais como: fibras vegetais, tendões, intestinos de vários animais, crina de cavalo, filamentos de ouro, dentre outros. Uma das menções mais antigas ao ato de suturar está registrada no papiro egípcio de Edwin Smith, que data de a.c. O conceito de ligadura e sutura está também registrado nos escritos de Hipócrates e Galeno. Atribui-se ao médico árabe Rhazes a introdução da palavra kitgut, em 900 d.c., para designar fios confeccionados com tiras do intestino de animais herbívoros, utilizados como cordas de instrumentos musicais (de kit, pequeno violino + gut, intestino), denominação esta posteriormente alterada para catgut largamente aplicados como sutura (MAKENZIE, 1973). Categute é, portanto, a forma aportuguesada do inglês catgut, estando já incorporada ao léxico do nosso idioma, do qual consta no vocabulário ortográfico da Academia Brasileira de Letras e de quase todos os dicionários contemporâneos (OXFORD, 1978). Coube a Lister, em 1869, iniciar a fase moderna do uso do categute em cirurgia. Como pioneiro da antissepsia e partidário das idéias de Pasteur, obteve a esterilização do categute com ácido carbólico e foi o primeiro a cortar o fio rente ao nó, fechando a ferida cirúrgica sem que ocorresse supuração (SKINNER, 1961). O categute é constituído, principalmente, por colágeno, que é composto de material monofilamentoso, proveniente de submucosa do intestino do carneiro ou, então, da serosa do intestino do boi (TURNER, 2002). Atualmente, o categute é produzido com alto padrão de qualidade e existe uma grande variedade de produtos acabados, de acordo com a aplicação desejada, envolvendo fios de diversos diâmetros e comprimentos, cromados ou não. O fio simples perde sua resistência tão rapidamente que sua aplicação em determinadas regiões pode ser contraindicada (TURNER, 2002). O fio cromado é resultado da sua exposição em sais básicos de cromo. Esse processo incrementa os vínculos intermoleculares acarretando uma maior resistência, reação diminuída nos tecidos e absorção mais lenta (TURNER, 2002). A reação do paciente é altamente variável, mas de uma forma geral, o categute simples perderá sua resistência dentro de 3 a 7 dias. O categute é gradualmente digerido por proteases ácidas provenientes de células inflamatórias, podendo ser aplicado em circunstâncias onde a sutura é 1

2 necessária somente por uma ou duas semanas e absorção é desejada. (TURNER, 2002). Por ser um produto de origem animal, o categute é muito vulnerável ao aparecimento de impurezas. Portanto, durante a manufatura do fio de categute, são necessários banhos de purificação, onde as fitas de serosa são imersas em banhos químicos e/ou enzimáticos, os quais removem as impurezas que incluem gorduras, açúcares e também proteínas não colagenosas. Este procedimento é totalmente manual, levando de três a quatro horas cada banho. As serosas, provenientes do fornecedor importado, passam por dois banhos e as recebidas do fornecedor nacional, por três banhos (GERTZMAN, 1993). Para verificar a efetividade da operação, as amostras são coletadas e enviadas para a realização do teste físico químico de determinação do teor de impurezas, presente na serosa bovina no laboratório químico. Durante o período de realização do teste, as fitas de serosa ficam imersas em caçambas com água e as etapas seguintes permanecem paralisadas, até a conclusão do mesmo (GERTZMAN, 1993). A identificação dos fatores que influenciam neste teste gera um melhor conhecimento e realização do mesmo, a fim de se obter sua otimização. O presente trabalho teve por objetivo determinar a influência dos fatores: tempo de digestão da serosa, quantidade de fases do teste, volume de ácido tricloroacético, tempo de centrifugação das amostras e volume de álcool etílico, utilizados na análise de determinação de impurezas não colagenosas presente na serosa bovina. E através do conhecimento do grau de importância desses fatores para a análise, sugerir melhoria a fim de reduzir o tempo de análise. Metodologia Foram coletadas amostras de matéria-prima purificada de lotes produzidos com serosa 8, 16 e 19 mm, todas provenientes do fornecedor de serosa importada, em quantidade suficiente para obter-se, após seca, no mínimo 2,0 g de amostras. As amostras foram enroladas no suporte de inox e colocadas na estufa em temperatura rigorosamente controlada na faixa de 140º à 150ºC, durante o período de aproximadamente duas horas. Após, verificação visual que as serosas do fio de categute estavam totalmente secas, foram retiradas dos suportes e resfriadas à temperatura ambiente. Para ter uma melhor digestão das amostras, foi necessário cortá-las em pequenos pedaços. Em seguida, pesou-se analiticamente os tubos de inox numerados, a fim de se obter o peso inicial (PI), usado posteriormente nos cálculos de rendimento da pureza. Nestes tubos pesou-se 2,0 g de cada produto registrando o peso da amostra (PA). Com a adição tricloroacético nas amostras e a incubação destas no banho-maria à 95ºC (± 5ºC), iniciou-se a fase de digestão. Este procedimento é repetido por mais uma vez, após a centrifugação à 3000 rpm para decantação das amostras nos tubos e retirada do líquido sobrenadante. Os parâmetros do tempo de digestão, a quantidade de fases e o volume de ácido usado na análise estão descritos na Tabela 1. Tabela 1- atual do método de teste e condições propostas. Teste Tempo de digestão (minutos) Quantidade de fases Volume de ácido (TCA) (*) (*) (*) de análise usada no método atual. Ao finalizar as duas fases de digestão da amostra, procederam-se as fases de lavagem com álcool etílico e posterior centrifugação dos tubos à 3000 rpm, durante um menor período de tempo. A lavagem com o álcool etílico teve por objetivo a desitratação da amostra para melhor secagem desta. Esta etapa da análise também é realizada por duas vezes. Para os tempos de centrifugação das amostras e do volume de álcool etílico, foi proposta uma análise do material com 6 amostras testadas, conforme método atual, tabela 2, e também 6 amostras testadas nas condições definidas na tabela 3. 2

3 Tabela 2- Condições normais do tempo de centrifugação nas fases e fases e volume de álcoo etílico. Fase Tabela 3- Condições propostas do tempo de centrifugação nas fases e fases e volume de álcoo etílico. Fase Tempo de Centrifugação (minutos) Após o término das fases de digestão e da lavagem das amostras, seguiu-se a secagem dos tubos de inox em estufa no máximo 150º C por no mínimo uma hora, até verificação visual que as amostras estavam completamente secas. As amostras foram retiradas da estufa e resfriadas em dessecador à temperatura ambiente. Então, pesaram-se os tubos numerados e registrou-se o peso final (PF). O cálculo para determinação do teor de impurezas não colagenosas foi realizado, de acordo com a seguinte equação: PF PI % TCA = 100 PA PF = peso final (tubo + resíduo) PI = peso inicial do tubo vazio PA = Peso da amostra Volume de álcool (ml) Tempo de Centrifugação (minutos) Volume de álcool (ml) Nos testes de adaptação da metodologia nas condições propostas, foram usadas vinte amostras da matéria prima de 19 mm e os fatores foram analisados, através da ferramenta estatística de planejamento de experimentos DOE (Design of Experiments), na qual foi possível verificar a influência de cada fator, bem como a interação entre os mesmos nos resultados dos testes. Após a escolha da melhor condição de análise para a efetivação do método, usaram-se doze amostras das serosas de receitas 8, 16 e 19 mm, sendo três amostras de cada largura de serosa. Os resultados, obtidos nos experimentos, foram comparados com os resultados do teste de liberação normal do processo, através da ferramenta estatística de comparação entre médias (teste t-student). Resultados Conforme mostrado na Figura 1, a quantidade de fases de digestão, o tempo de digestão e o volume de ácido são em ordem decrescente os fatores que mais influenciam na análise de determinação de impurezas nas serosas bovinas. A obtenção dessa conclusão foi possível através do estudo de DOE, que estabelece de maneira planejada quais e quantos experimentos devem ser realizados na possível coleta de dados. Fatores B A AB C BC AC ABC 0 2, Efeito Padronizado 8 10 Factor Name A T. Digestão B Fases C Volume Acido Figura 1- Padrão de Efeitos - Análise de DOE (A) Tempo de digestão (B) Fases de digestão (C) Volume de Ácido Como podem ser observados na Tabela 4, os valores mais altos do teor de impureza presente na serosa foram apresentados nos experimentos 6 e 14, os quais os parâmetros tempo de digestão da serosa, quantidade de fases do teste e volume 3

4 de ácido tricloroacético utilizados foram os mínimos propostos (15 minutos de digestão, 1 fase e 25 ml de ácido). Provavelmente, não houve a digestão completa das amostras quando se alteraram esses parâmetros. Tabela 4- Resultado dos testes de TCA Análise DOE. Teste Teor Impurezas (%) 1 1,7 2 0,8 3 3,6 4 3,0 5 2,9 6 6,7 7 (*) 0,9 8 1,0 9 (*) 0,9 10 1,2 11 3,7 12 1,0 13 0,9 14 4,7 15 0,9 16 2,0 (*) de análise usada no método atual. Nos testes que foram realizados com a alteração de apenas uma fase de digestão das amostras (experimentos 1, 3, 4, 5, 11 e 16), os valores obtidos do teor de impurezas também estão elevados e distantes dos resultados do método atual. Isto ocorreu devido ao fator da quantidade de fases ser determinante para a análise e, nestes experimentos, foi proposto este fator no mínimo (1 fase). Melhores resultados comparados ao teste utilizado no processo atual (experimentos 7 e 9) são verificados nos testes 2 e 13. Entretanto, nestes experimentos foi utilizado um volume maior de ácido tricloroacético, o que faz aumentar em 40% de resíduos gerados, por análise. Portanto, estes dois experimentos não são aceitáveis. Os experimentos 10 e 12 foram realizados com todas as condições nos valores máximos (30 minutos de digestão, 2 fases e 35 ml de ácido), e mesmo com resultados sendo próximos dos testes atuais, eles não são viáveis, por ocorrer um aumento no tempo gasto para a realização da análise e na quantidade de resíduo ao final da análise. Os resultados apresentados nos experimentos 8 e 15 são satisfatórios quando comparados aos controles (experimentos 7 e 9). Por este motivo, estes foram os parâmetros escolhidos para serem alterados no processo de determinação das impurezas não colagenosas presentes em serosas bovinas. Para o processo de otimização do tempo na fase, foi empregado o estudo de comparação entre médias, onde verificamos que os valores individuais do teor de impureza nas serosas bovinas são muito próximos quando realizados nas condições normais e na nova proposta, sendo que os resultados, obtidos na nova proposta, foram ainda melhores, ou seja, os valores da porcentagem de impurezas presentes na serosa estão mais uniformes e abaixo dos valores obtidos dos ensaios na condição atual. Conforme mostra Tabela 5. Tabela 5- Resultado dos testes de Comparação entre médias na fase. Na Tabela 6, observou-se que a variação, entre as médias das porcentagens de impurezas nas serosas, é insignificante quando realizada a análise estatística, ou seja, nenhum dos fatores influenciou nos resultados ao nível de confiança de 95% (p-valor é superior a 0,05). O desvio padrão na condição proposta é menor que o apresentado na condição normal. Tabela 6- Teste de Comparação entre médias na fase (p-valor). Item Teste Quantidade de Amostras Normal Proposta 6 6 Média 0,3480 0,2628 Desvio Padrão Teor de Impureza (%) normal 0,1210 0,0204 SE Média 0,0490 0,0083 Valor de T = 1,69 Valor de P = 0,121 proposta 1 0,3047 0, ,3245 0, ,3291 0, ,2795 0, ,2597 0, ,5888 0,2888 4

5 Na Figura 2, é mostrado o resultado. O valor de p é probabilidade de se cometer um erro, com dados da amostra especifica. Este valor é dado pelo pacote estatístico, assim, ao compararmos com o nível de significância de 95%, tomamos a decisão de aceitar a alteração, uma vez que as condições propostas para a fase não interferem no teor de impureza em relação à estatística (valor de p é superior a 0,05). 0,6 Foi sugerida a realização do teste de resistência da serosa bovina, após análise das amostras nas condições propostas, para verificação se os mesmos apresentam valores nos limites especificados para cada largura de serosa. Então, separaram-se vinte fitas de cada largura de serosa para realizar o teste de resistência, em dinamômetro analógico de 10 kg, modelo Os valores do teste de resistência, bem como os limites estabelecidos para cada largura (8, 16 e 19 mm), foram mostrados na Tabela 8. Tabela 8- Resultado dos testes de resistência das serosas de 8, 16 e 19 mm. 0,5 Largura da serosa 8 mm 16 mm 19 mm Data 0,4 Limites Mínimos , ,2 normal proposta Figura 2 Comparação entre médias da fase do álcool. A análise dos dados de comparação para efetivação da metodologia, entre as médias com as serosas de 8, 16 e 19 mm, mostrou que os resultados obtidos nos experimentos não apresentaram grande variação na determinação do teor de impurezas presentes nas serosas. Notou-se que o valor de p é maior que 0,05, indicando indiferença entre as análises realizadas nas condições normais e nas condições propostas, como mostra a Tabela 7. Tabela 7- Resultado dos testes de Comparação entre médias com serosas de 8, 16 e 19 mm. Resultados Largura da serosa 8 mm normal proposta 0,3196 0,7168 0,5498 0,6720 0,5630 0,6694 0,8286 0,7459 p-valor 0, mm 0,9846 0,6055 0,6222 0,5991 0,296 Discussão 19 mm 0,9326 0,7492 0,9587 0,7231 0,8058 0,8649 0,159 O planejamento experimental é uma ferramenta essencial e, quando é realizado adequadamente, permite, além do aprimoramento de processos, a redução da variabilidade de resultados, a redução 5

6 de tempos de análise e dos custos envolvidos (BUTTON, 2005). O tempo de digestão e as fases foram os únicos fatores que apresentaram interação, pois observamos que, nos experimentos onde foram sugeridos estes fatores no mínimo (15 minutos e uma fase), ocorreram os maiores valores de teor de impurezas. Portanto, a melhoria apresentada na fase de digestão da amostra é apenas no tempo de digestão em banho-maria, alterando de 30 minutos em cada fase para 15 minutos. Após a análise das amostras, verificou-se que, quanto menor o volume de ácido, maior a saturação da solução na primeira fase de digestão. Portanto, para a melhoria da metodologia, não houve alteração no volume de ácido e na quantidade de fases, que permanecem os mesmos do método atual. As amostras, avaliadas nos testes da fase do álcool na nova proposta, foram consideradas dentro dos limites especificados do padrão de qualidade aceitável. Não foi identificada variação significativa do teor de impureza em função das alterações sugeridas. Nestas condições, foi sugerido que a análise seja realizada em uma fase com a adição de 20 ml de álcool etílico e 15 minutos de centrifugação. Definidas as melhores condições para as fases de digestão, lavagem e centrifugação, verificou-se que o objetivo foi plenamente atingido, pois de um total de 2,5 horas (150 minutos) gastas para realização destas etapas, houve uma redução de, aproximadamente, 47% no tempo (70 minutos). Outro benefício obtido com a proposta de alteração do método é a redução da quantidade de resíduo inflamável gerado na análise, que passará para 20 ml por análise, redução de 60% de resíduo por análise. São efetuadas em média 154 análises no mês, o que gera uma quantidade de resíduo de álcool etílico de 7,7 litros. Com o novo método a quantidade de resíduo gerada será, aproximadamente, 3,1 litros. Conforme se podem verificar os valores de resistência da serosa na Tabela 8, estão dentro dos limites especificados para cada largura, o que comprova que a alteração dos fatores da análise de determinação do teor de impurezas não influencia na resistência da mesma. importância, tiveram uma melhoria, através da redução de 47% no tempo de análise de determinação, das impurezas não colagenosas presente nas serosa bovina. Apesar do objetivo do teste ter sido estabelecido em determinação dos fatores e da redução do tempo da análise, existe também implícito o objetivo de redução, ou, no mínimo, de não alteração da quantidade de resíduo gerado no processo (teste). Neste caso, foi possível a redução de 60% da quantidade de resíduo inflamável gerado na análise. Com base nos resultados apresentados anteriores aos experimentos, verificaram-se que as alterações propostas para o método apresentaram valores satisfatórios e não têm impacto significativo nos resultados dos testes. Sugere-se, então, a alteração do método de teste com os parâmetros propostos. Referências - BUTTON, S.T., Metodologia para planejamento experimental e análise de rersultados. Apostila do Programa de Pós-Graduação em Engenharia Mecânica. Universidade Estadual de Campinas, Campinas, GERTZMAN, A.A., Ethicon* Surgical Catgut Process Technology A Technical Review, Relatório Técnico, GOFFI FS, TOLOSA EMC. Operações fundamentais. In: GOFFI FS. Técnica Cirúrgica: bases anatômicas, fisiopatológicas e técnicas cirúrgicas. 4a ed. São Paulo: Atheneu; p.52-3, MAKENZIE D. The history of sutures. Med Hist, p , OXFORD ENGLISH DICTIONARY (Shorter), 3.ed. Oxford, Claredon Press, SKINNER, H. - The origin of medical terms, 2.ed. Baltimore, Williams & Wilkins, p. 95, TURNER, A.S., Técnicas Cirúrgicas em Animais de Grande Porte. Editora Roca, São Paulo, Conclusão Sobre os requisitos de qualidade, concluímos que, com este estudo, foi possível determinar de maneira eficiente, utilizando uma abordagem científica denominada: Planejamento Estatístico de Experimentos DOE (Design of Experiments), que os fatores, com maior ou menor grau de 6