Morte Celular: uma abordagem funcional da apoptose e de outros mecanismos de morte Andrew Oliveira Silva

Transcrição

1 II Curso de Sinalização Celular no Câncer Teoria e Prática da Biologia Celular Tumoral Laboratório de Sinalização e Plasticidade Celular Morte Celular: uma abordagem funcional da apoptose e de outros mecanismos de morte Andrew Oliveira Silva De 22 a 26 de Outubro de 2012

2 morte (do latim mors) óbito (do latim obitu) falecimento (falecer + mento) desencarne (deixar a carne) O Dia da Morte; pintura de William- Adolphe Bouguereau ( ) Cessamento permanente das atividades biológicas necessárias à manutenção da vida de um organismo

3 MORTE CELULAR Células são expostas a uma perturbação da homeostase, que transpassa um ponto irreversível de restauração, levando a morte. Caminho sem volta Quantidade e intensidade do sinal

4 MORTE CELULAR INJÚRIAS

5 ADAPTADO DE: Carvalho e Recco-Pimentel (2007) SINAIS DE MORTE CELULAR ESTÍMULOS fisiológico RESULTADO MORTE PROGRAMADA patológico brando severo MORTE TRAUMÁTICA

6 SINALIZAÇÃO DE MORTE CELULAR ESTÍMULOS PATOLÓGICOS = MODIFICAÇÕES AMBIENTAIS ADAPTAÇÃO LESÃO REVERSÍVEL MORTE CELULAR

7 CLASSIFICAÇÃO DE MORTE CELULAR Criação de um Comitê de Nomenclatura em Morte Celular (2005) Editores do periódico Cell Death and Differentiation Guido Kroemer

8 Guido Kroemer et al. Cell Death and Diff. (2007)

9 Guido Kroemer et al. Cell Death and Diff. (2009)

10 Guido Kroemer et al. Cell Death and Diff. (2011)

11 COMO DEFINIR MORTE CELULAR???

12 Perda da estabilidade da Memb. Plasmática

13 Fragmentação das células

14 Engolfamento por fagócitos

15 COMO DEFINIR MORTE CELULAR???

16 CLASSIFICAÇÃO DE MORTE CELULAR MORTE CELULAR TRAUMÁTICA Traumatismo ou doença Processo de morte passiva Processo patológico PROGRAMADA Processo fisiológico normal Participação ativa da célula Mecanismo altamente regulado

17 CLASSIFICAÇÃO DE MORTE CELULAR Clássicas: NECROSE ACIDENTAL APOPTOSE PROGRAMADA

18 CLASSIFICAÇÃO DE MORTE CELULAR Clássicas: NECROSE ACIDENTAL APOPTOSE PROGRAMADA

19 NECROSE: definição Necrosis (do grego Nekros = morte; + Osis = estado alterado de saúde) Chamado, também, de Oncose (do grego ónkos = intumescimento)

20 Necrose: Características Inchaço Celular Comprometimento Da Produção De Energia (ATP) Redução do Volume Nuclear Núcleo Picnótico Perda De Compartimentalização Citoplasmática Perda Da Estabilidade Da Membrana Plasmática Rompimento Extravazamento Do Conteúdo Intracelular

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22 Syntichaki P. et al. Nature Ver. Neurosc (2003)

23 NECROSE em câncer Zona interna do tumor HIPÓXIA necrose Necrose fatores de inflamação neovascularização

24 NECROSE PROGRAMADA Necroptose via de sinalização controladora da necrose Sobrevivência e proliferação RIP1 Necrostatina

25 Tamajusuku AS. Et al (2010); Necrose: metodologias de avaliação Iodeto de Propídeo (PI)

26 Tamajusuku AS. Et al (2010); Necrose: metodologias de avaliação Iodeto de Propídeo (PI) Citometria de fluxo

27 Necrose: metodologias de avaliação Ensaio de ativação de proteases (calpaína e catepsinas) Medição dos níveis de ATP Fosforilação de RIP1 Ubiquitinação de RIP1 Geração de ROS Clivagem específica de PARP-1

28 PROLIFERAÇÃO CELULAR MORTE CELULAR PROGRAMADA Homeostase do organismo Regulação do número de células do organismo Fiscalização da integridade celular Manutenção da capacidade proliferativa controlada

29 CLASSIFICAÇÃO DE MORTE CELULAR Clássicas: NECROSE ACIDENTAL MORTE AUTOFÁGICA APOPTOSE PROGRAMADA

30 Autofagia: tipo de morte celular??? Processo fisiológico de degradação e reciclagem de moléculas e organelas sobrevivência

31 Autofagia: tipo de morte celular???

32 CLASSIFICAÇÃO DE MORTE CELULAR Clássicas: NECROSE ACIDENTAL MORTE AUTOFÁGICA APOPTOSE PROGRAMADA

33 Kerr, JF; J of pathology and bacteriology (1965) Apoptose: descoberta John Foxton Ross Kerr (1965) definiu a morte celular programada, diferenciando-a da morte traumática nomeou este tipo de morte de APOPTOSE do grego, que significa queda das folhas

34 Apoptose: definição É um processo de morte celular programada, responsável pela remoção de células e tecidos alterados ou dispensáveis, exercendo uma importante papel na manutenção da estrutura dos órgãos e tecidos, impedindo a proliferação de células injuriadas e/ou desnecessárias que podem comprometer o correto funcionamento tecidual e a homeostase do organismo.

35 Zuzarte-Luis, (2002) Apoptose: fisiológica Eliminação das membranas interdigitais

36 Apoptose: fisiológica Seleção de linfócitos hipereativos ou não reativos

37 Apoptose: fisiológica Desenvolvimento e morfogênese de anfíbios

38 APOPTOSE: estímulos de indução Radiações Drogas Choque térmico Infecções virais Metais pesados Agentes Oxidantes Inibidores metabólicos Jejum Hipóxia

39 APOPTOSE: Características Arredondamento da célula retração de pseudópodes Redução do volume celular Piknosis Condensação da cromatina Fragmentação nuclear Karyorrhexis Poucas ou quase nenhuma alteração estrutural em organelas citoplasmáticas Blebbing na membrana citoplasmática manutenção da integridade sem extravazamento do conteúdo citoplasmático Engolfamento por fagócitos in vivo

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42 Em mamíferos, cerca de células são produzidas a cada segundo através de mitose e um número similar morre por apoptose (Vaux and Korsmeyer, 1999, Cell)

43 Apoptose: sinalização

44 Receptores de morte (TNF) Bid truncada (tbid) Bcl-2 Bcl-xL Mcl-1 Bak Bax Caspase 8 MITOCÔNDRIA PRISON Caspase 3 Cit.C, Smac e AIF APOPTOSE P53 PUMA, Noxa, Bim Bad

45 Apoptose: Vias de indução VIA EXTRÍNSECA DE INDUÇÃO DE APOPTOSE VIA INTRÍNSECA DE INDUÇÃO DE APOPTOSE

46 VIA EXTRÍNSECA DE INDUÇÃO DE APOPTOSE

47 Apoptose: Receptores de morte da família TNF

48 Apoptose: transdução do sinal

49 Apoptose: conexão entre vias Bid pró-apoptótico da família Bcl-2 Substrato de caspases iniciadoras Forma truncada = ativada Desestabilização da membrana mitocondrial Ativação da via intrínseca

50 Apoptose: integrantes da via extrínseca

51 Apoptose: Vias de indução VIA EXTRÍNSECA DE INDUÇÃO DE APOPTOSE VIA INTRÍNSECA DE INDUÇÃO DE APOPTOSE

52 VIA INTRÍNSECA DE INDUÇÃO DE APOPTOSE

53 Apoptose e seus reguladores Reguladores positivos Proteínas pró-apoptóticas Morte Genes supressores tumorais Câncer genes inativados Reguladores Negativos Proteínas anti-apoptóticas Sobrevivência Proto-oncogenes Câncer genes superexpressos

54 Apoptose: família bcl-2 Bcl-2 B-cell Lymphoma 2 diversos membros proteínas pró-apoptóticas proteínas anti-apoptóticas Domínios de homologia com Bcl-2 domínio BH Domínio de interação entre os integrantes da família Bcl-2

55 Apoptose: família bcl-2 Strasser A. Nature Reviews Immunol (2005)

56 Apoptose: família Bcl-2 e a Mitocôndria Vaskivuo T. Regulation of apoptosis in the female reproductive system (2002)

57 Apoptose: família Bcl-2 e a Mitocôndria Ehrlich E. QUIAGEN reviews (2011)

58 Apoptose: anti-apoptótico X pró-apoptótico Clarke &Tyler Nature reviews (2009)

59 Garrido C et al. Cell Death and Diff. (2006) Apoptose: Permeabilização da Membrana externa da mitocôndria

60 Apoptose: Apoptossomo formação dependente de energia (ATP)

61 Apoptose: Apoptossomo

62 Apoptose: Apoptossomo Lindholm D. JCB (2004)

63 Apoptose: familia das IAPs IAP s Inhibitors of Apoptosis Domínio BIR (Baculoviral IAP repeat) 1 a 3 domínios Inibem a ativação de pro-caspases inibem a atividade de caspases ativadas: Promover a degradação de caspases Sequestro de caspases ativadas Wei Y. ABBS (2008)

64 Apoptose: familia das IAPs Wei Y. ABBS (2008)

65 Apoptose: familia das IAPs

66 Apoptose: caspases CASPASE Cisteine ASPartic-acid protease protease com um resíduo de cisteína importante para a clivagem de proteínas clivagem após resíduos de ácido aspártico importantes em diversos mecanismos celulares além da apoptose

67 Apoptose: caspases Sintetizadas na forma de pró-enzimas inativadas P R Ó C A S P A S E S Pró-domínio Domínio principal Ativação a partir da clivagem 2 grupos de caspases: Caspases Iniciadoras (Casp 8,10) autoclivagem Caspases Efetoras (Casp 3, 6, 7) clivadas pelas iniciadoras

68 Apoptose: caspases Lavrik IN. (ActaNaturae)

69 Apoptose: caspases Vaskivuo T. Regulation of apoptosis in the female reproductive system (2002)

70 Apoptose: integrantes da via intrínseca

71 Apoptose: p53 como supressor tumoral

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73 Silva AO et al. Unpublished data Apoptose: apoptose e câncer SILENCIAMENTO DE XIAP combinado com SUPEREXPRESSÃO DE p53

74 Apoptose: apoptose e câncer

75 Apoptose: apoptose e câncer

76 Apoptose: metodologia de avaliação Ensaio TUNEL TUNEL Terminal deoxynucleotidyl transferase dutp nick end labeling Detecção de DNA fragmentado Resultado da indução de apoptose Outros processos indução de fragmentação de DNA ENSAIOS COMPLEMENTARES

77 Apoptose: metodologia de avaliação Ensaio TUNEL

78 Apoptose: metodologia de avaliação Ensaio de Cometa

79 Apoptose: metodologia de avaliação Imunofluorescência Atividade de caspase Substrato de caspase Degradação do substrato gera coloração vermelha Análise por microscopia de fluorescência

80 Apoptose: metodologia de avaliação AnexinaV/IP Marcação de fosfatidilserina Externalização de fosfatidilserina apoptose Análise por citometria de fluxo ou microscopia de fluorescência Um dos ensaios mais usados para indicar apoptose

81 Apoptose: metodologia de avaliação AnexinaV/IP

82 Apoptose: metodologia de avaliação Western blot

83 Apoptose: metodologia de avaliação apostain Cromatina condensada Anticorpo anti-ssdna Desnaturação térmica Na presença de formamida Desnaturação apenas em células apoptóticas

84 Apoptose: metodologia de avaliação Microscopia eletrônica

85 Apoptose: metodologia de avaliação Microscopia óptica

86 Mortes Atípicas

87 Mortes Atípicas Catástrofe Mitótica

88 Mortes Atípicas Catástrofe Mitótica

89 CLASSIFICAÇÃO DE MORTE CELULAR Clássicas: NECROSE Atípicas: Necroptose Anoikis Cat. mitótica MORTE AUTOFÁGICA APOPTOSE Cornificação Excitotoxicidade Degeneração Walleriana Paraptose Piroptose Pironecrose Entose

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91 Necrose X Apoptose Carvalho & Recco-Pimentel (2007)

92 Necrose X Apoptose Carvalho & Recco-Pimentel (2007)

93 Necrose X Apoptose Carvalho & Recco-Pimentel (2007)

94 Agradecimentos

95 Realização

96 Obrigado!!!!