Biotecnologia da Piper hispinervium - Pimenta Longa

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1 PESQUISA Biotecnologia da Piper hispinervium - Pimenta Longa Rosete Pescador Patrícia Sibila Araújo Cláudio Hermes Maas Laboratório de Biotecnologia: Micropropagação Vegetativa Universidade Regional de Blumenau (FURB) pescador@furb.rct-sc.br Ricardo Andrade Rebelo Carmem Raquel Giotto Renato Wendhausen Jr. Graziela Largura Laboratório de Química (FURB) rrcarbon@furb.rct-sc.br renato@ furb.rct-sc.br Protocolos para obtenção de Safrol Lorena Benathar Ballod Tavares Laboratório de Engenharia Bioquímica (FURB) lorena@furb.rct-sc.br Fotos cedidas pelos autores Piper hispidinervium C.DC., popularmente conhecida como Pimenta Longa, é planta arbustiva aromática, e ocorre naturalmente da Floresta Amazônica até o sudoeste brasileiro. É produtora de óleo essencial volátil correspondente a 2,7% da sua massa verde total (Simionatto, et al.,1997), que apresenta concentrações superiores a 80% do importante metabólito secundário, safrol. O safrol ou 4 - alil -1,2 - metilenodioxibenzeno, é um éter fenólico do grupo dos anilpropanóides, com fórmula molecular C 10 H 10 O 2, ponto de ebulição de 232 o C 235 o C e que solidifica a uma temperatura de 11 o C. É um líquido levemente amarelo de odor característico, insolúvel em água e solúvel em solventes orgânicos, tais como álcool, clorofórmio e éter etílico. Embora apresente comprovada atividade carcinogênica in vitro, é de grande importância científico-tecnológica como precursor de uma variedade de compostos, notadamente, fármacos, bioinseticidas biodegradáveis, fixadores de aroma e, mais recentemente, de drogas antitrombóticas e auxinas endólicas (Rosa et al.,2000). Na Figura 1 estão representados alguns dos mais importantes derivados do safrol. Assim, pelas potencialidades acima descritas, tem sido estimulada a realização de investigações sobre a obtenção de safrol a partir da Pimenta Longa. Portanto, este trabalho visa a apresentar alguns resultados sobre estudos de morfogênese da Pimenta Longa com vistas à obtenção de safrol. Além disso, é apresentado um estudo sobre cinética de crescimento em meio líquido e sobre crescimento de células de Pimenta Longa imobilizadas em crisotila. 1. Morfogênese in vitro da Pimenta Longa A possibilidade de manipular sistemas in vitro para clonagem de genótipos superiores de espécies vegetais depende de uma série de fatores. Destes, o conhecimento da fisiologia do desenvolvimento é de fundamental importância para se obter respostas morfogenéticas, onde sistemas de cultura in vitro, correlações morfológicas, fisiológicas, genéticas e bioquímicas existentes em uma planta intacta são rompidas. A obtenção de safrol no Brasil até cerca de 1990 era decorrente da atividade extrativista, onde a obtenção da Fig.1: Derivados do safrol madeira e do óleo essencial ao longo de, aproximadamente, 45 anos, levou ao comprometimento da disponibilidade da canela (Ocotea odorifera), principal geradora desse composto. Como conseqüência disso, ocorreu uma redução drástica na produção brasileira de safrol. Assim, com a proibição da extração da canela, outras fontes de safrol começaram a ser pesquisadas. Portanto, a Pimenta Longa está sendo objeto de estudo em alguns laboratórios brasileiros pela potencialidade em produzir safrol. No Laboratório de Biotecnologia: Micropropagação Vegetativa da Universidade Regional de Blumenau, a partir de 1996, iniciou-se o estudo da Pimenta Longa como fornecedora de material vegetal para o estudo da mor- 18 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento

2 Tabela 1. Percentual médio de proliferações adventícias in vitro oriundas de segmento nodal de Pimenta Longa em resposta ao meio de cultura MS, após 60 dias de cultivo Meio de Cultivo MS 0 MS 1 MS 2 Percentual médio com brotações adventícias * 1,2 c 20,5 b 37,3a * Letras distintas representam diferença significativa a 5% fogênese in vitro e cultivo de células, objetivando o desenvolvimento de métodos alternativos para a produção de safrol. Inicialmente, sementes de Pimenta Longa foram germinadas in vitro com meio de cultura MS (Murashige e Skoog, 1962) para obtenção de material vegetal (plântulas - Figura 2). As sementes foram submetidas a um rigoroso processo de assepsia e, após, foram inoculadas e mantidas em câmara germinativa sob condições de temperatura e luminosidade controladas Organogênese da Pimenta Longa A propagação de plantas através da cultura de tecidos ocorre em uma seqüência de estádios, cada qual com meios de cultura específico, tipo e balanço dos reguladores de crescimento e condições físicas tais como intensidade luminosa, temperatura e fotoperíodo. Em condições laboratoriais cada estádio deve ser identificado e as condições ótimas devem ser estabelecidas. Para a organogênese da Pimenta Longa, segmentos nodais de 1cm de comprimento, originados de seedlings, foram inoculados em tubos de ensaio contendo 10mL de meio de cultura MS líquido, utilizando-se como suporte de papel filtro (Figura 3). Os seguintes balanços hormonais foram empregados: MS 0 (sem reguladores), MS 1 (2,69µM de ANA [ácido naftaleno acético] e 4,44µM de BAP [6 benzilaminopurina]) e MS 2 (4,03µM de ANA e 6,67µM de BAP). As culturas foram mantidas em câmara de crescimento com temperatura de o C e fotoperíodo de 16h com intensidade luminosa de1600 Lux. Conforme a Tabela 1, os fitoreguladores BAP e ANA, adicionados ao meio MS induziram o desenvolvimento de brotações adventícias a partir de segmento nodal. Observou-se uma associação na resposta morfogenética entre as concentrações mais elevadas de reguladores quando comparados com o MS O que não continha reguladores. Constatou-se ainda que o tamanho médio (em cm) da parte aérea obtido nos três balanços de reguladores de crescimento foi de 3,82 a em MS0, 1,62 b em MS1 e 1,43 b ems2 (Figura 4). Quanto à formação das plântulas, observou-se que o seu tamanho médio, após 30 dias da inoculação, apresentaram um tamanho médio (em cm) de 1,84 b e 3,35 a e 1,67 b, aos 60 e aos 90 dias, respectivamente (Figura 5). Verificou-se que, ao final de 90 dias de cultivo as plântulas apresentaram necrose, além de menor tamanho médio em relação aquelas cultivadas durante 30 e 60 dias. Tal fato, segundo Mantell et al (1994) pode ser decorrente do esgotamento dos nutrientes no meio de cultura. Nos ensaios de cultivo in vitro da Pimenta longa também foram determinados os pesos médios dos caules, folhas e raízes. Conforme indicado na Figura 6, as plântulas apresentaram maior produção de sistema radicular em relação às outras partes da planta (caule e folhas) independente do meio. Figura 2. Germinação de sementes de Pimenta Longa in vitro Já a maior produção de caule e folha foi obtida quando se utilizou o meio MS 0, ou seja, sem reguladores. Em relação ao período de cultivo, registrou-se um peso médio, aos 30 dias, de 0,020g, 0,036g e 0,017g; aos 60 dias, de 0,083g, 0,075g e 0,280g; e aos 90 dias, de 0,082g, 0,109g e 0,251g, para caules, folhas e raízes, respectivamente (Figura 7). Quanto ao tempo de cultivo das plântulas, verificou-se que o peso médio do caule e da raiz foi superior no ensaio com 60 dias de cultivo. A partir daí, observou-se a formação gradativa de necrose das plântulas. Outra constatação importante foi que nas plântulas cultivadas em meio MS 1 e MS 2, apareceram formações de massas celulares em raízes e em partes caules que encontravam-se em contato com o meio de cultura, já que se utilizou como suporte ponte de papel filtro. Tabela 2. Composição dos meios de cultura utilizados para embriogênese da Pimenta Longa Meio de Cultura Balanço de Reguladores BAP 2,4 - D MS O 0,0 0,0 MSBD 0,75 0,25 0,75 MSBD 0,50 0,25 0,50 MSBD 0,25 0,25 0,25 MSD 0,75 0,0 0,75 MSD 0,50 0,0 0,50 MSD 0,25 0,0 0,25 MSB 0,75 0,0 0,75 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento 19

3 Figura 4. Tamanho médio da parte aérea, em centímetros, das plântulas de Pimenta Longa obtido nos três balanços de reguladores (MS 0, MS 1 e MS 2 ) após 30 dias de inoculação Figura 3. Organogênese da Pimenta Longa em meio MS 0 em suporte de papel filtro Figura 5. Tamanho médio da parte aérea das plântulas de Pimenta Longa obtidas em um período de cultivo de 30, 60 e 90 dias, em meio de cultura MS Embriogênese Somática A embriogênese somática pode ser aplicada em culturas celulares de Pimenta Longa, permitindo a conservação e o intercâmbio de germoplasma, a obtenção de plantas livres de patógenos e uma rápida multiplicação de plantas elites. Na Pimenta Longa, a embriogênese somática ocorreu de forma indireta (formação de massa pré-embriogênica antes do surgimento dos embriões, conforme Figura 8), apresentando vários estádios de desenvolvimento simultâneos (Figura 9). A origem do embrião foi a partir de um agrupamento de células ou células isoladas competentes. A formação da massa pré-embriogênica ocorreu a partir dos explantes provenientes de caule de sementes Figura 6. Peso médio de cada parte da Pimenta Longa (caule, folha e raiz) obtido nos três balanços de reguladores (MS 0, MS 1 e MS 2 ) Figura 7. Peso médio de cada parte da Pimenta Longa (caule, folha e raiz) obtido em um período de cultivo in vitro de 30, 60 e 90 dias 20 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento

4 germinadas in vitro. A formação dos embriões somáticos ocorreram a partir de massa pré-embriogênica, por meio de um processo de diferenciação celular, o qual foi ativado e controlado por reguladores de crescimento (BAP e 2,4 D [2,4 clorofenoxidoacético]). Os fatores que levaram à embriogênese somática foram a composição do meio de cultura (balanço de auxinas e citocininas), a condição ambiental (luz e escuro) e a interação entre os dois fatores. A condição ambiental apresentou uma grande influência na formação da massa préembriogênica e na sua diferenciação em embriões somáticos. Exemplo disso é que, na ausência de luz, a taxa de conversão da massa pré-embriogênica em embriões somáticos é muito superior à taxa de conversão da massa exposta à luz. Para determinar quais foram os efeitos dos diferentes balanços de reguladores sobre os explantes, foi utilizado o meio de cultura teste MS O, o qual não era suplementado com reguladores de crescimento e os meios listados na Tabela 2. Os resultados obtidos nesses ensaios foram comparados com o meio teste e avaliados estatisticamente (análise de variância) posteriormente. Os reguladores de crescimento determinam as respostas morfogênicas dos explantes, sendo a conversão da massa pré-embriogênica em embriões somáticos a resposta morfogênica esperada nos experimentos. Logo como o meio teste não apresenta reguladores, sua resposta é negativa (não promove formação de massa pré-embriogênica ou sua conversão em embriões somáticos). Os resultados obtidos dos ensaios com diferentes concentrações de reguladores de crescimento são apresentados na Figura 10. A análise estatística determinou não haver diferença significativa na taxa de conversão de massa pré-embriogênica em embriões somáticos entre os meios: MSD 0, MSD 0,50 e MSD 0,75. Constatou-se também não haver diferença Figura 8. Explante com formação regular de massa pré-embriogênica Figura 9. Embriões somáticos formados a partir de massa pré-embriogênica significativa entre os meios MSB 0,25, MSB 0,50, MSB 0,75, MSBD 0,50 e MSBD 0,75. O meio de cultura MSBD 0,25 apresentou o melhor desempenho na taxa de conversão de massa em embriões, com uma média de 19,41 embriões. Observou-se que o regulador 2,4 D, quando utilizado de forma isolada, não converteu massa pré-embriogênica em embriões, mas induziu a divisão celular, formando somente massa préembriogênica. A ação isolada do regulador BAP promoveu formação de massa pré-embriogênica e sua conversão em embriões somáticos; porém os pontos de formação de massa nos explantes, locais onde ocorrem o processo de desdiferenciação, são irregulares e o volume de massa formada é baixo. A melhor expressão embriogênica foi obtida na ação conjunta dos dois reguladores de crescimento utilizados no meio MSBD 0,25, no qual houve a formação de uma massa regular em todo o explante (Figura 8) e uma elevada taxa de conversão em embriões somáticos (Figura 9). Os embriões somáticos obtidos foram formados a partir de grupos de células ou de células isoladas e encontravam-se em diversos estádios de desenvolvimento (Figura 11), caracterizando uma embriogênese repetitiva. A condição ambiental apresentou uma grande influência na embriogênese da Pimenta Longa, principalmente na conversão de massa pré-embriogênica em embriões somáticos. Nos ensaios realizados na ausência de luz (escuro), ocorreu uma maior conversão de massa em embriões somáticos, independente do meio de cultura utilizado (balanço de reguladores). A luz atua como inibidor na conversão da massa celular em embriões, fato já descrito por Guerra, (1996). As análises dos resultados demonstraram que as expressões embriogênicas observadas nos explantes de Pimenta Longa são decorrência da composição do meio de cultura, da condição ambiental (luz e escuro) e da interação dos dois fatores, com uma probabilidade de erro < 0,0001. A embriogênese somática em Pimenta Longa ocorreu de forma indireta, apresentando vários estádios de desenvolvimento simultâneos e a sua origem é a partir de grupo de células competentes ou de células isoladas competentes. 2 Indução de Calos Friáveis A cultura de células é iniciada a partir de explantes (Figura 2) em presença de meio nutritivo acrescido de reguladores de crescimento, que são usados na indução. A indução é feita sob luz ou ausência dela, em temperaturas que podem variar entre 25 ±3 o C. A característica de friabilidade é favorecida por uma alta relação auxina/citocinina, bem como pela adição de outros componentes ao meio nutritivo. O genótipo também influencia a facilidade de formar massa celular (calos friáveis) cuja coloração pode variar do amarelo ao bege. A liberação de células a partir de Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento 21

5 Figura 10. Número médio de embriões somáticos obtidos nos diferentes meios calos friáveis (Figura 12) é mais rápida que de calos compactos. As células podem apresentar morfologia, tamanho, coloração e ploidia variada, dependendo do período de cultivo e composição do meio nutritivo. 3. Cultivo em suspensão celular de Pimenta Longa 3.1. Determinação da curva de crescimento A suspensão celular de pimenta longa destina-se à obtenção e proliferação de células em meio nutritivo líquido, sob condições de agitação, aeração e temperatura controladas. Nesse ambiente, é essencial que as células suspensas se dividam e se multipliquem ativamente. De acordo com a composição do meio nutritivo, podese afetar o padrão da diferenciação (lignificação e/ou alongamento), divisão e senescência celular. A vantagem da cultura de células em meio líquido é a sua alta taxa de multiplicação. Entretanto, dois aspectos devem ser considerados: a formação de agregados celulares e a existência de mosaicismo ou mixoploidia, isto é, coexistência de diferentes populações celulares com bases genéticas distintas. Atualmente, vários estudos com células vegetais cultivadas em reatores biológicos (Doran, 1993) têm sido relatados visando à produção de metabólitos secundários. Com esse objetivo, trabalhos preliminares para cultivo de células de Pimenta Longa em meio líquido foram realizados em agitador rotativo, com temperatura de Figura 11. Embriões somáticos em diferentes estádios de desenvolvimento: estádio cordiforme, estádio globular e estádio torpedo 30 C, agitação de 100 rpm e ausência de luz e aeração. Os ensaios foram conduzidos em frascos de vidro de 500 ml que continham 50 ml de meio MC 23, com 1 g de massa celular úmida em cada frasco. Em intervalos regulares, durante 31 dias, coletou-se um frasco para determinação da concentração celular. Para este teste, quantificou-se a massa celular após filtração à vácuo de todo o conteúdo presente no frasco de vidro. O material filtrado foi retido em membrana millipore com porosidade controlada de 0,45 µm. A membrana contendo o material filtrado foi levada à estufa com 85 C até peso constante. Assim, a concentração de células de Pimenta Longa expressa em gramas de células por volume de meio de cultivo determinado como massa seca apresentou um perfil de produção, segundo uma equação polinomial de terceira ordem (Figura 13 curva de X), caracterizando diferentes fases de crescimento. Quanto a velocidade específica de crescimento (µ X ) definida pela equação 01, que mede a velocidade de crescimento relativa à massa de células presentes no meio de cultivo, está representada pela Figura 13 - curva de µ X. Analisando a Figura 13, observa-se um aumento da concentração celular de cerca de 8,5 vezes o valor inicial, após 24 dias de cultivo. No entanto, esses valores podem ser aumentados com a utilização de outras estratégias de cultivo, fato este que já está sendo estudado com o emprego de biorreatores de bancada. Como conseqüência desse estudo, espera-se elevar a velocidade específica de crescimento e a produtividade em células Imobilização das células de Pimenta Longa sobre crisotila A imobilização de células vegetais tem sido descrita na literatura como um método eficiente de otimizar a produção de metabólitos secundários, uma vez que, nessas condições, as células vegetais imobilizadas têm comportamento semelhante ao daquelas em estado de agregação, formando tecidos vegetais (Mavituna, 1987), onde existe um grande contato célula-célula (Doran, 1993). A crisotila é um argilo mineral que tem sido explorado para a imobilização de células de microorganismos em processos de biotransformação em síntese orgânica, apresentando ótima eficiência (Wendhausen Jr.,1998). Para os experimentos de imobilização de células de pimenta longa sobre crisotila, essas após o cultivo em suspensão celular, foram submetidas ao contato com crisotila ativada em suspensão, sob agitação e temperatura controladas. O sistema é mantido então nas condições normais de cultivo em meio líquido. A figura mostra uma fotografia em microscópio ótico das células vegetais, após duas semanas de cultivo. Observa-se boa interação da crisotila com as células de Pimenta Longa, com a formação de aglomerados de células dispersas na malha formada pelas fibras de crisotila. A quantificação de safrol via cromatografia gasosa para o 22 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento

6 sistema imobilizado mostrou ainda uma produção pelo menos três vezes maior deste metabólito, comparado ao sistema com células livres cultivadas nas mesmas condições. 4. Análise Química Qualitativa de Safrol Caules, folhas e raízes provenientes de 5 tubos de ensaio foram separadamente submetidos à hidrodestilação segundo a técnica clássica descrita em Fessenden (1983). Após a extração do material destilado em n-hexano (4 x 10mL), este foi tratado com sulfato de magnésio, filtrado gravimetricamente e concentrado em evaporador rotatório, fornecendo amostras de 5mL. Os meios de crescimento foram diretamente extraídos em n-hexano (5 x 10mL) e submetidos ao protocolo descrito anteriormente. O safrol foi caracterizado por cromatografia gasosa, comparando-se os tempos de retenção das amostras com aquele obtido para o padrão PA procedência Aldrich. A análise cromatográfica foi conduzida em aparelho Shimadzu 14B, configurado com detector de ionização de chama e coluna capilar de sílica fundida CB-P20 (SE-54, 25m x 0,25mm), sendo empregado Hidrogênio como gás de arraste, regulado para fornecer uma velocidade linear de 1,5mL/min a 150 o C. As amostras foram injetadas no modo split e detectadas a 280 o C e 300 o C, respectivamente. Referências Doran, M. P. Design of reactors for plant cells and organs. Adv. in Biochem. Eng. Biotechnol. v.48, p , Fessenden. S.J. e Fessenden, R.J. Technics experiments for organic chemistry. Ed. Willard. Grandt. Press, Boston Guerra, M. P. Embriogênese Somática. Curso de Biologia Celular e Tranaformação de Plantas. Distrito Federal, Mantell, S. H.; Matthews, J. A. & Mckee, R. A. Princípios de biotecnologia em plantas. Uma introdução à Figura 12. Calo friável de Pimenta Longa Figura 13. Curva de crescimento celular e de velocidade específica de crescimento de Pimenta Longa em suspensão durante cultivo em sistema descontínuo engenharia genética em plantas. Ribeirão Preto: Editora FCA/ Sociedade Brasileira de Genética, 1994, 344p. Mavituna, F., Park, J. M.,Williams, P. D., Wilkinson, A. K. Characteristics of immobilized cell reactors In: WEBB, C., MAVITUNA, F. Plant and Animal Cell cuttures: Process Possibilities. Manchester, Ellis Horwood. p Murashige, T.; Skoog, F. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures. Physiology Plant, n.15, p , Rosa, F.A.F.; Nascimento, M.G.; Rebelo, R.A.; Pescador, R. Avaliação da atividade regulatória de crescimento de compostos análogos ao ácido indolacético em sementes de alface. In: 23 a Reunião Anual da Sociedade Brasileira de Química. Livro de Resumos, v.2, QB-010, Poços de Caldas, Simionatto, E.L.; Rebelo, R.; Ramos, M.G.; Zanette, V.C. Fontes altenativas de safrol propagação da pimenta longa pela técnica de estaquia. FNMA, processo anterior n. 1668/92 referente ao Convênio Anterior n.058/95, Wendhausen Jr. R. Estudo sobre utilização de crisotila como suporte de células de Saccharomyces cerevisiae para uso em processo contínuo de fermentação alcoólica e biorreduções. Tese de Doutorado, UNICAMP, Campinas, SP, Figura 14. Células de Pimenta Longa imobilizadas em crisotila Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento 23