CICLO DE MATURAÇÃO E PRODUÇÃO DE ETILENO DE TOMATES (Lycopersicon esculentum, Mill.) TRANSGÊNICOS 1

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1 CICLO DE MATURAÇÃO E PRODUÇÃO DE ETILENO DE TOMATES (Lycopersicon esculentum, Mill.) TRANSGÊNICOS 1 Ana Lúcia CHAVES 2, Cesar ROMBALDI 2, Paulo Junqueira de ARAUJO 3, Claudine BALAGUÉ 4, Jean- Claude PECH 4, Ricardo Antonio AYUB 5 RESUMO Objetivou-se estudar o comportamento fisiológico de frutos de tomateiro (Lycopersicon esculentum, Mill.), da cv. Kadá, transformados geneticamente, via Agrobacterium tumefaciens, com o clone de DNA pmel1, em orientação antisenso, e de frutos desta mesma cultivar, não transformados. O estudo fisiológico foi realizado avaliando-se a duração do ciclo de maturação dos frutos, amadurecidos na planta e após a colheita no estádio verde-maduro, e sua produção de etileno. Os frutos transformados amadurecidos na planta tiveram um ciclo total médio de 27 dias, enquanto os amadurecidos

2 após a colheita, tiveram este intervalo prolongado a 50 dias. Ao contrário, os tomates não transformados apresentaram um ciclo de maturação mais acelerado quando colhidos no estádio verde-maduro, em relação aos frutos amadurecidos nas plantas. Os valores foram, em média, de 20 e 30 dias, respectivamente. Estes resultados estão correlacionados com as variações na produção de etileno observada nos dois genótipos. Frutos não transformados produziram, em média, 10,46 nl de etileno.g - 1.h -1, enquanto os transgênicos tiveram sua produção de etileno diminuída para 0,13 nl.g - 1.h -1. Pode-se concluir, então, que a redução da produção de etileno, verificada nos tomates transformados, é necessária, mas não é suficiente para prolongar o ciclo de maturação e aumentar a durabilidade dos frutos. Para que isto ocorra, é necessário que se proceda à colheita dos tomates no estádio verde-maduro. Palavras-chave: etileno, ACC oxidase, tomate. SUMMARY RIPENING CYCLE AND ETHYLENE PRODUCTION OF TRANSGENIC TOMATOES (Lycopersicon esculentum, Mill.) This work was carried out to study the physiological behaviour of tomato fruits (Lycopersicon esculentum, Mill.), var. Kada,

3 geneticaly transformed, via Agrobacterium tumefaciens, with the pmel1 DNA clone, in antisense orientation, and nontransformed ones, from the same variety, growth in a greenhouse. The physiological study was conducted for evaluating the ripening cycle of fruits, ripened attached and detached from the plants in the mature-green stage, and their ethylene production. On average, tranformed tomatoes that ripened atached to the plants had a ripenig cycle of 27 days, whereas in detached fruits, this time was 50 days. Instead of it, nontransformed tomatoes showed a faster ripening process when ripened detached to the plants (20 days), whereas in attached fruits this period was 30 days, on average. These results were related to ethylene production. Tomato fruits from nontransformed plants produced 13,46 nl ethylene.g -1.h -1, and the transformed fruits showed an ethylene production almost 100 times smaller than nontransformed ones ( 0,13 nl ethylene.g -1.h -1 ). Thus, the conclusion reached is that the reduction of ethylene production observed in transgenic tomatoes is necessary but it is not enough to extend the ripening cycle and to increase the period of time that the fruits will last. To achieve this, it is necessary to harvest the fruits in the maturegreen stage. Key-words: ACC oxydase, ethylene, tomato.

4 1 - INTRODUÇÃO A demonstração de que os tecidos vegetais produzem etileno data de mais de meio século (9) e, a partir daí, vários trabalhos demonstraram a implicação deste regulador de crescimento em numerosas fases do desenvolvimento das plantas (20). Também, já está demonstrado que o etileno intervém, a nível molecular, na indução da expressão de numerosos genes através de uma cadeia de transdução de sinais. Vários trabalhos publicados nos últimos anos descrevem estes efeitos fisiológicos do etileno (1, 14, 17, 19, 25), mas, o mesmo é conhecido, sobretudo, como o "hormônio" da maturação de frutos climatéricos e da senescência de flores (19). A via de biossíntese do etileno compreende a conversão da S- adenosil-metionina (SAM) em ácido 1-carboxílico-1- aminociclopropano (ACC), sob a ação da ACC sintetase (ACCS) e a conversão do ACC em etileno, pela enzima formadora do etileno (EFE) ou ACC oxidase (ACCO). Ainda, o ACC pode ser malonilado produzindo o N-malonil ACC, sob a ação da N-malonil transferase (NMT), reduzindo a disponibilidade de substrato para a ACCO (28). Os avanços científicos permitiram a caracterização da ACCS e os genes respectivos já foram isolados e clonados, porém, muito resta a elucidar no que concerne à ACCO. Apenas em 1991, é que conseguiu-se, pela primeira vez, extrair e dosar sua atividade in vitro, graças à analogia feita entre um clone de DNA desta enzima e o de uma flavanona hidroxilase (27). A descoberta da natureza e das propriedades da ACCO proporcionou avanços importantes na área da biologia molecular da maturação de frutos. Em produtos climatéricos,

5 tais como a maçã, o pêssego, a pera, o melão, o tomate, e o kiwi, o processo de maturação/senescência é acompanhado de um incremento da síntese de etileno e da intensidade respiratória. Este fenômeno, chamado crise climatérica, é acompanhado de mudanças importantes a nível de expressão de genes que são a origem do processo de maturação (24). Vários clones de DNAc correspondentes a RNAms que se acumulam em abundância durante a maturação foram isolados, mas, inicialmente, somente os genes correspondentes às enzimas poligalacturonase e ACCS puderam ser identificados (11). Apesar da ACCO ter sido isolada e parcialmente seqüenciada (7), poucos trabalhos referentes à regulação genética e à família gênica foram realizados. Eles abriram, no entanto, novas perspectivas para a manipulação da via de biossíntese do etileno e da maturação de frutos (19). Gray et al. (10), descreveram as diferentes vias passíveis de utilização da técnica dos RNAm antisenso na manipulação genética de frutas e hortaliças climatéricas. A maioria dos autores utiliza o tomateiro, como material vegetal, pela disponibilidade de um grande número de informações fisiológicas e de protocolos de regeneração existentes para esta espécie. Como método de transformação, o uso do sistema Agrobacterium tumefaciens, foi o mais adotado (20). Em 1990, Hamilton et al. (13), realizaram a transformação genética de tomate com o clone de DNA ptom13 (em orientação antisenso), implicado na via de biossíntese do etileno. Os frutos transgênicos ou transformados obtidos, apresentaram uma forte redução na produção de etileno e uma diminuição da velocidade de maturação. A mesma estratégia foi utilizada por Oeller et al. (18), que obtiveram frutos de tomate com uma produção de etileno reduzida em 99,5%, pela

6 transformação de plantas com um clone de DNA correspondente à ACCS, também em orientação antisenso. Klee et al. (16), isolaram um gene codificador da enzima ACC deaminase, em bactérias saprófitas. Este gene, nunca identificado em tomateiro, foi introduzido nesta espécie visando sua superexpressão e por conseqüência, diminuição da disponibilidade do substrato imediato do etileno, o ACC. Os frutos oriundos das plantas transformadas apresentaram comportamento similar aos obtidos por Hamilton et al. (13) e por Oeller et al. (18). Em 1993, Balagué et al. (3) isolaram, em melão, um clone de DNA denominado pmel1. Este DNA codifica uma proteína de 35 kda, que tem uma sequência de aminoácidos altamente homóloga à da ACCO de tomate (13) e de maçã (6). Por essas razões, o pmel1 foi inserido, em orientação antisenso, num vetor binário e transferido para Agrobacterium tumefaciens LB 4404, para a transformação de plantas. Ayub et al. (2), utilizaram esta construção quimérica para transformar o melão, cultivar Vedrantais. Os frutos oriundos de plantas transformadas apresentaram, além de uma baixa produção de etileno, uma maior vida de prateleira, não havendo diferença significativa entre tomates transformados e não transformados, no que concerne às características físico-químicas e organolépticas. Exceção feita à transformação de tomateiros com um clone da ACC deaminase de Pseudomonas sp. (16), os demais trabalhos utilizaram clones homólogos (2, 15, 21, 23). Entretanto, o uso da técnica do RNA antisenso utilizando seqüências de DNA de outras espécies (clones heterólogos), constitui uma alternativa para a inibição e o estudo da expressão de genes de interesse (19, 20). Com base nesses conhecimentos, Rombaldi et al. (23) utilizaram o clone pmel1 para a transformação de tomateiro, visando a inibição

7 da síntese da ACC oxidase. Dentro deste contexto, o presente trabalho teve por objetivo estudar o efeito da colheita sobre o ciclo de maturação e a produção de etileno de tomates oriundos de plantas transformadas geneticamente com o clone de DNA pmel1, de melão, em orientação antisenso, e de plantas não transformadas, cultivar Kadá. 2 - MATERIAIS E MÉTODOS Material vegetal Foram utilizados frutos oriundos de tomateiros (Lycopersicon esculentum, Mill.) da cultivar Kadá, transformados geneticamente, via Agrobacterium tumefaciens LB 4404, com o clone de DNA pmel1, correspondente à ACCO de melão, em orientação antisenso. Como tratamento controle foram utilizados frutos desta mesma variedade não transformada. O cultivo foi conduzido em casa de vegetação, no período de outubro de 1994 a março de A semeadura foi realizada em solo previamente autoclavado a 115 C por 40 minutos, durante a primeira quinzena do mês de outubro de 1994 e o transplante das mudas, foi efetuado 30 dias após. Para o cultivo, seguiram-se as recomendações gerais para a cultura do tomateiro, ou seja, irrigação, fertilização, desbaste, amontoa, tutoramento e aplicação preventiva de fungicidas (8) Duração do ciclo de maturação dos frutos A duração do ciclo de maturação foi estudada em frutos de tomateiro transformados e não transformados, amadurecidos na planta e após a colheita. No primeiro caso, os frutos foram identificados quando atingiram o estádio verde-maduro e mantidos na planta durante todo o ciclo. Já, no segundo caso,

8 os frutos foram colhidos no estádio verde-maduro e amadurecidos à temperatura de 20±5 C. Para a identificação dos estádios de maturação dos frutos, adotou-se, por base, uma escala de coloração, previamente descrita por Pratt & Workman (22), ainda amplamente utilizada como método de caracterização dos estádios de maturação de tomate (4, 11, 15). O experimento foi conduzido segundo um esquema fatorial 2x2 (genótipo x sistema de maturação), completamente casualizado, com 10 repetições Produção de etileno dos frutos As amostras de tomate, contendo aproximadamente 500g de frutos, no estádio vermelho, foram acondicionadas em frascos de 5 L, hermeticamente fechados, durante 1 h. Transcorrido este período, coletou-se1 ml da atmosfera gasosa, com a ajuda de uma seringa hipodérmica, para a dosagem do etileno. O etileno produzido foi expresso em nanolitros.grama -1.hora- 1 (nl.g -1.h- 1 ). O experimento foi conduzido em esquema fatorial 2x2 (genótipo x sistema de maturação), completamente casualizado, com 3 repetições Análise estatística Os dados obtidos foram submetidos à análise de variância, segundo o delineamento experimental de cada ensaio, sendo utilizado o teste de Duncan aos níveis de 1% e 5% de probabilidade, para a comparação múltipla das médias. 3 - RESULTADOS E DISCUSSÃO Duração do ciclo de maturação dos frutos A Figura 1 mostra a duração dos ciclos de maturação de frutos de tomateiros transformados e não transformados, amadurecidos na planta. Quando compara-se os ciclos de

9 maturação destes tomates, verifica-se que ambos atingem a senescência em torno de 30 dias após atingirem o estádio verde-maduro. A menor produção de etileno verificada nos frutos de tomate transformados (Figura 3), não proporcionou efeito benéfico no prolongamento da vida útil destes frutos. Todos os frutos desenvolveram normalmente a coloração avermelhada, bem como as demais características facilmente detectáveis, como evolução de aromas e amolecimento.

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11 Na Figura 2, está apresentada a duração dos ciclos de maturação de frutos de tomateiros transformados e não transformados, colhidos no estádio verde-maduro. Se por um lado, a passagem do estádio verde-maduro para o vermelho se deu num período médio de 12 dias, para ambos os frutos, a partir de então, os frutos oriundos de plantas transformadas apresentaram uma vida útil significativamente (p,05) maior do que a verificada nos frutos não transformados. Assim, os frutos de plantas não transformadas apresentaram características evidentes de senescência 10 dias após o estádio vermelho, enquanto os transformados só atingiram este estádio 37 dias após o estádio vermelho. Considerando-se a evolução do ciclo total, observa-se que os tomates colhidos de plantas transformadas têm uma vida útil

12 de 50 dias após a colheita no estádio verde-maduro, enquanto os não transformados têm este período reduzido a 20 dias. A análise conjunta dos dados apresentados nas Figuras 1 e 2 indica que para haver prolongamento significativo da vida útil dos tomates transformados, há necessidade de se colher os frutos no estádio verde-maduro. Mais especificamente, frutos transformados amadurecidos na planta tiveram um ciclo total médio de 27 dias, enquanto que os amadurecidos após a colheita, tiveram este intervalo prolongado a 50 dias. Se para tomates transformados, a colheita é fundamental para que o ciclo de maturação seja prolongado, para os não transformados, obteve-se comportamento inverso. Quando amadurecidos nas plantas, estes frutos tiveram um ciclo médio total de 30 dias, enquanto que quando colhidos no estádio verde-maduro, este período foi reduzido a 20 dias. Outros trabalhos publicados (13, 15, 21, 23) e apresentados em congresso (12, 26) descrevem resultados semelhantes, mas as causas deste comportamento ainda não foram demonstradas. Em todos estes trabalhos buscou-se inibir a expressão de genes envolvidos na via de biossíntese do etileno. A redução da produção deste fitormônio foi obtida e houve um retardo da maturação quando os frutos foram colhidos (amadurecidos fora da planta), mas não quando eles permaneceram ligados à planta. Quando amadurecidos nas plantas, os frutos oriundos de plantas transformadas não apresentaram ciclo de maturação significativamente diferenciado daquele verificado em frutos não transformados (13, 21), muitas vezes amadurecendo até mais rapidamente (15, 21). Hamilton et al. (12), levantaram a hipótese de que o etileno produzido pelos frutos transformados mantidos nas plantas, ainda que em níveis muito baixos, seria suficiente para

13 provocar a maturação dos mesmos. Associa-se a isto, o fato de que há a manutenção de um sistema homeostático de translocação nos frutos mantidos nas plantas durante todo o ciclo (5). O trabalho de de Vries et al. (5) cita, ainda, que a diferença de comportamento entre frutos transformados amadurecidos na planta e após a colheita, poderia ser explicada pelo fato de que, em frutos de tomate, tipo cereja, mais de 90% do etileno produzido seria perdido pela cicatriz peduncular, diminuindo sua concentração interna. Isto poderia ser suficiente para eliminar o etileno mínimo necessário para o amadurecimento dos tomates transformados (5). Também Picton et al. (21), sugeriram que a manutenção dos frutos ligados à planta durante o processo de maturação permitiria a translocação para o fruto de um potencializador da maturação e/ou a exportação de um inibidor, especialmente no início do processo. No entanto, os autores não descreveram as moléculas envolvidas neste mecanismo. Pech et al. (19) e Ayub et al. (2) citam que as injúrias mecânicas e o estresse induzido pela colheita, induziriam, através de uma cadeia de transdução de sinais, genes da via de biossíntese do etileno, e a conseqüente aceleração do processo de maturação/senescência, nos frutos não transformados. Essa indução da produção de etileno causada por tal estresse, nos frutos transformados não ocorre devido à inibição do processo de tradução da ACC oxidase (2, 13). Oeller et al. (18), obtiveram tomateiros transformados com o cdna tacc2 correspondente ao gene LE-ACC2, que se expressa durante a maturação de tomates e faz parte da família multigênica que codifica a ACCO. Os frutos oriundos de plantas transformadas apresentaram uma forte inibição da síntese de etileno, acima de 99%, tendo-se verificado um prolongamento da vida útil dos mesmos, independentemente

14 do amadurecimento ocorrer na planta ou após a colheita. Ayub et al. (2), monitoraram o ciclo de maturação e a produção de etileno em melões transformados com o clone pmel1, em orientação antisenso, verificando que estes frutos apresentavam uma inibição total da produção de etileno. Isto proporcionou um prolongamento da vida útil dos melões transformados, tanto para aqueles amadurecidos na planta quanto para os amadurecidos após a colheita. De acordo com estes autores, o retardamento do processo de maturação só pode ser obtido com uma inibição da produção de etileno superior a 99% Produção de etileno dos frutos A Figura 3 mostra a produção de etileno de tomates transformados e não transformados, colhidos no estádio verdemaduro e amadurecidos a 20±5 C, e de tomates colhidos no estádio vermelho. Tanto o genótipo quanto o sistema de condução do processo de maturação, influenciaram significativamente a produção de etileno dos frutos. Assim, frutos oriundos de plantas não transformadas apresentaram uma produção média de etileno de 10, 46 nl.g -1.h -1, enquanto os frutos de plantas transformadas geneticamente, tiveram esta produção reduzida a valores médios de 0, 13 nl.g -1.h -1. Estes resultados indicam que a transformação genética, utilizando o clone pmel1 em orientação antisenso, foi eficiente para reduzir a produção de etileno. Este comportamento é explicado pela inibição da síntese da enzima ACC oxidase (23). A produção de etileno de tomates não transformados amadurecidos na planta e após a colheita no estádio verdemaduro foi de 9, 72 nl.g -1.h -1 e 11, 21 nl.g -1.h -1, respectivamente. Nestas mesmas condições, frutos provenientes de plantas transformadas produziram 0, 18 nl.g -

15 1.h -1 e 0, 08 nl.g -1.h -1. Isto indica que, pela transformação genética obteve-se uma redução da produção de etileno de 98% quando os frutos amadureceram ligados à planta. Esta redução aumentou para 99,3% quando realizou-se a colheita dos tomates no estádio verde-maduro e manteve-se os frutos a 20±5 C. A menor produção de etileno verificada em frutos transformados amadurecidos após a colheita pode ser explicada pelo fato de que a indução da produção de etileno causada pelo estresse provocado durante a colheita, não ocorre, devido à inibição do processo de tradução da ACC oxidase (2, 13). Associa-se a isto, o fato de haver uma difusão facilitada deste gás, pela cicatriz peduncular do fruto, diminuindo a concentração interna deste regulador de crescimento (5). A maior redução da produção de etileno explica o prolongamento do ciclo de maturação e a maior vida útil deste material (2, 18). Hamilton et al. (13), verificaram que uma redução da produção de etileno de 97%, não foi suficiente para prolongar o ciclo de maturação de tomates transgênicos mantidos ligados à planta. Em 1993, Klee (15) e Picton et al. (21), também obtiveram resultados similares. Ayub et al. (2) e Oeller et al. (18), citam que para haver um controle eficiente da maturação, há necessidade de que a produção de etileno seja reduzida em mais de 99%. A análise conjunta dos dados apresentados nas Figuras 1, 2 e 3, mostra que a utilização de um sistema heterólogo, pela transformação genética de tomateiro com o clone pmel1 de melão, em orientação antisenso, foi eficiente para reduzir a produção de etileno dos frutos maduros, mas não foi suficiente para prolongar a vida útil dos mesmos. Isto só foi possível, quando os frutos foram colhidos no estádio verde-maduro e

16 amadurecidos a 20±5 C. 4 - CONCLUSÕES Os resultados obtidos permitem concluir que a transformação genética de tomateiro, com um cdna heterólogo da ACC oxidase de melão (pmel1), em orientação antisenso, permite reduzir a produção de etileno dos frutos em mais de 98%. A redução da produção de etileno, verificada nos tomates transformados, é necessária, mas não é suficiente para prolongar o ciclo de maturação dos frutos. Para que isto ocorra, é preciso que se proceda à colheita dos frutos no estádios verde-maduro. 5 - REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS (1) ABELES, F. B., MORGAN, P. W., SALTVEIT, M. E. Jr. Ethylene in plant biology. 2. ed. San Diego: San Diego Academic Press, p. (2)AYUB, R., Bouzayen, M., Latché, A. et al. Expression of ACC oxydase antisense gene in melon. Plant Physiology Science, v. 108, n. 2, p. 150, (3) BALAGUÉ, C., WATSON, C. F., TURNER, A. J. et al. Isolation of a ripening and wound-induced cdna from Cucumis melo L., with homology to the ethylene-forming enzyme. Eur. J. Biochem., n. 212, p , (4) BARRET REINA, L. C., CHITARRA, M. I. F., CHITARRA, A. B. Choque a frio e atmosfera modificada no aumento da vida pós-colheita de tomates: 2 - coloração e textura. Ciência e Tecnologia de Alimentos, Campinas, v. 14, n. 1, p , (5) DE VRIES, H. S. M., HARREN, F. J. M., VOESENEK, L. A. C. J. et al. Investigation of local ethylene emission from intact cherry tomatoes by means of photothermal and

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20 Depto. Fitotecnia - Ponta Grossa - PR.