Enzimas de restrição ou endonucleases de restrição de tipo II. Descoberta Sistemas de modificação restrição Como actuam Aplicações

Transcrição

1 Enzimas de restrição ou endonucleases de restrição de tipo II Descoberta Sistemas de modificação restrição Como actuam Aplicações

2 Lise de bactérias após infecção fágica

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5 Sistemas de Restrição-Modificação X X Y X Y X Y X Y X Y Modificação e restrição de um vírus, controlado pelo hospedeiro

6 1) Modificação do DNA- METILAÇÃO Modificação do DNA METILAÇÃO 2) Principal dador dos grupos metilo: SAM (S-adenosil metionina) ATP SAM CH 3 activo Metionina S-adenosil-homocisteína CH 3 Homocisteína H 2 O

7 Exemplo de metilação

8 Metilações mais frequentes m6 A- N6-metiladenina m5 C- C5-metilcitosina m4 C- N4-metilcitosina hm5 C- C5-hidroximetilcitosina

9 Sistemas de Restrição-Modificação Tipo I- ex sistema EcoKI, que só clivam DNA NÃO METILADO Tipo II- consoante a enzima podem clivar DNA METILADO ou NÃO METILADO Tipo III Sistemas de Restrição (endonucleases) McrA- C*CGG McrB- G*C Mrr- C*AC e C*AG Só clivam sequências METILADAS Sistemas de Modificação (metilases sítio-específicas) Dam (N6) G*ATC Dcm (C5) C*CAGG e C*CTGG Só METILAM

10 Características das enzimas dos Sistemas de Modificação-Restrição de tipo I, II e III

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12 Sequências de reconhecimento das enzimas de restrição Tipo I EcoAI EcoKI StySPI GAGNNNNNNNGTCA AACNNNNNNGTGC AACNNNNNNGTRC Corte na mais de 1000 pb da sequência de reconhecimento que é bipartida e assimétrica Tipo II EcoRI BalI PstI G/AATTC TGG/CCA CTGCA/G Corte na, ou muito próximo da sequência de reconhecimento que é PALINDRÓMICA e de 4 a 8 pb Tipo III EcoP151 EcoPI HinfIII CAGCAG AGACC CGAAT Corte a pb a jusante da sequência de reconhecimento que é assimétrica e de 5 a 7 pb Locais de corte, se^quências de reconhecimento, locais de restrição N- A, C, G ou T; R- G ou A

13 Palíndromos RADAR MADAM IN EDEN I AM ADAM ESOPE RESTE ICI ET SE REPOSE 5 -GAATTC-3 3 -CTTAAG-5

14 Endonucleases de tipo II AccI Acinetobacter calcoaceticus AluI Arthrobacter luteus BamHI Bacillus amyloliquefaciens H EcoRI Escherichia coli HaeIII Haemophilus aegyptius Sau3AI Staphylococcus aureus 3A

15 Type II restriction enzymes

16 Natureza das extremidades geradas após corte com as enzimas de restrição, é determinada pelo lado da ligação fosfodiéster onde ocorre o corte 3 -OH 5 -P

17 Resultado da digestão do DNA com diferentes enzimas de restrição Extremidades cegas e coesivas (ou salientes) Extremidades 5 e 3 projectadas a 5 do eixo de simetria a 3 do eixo de simetria As mesmas extremidades coesivas, produzidas por diferentes enzimas de restrição

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20 Sistema de modificação-restrição das enzimas de tipo II (Exemplo) A enzima de restrição cliva na sequência de reconhecimento: aactgaattctcgac ttgacttaagagctg aactg ttgacttaa AATTCtcgac Gagctg A metilase de EcoRI (M.EcoRI), cataliza a transferência de grupos metilo de SAM para as adeninas marcadas com * na sequência de reconhecimento aact G A *A T T C tcgac ttga C T T *A A G agctg A modificação da adenina (A*) para 6-metiladenina, protege o DNA da clivagem pela EcoRI

21 Sistema de Modificação-Restrição Tipo I-I sistema EcoK HsdS Determinante da especificidade de HsdM e HsdR A mutação HsdS elimina a actividade de HsdM e HsdR HsdM DNA metilase Metila na sequência A N6 ACNNNNNNGTGC ou GC N6 ANNNNNNGTT O DNA isolado numa estirpe hsdm - é clivado num hospedeiro HsdR HsdR Enzima de restrição A ausência desta actividade permite a entrada de DNA propagado em estirpes ou fontes que não E. coli

22 Enzimas de Tipo I ligam-se à sequência alvo, metilando-a, ou clivando o DNA, consoante o estado de metilação deste Cliva DNA não metilado

23 Genótipos e fenótipos de mutantes hsd no sistema EcoK GENÓTIPO hsds hsdr hsdm FENÓTIPO r + m + r - m - r - m + r - m - A subunidade HsdM é indispensável à função de restrição por HsdR

24 Sistema de Modificação Metilação Dam Metilação Dam: G m6 ATC (grupo metilo na posição N6 da adenina: N6-metiladenina ) 1- Enzimas de restrição de tipo II (ex.), bloqueadas por metilação Dam ClaI XbaI MboI G*ATCGAT TCTAG*ATC G*ATC 2- Enzimas de restrição de tipo II (ex.), não bloqueadas por metilação Dam BamHI PvuI GG*ATCC CG*ATCG Sau3AI G*ATC A negrito- a sequência de reconhecimento da enzima de restrição de tipo II

25 Uma sequência de DNA pode sofrer diferentes metilações, adquirindo diferentes padrões de metilação, consoante a especificidade das metilases da célula Ex. G m6 ATC (Dam) GAT m5 C GAT m4 C GAT hm5 C As enzimas de restrição podem apresentar diferentes sensibilidades aos diversos padrões de metilação Ex: Sau3A1 Diferentes padrões de metilação vs diferentes sensibilidades de clivagem CLIVA G m6 ATC NÃO CLIVA GAT m5 C GAT m4 C GAT hm5 C

26 Enzimas de restrição tipo II, com diferente sensibilidade à metilação DpnII não CLIVA CLIVA DpnI GATC G m6 ATC GATC CTAG CT m6 AG CTAG Sau3AI CLIVA GATC CTAG G m6 ATC CT m6 AG DpnI só corta sequência de reconhecimento quando metilada DpnII não metilada Sau3AI metilada e não metilada

27 CLIVA DpnI DpnII GATC NÃO CLIVA SÓ CLIVA NÃO CLIVA GATC G*ATC Metilase GAT C Protecção da Restrição As estirpes de Diplococcus pneumoniae que produzem DpnI e DpnII terão que possuir padrões de metilação adequados à protecção da restrição por cada uma destas enzimas G*AT C

28 Aplicação das enzimas de restrição de tipo II DNA cloning

29 DNA cloning... One of the most important goals of recombinant DNA technology is to clone a particular gene of interest or other DNA fragment of interest The approach used to clone a specific gene, depends to a large degree on: the gene what is known about it objective Among the several tools needed for cloning, lets consider: restriction enzymes vector DNA DNA ligase host cell

30 Isolating and cloning a DNA fragment

31 Construction of a recombinant DNA molecule

32 Reacção de ligação entre duas moléculas de DNA

33 VECTORS Central component of gene cloning experiments Two types of naturally ocurring DNA molecules: Plamids Bacteriophages Properties Self-replicating Unique restriction enzymes cleavage sites Selectable marker Easy to recover

34 Marcas importantes de um plasmídio Marca de resistência a um antibiótico para o qual a estirpe hospedeiro é sensível

35 Clones de um plamídio recombinante

36 Bacteria cell transformation Introduction of recombinant DNA molecules into a host (ex. E. coli) Different procedures: inducing competence (CaCl 2, MgCl 2, Licl) electroporation

37 Transformed cells are isolated in SELECTION MEDIA (a) Introduction of free DNA into bacterial cells (TRANSFORMATION) Competent bacterial cells + Recombinant DNA plasmid SELECTION MEDIA

38 Recombinant DNA clones Non-recombinant DNA plasmid. Bacteria cells harbouring this plasmid will grow, but won t be recombinant clones Ex. ANTIBIOTIC selection of plasmid DNA (recombinant and non-recombinant) Each colony, a large number of cells, results from one initial single cell Cell divides and vectors are passed to progeny Each colony is a CLONE, ie, contains identical copies of recombinant DNA molecules

39 Within the host, vector directs the copy number of recombinant DNA molecules.

40 Características dos hospedeiros vs metilação Ex. DNA recombinante amplificado numa estirpe Dam G*ATC G*ATC CT*AG G*ATC CT*AG MboI GATC não cliva G*ATC CTAG sequências metiladas CT*AG Sau3AI GATC cliva G*ATC CTAG sequências metiladas CT*AG

41 Características dos hospedeiros vs metilação Ex. DNA humano *CpG Clonagem em estirpes (mutantes em Sistemas de Restrição) mcra - mcrbc - McrA- C m5 CGG McrBC- G m5 C G h5 C G N4 C

42 Isoesquizómeros 1- Reconhecem a mesma sequência e clivam nos mesmos locais AccIII BspEI TCCGGA AGGCCT TCCGGA AGGCCT Extremidades compatíveis com XmaI CCCGGG GGGCCC 2- Reconhecem a mesma sequência mas clivam em locais diferentes Acc65I GGTACC XmaI CCCGGG CCATGG GGGCCC KpnI GGTACC SmaI CCCGGG CCATGG GGGCCC 3- Reconhecem a mesma sequência mas apresentam diferente sensibilidade à metilação DpnII e MboI não clivam G*ATC metilado vs Sau3AI cliva G*ATC metilado DpnI cliva G*ATC metilado vs MboI não cliva G*ATC não metilado e ainda clivam em locais diferentes

43 Posso amplificar DNA humano numa estirpe de E. coli mcra - e mcrbc - e posteriormente clivá-lo com MspI? E com HpaII? Porquê? MspI e HpaII são isoesquizómeros, mas HpaII é bloqueada pela metilação em CG, realizada nos mamíferos e pelas enzimas de modificação Dcm. MspI- não é sensível à metilação, Dcm ou metilação CpG dos mamíferos, ie, C m5 CGG. No entanto não cliva em m4 CCGG, m5 CCGG, C m4 CGG e hm5 C hm5 CGG HpaII- não cliva em C m5 CGG, m4 CCGG, m5 CCGG, C m4 CGG e hm5 C hm5 CGG

44 Metilação em organismos eucariotas- um outro significado biológico Mto variável consoante o organismo em causa. Ex. Drosophila- DNA não metilado Geralmente a metilação está associada a mecanismos de silenciamento génico REGULAÇÃO EPIGÉNICA Alteração da expressão génica que não se deve a alterações na sequência de DNA, mas a algo que a somar à sequência de DNA, influi a expressão génica, como seja: - modificação de bases - factores proteicos que se ligam ao DNA