PESQUISA DE MOTIVOS. Relatório 3. Ana Calhau Ângela Pisco Nuno Santos

Transcrição

1 Disciplina de BIOLOGIA COMPUTACIONAL Mestrado em ENGENHARIA BIOMÉDICA 4º Ano, 1º Semestre 2007/08 PESQUISA DE MOTIVOS Relatório 3 Ana Calhau Ângela Pisco Nuno Santos Palavras-Chave: Pesquisa de Motivos, Perfil, Consenso, MEME, RISO, MUSA, Força bruta Resumo Com este trabalho pretendeu-se ultrapassar o problema da identificação de motivos nas regiões promotoras de genes, genes esses envolvidos na possível ligação a factores de transcrição (FT) que modulam as alterações da expressão genética. Numa primeira abordagem identificaram-se os motivos recorrendo-se a conceitos teóricos. Observou-se ainda o logo dos motivos utilizando o programa WebLogo. Numa segunda abordagem, pretendeu-se analisar um conjunto de regiões promotoras da bactéria Pseudomonas putida KT2440 recorrendo-se agora a um conjunto de algoritmos de identificação de motivos disponibilizados pelo MEME, RISO e MUSA, tendo ficado evidentes as suas potencialidades e limitações. Por último, implementou-se o algoritmo de força bruta para resolver o problema de Motif Finding, tendo-se tentado encontrar os parâmetros óptimos. 1. MOTIVOS: PERFIL E CONSENSO Considerou-se a seguinte tabela, que contém 10 padrões que representam um motivo de tamanho L=8: Tabela 1 Padrões representativos de um motivo de tamanho Construção de um alinhamento de todas as instâncias do motivo representado Sendo um motivo um conjunto de subsequências de comprimento fixo e sabendo que o motivo pretendido tem tamanho L=8, as instâncias do motivo, bem como o alinhamento destas são:

2 Pesquisa de Motivos Figura 1 Alinhamento de todas as instâncias do motivo 1.2 Representação do motivo utilizando um perfil O perfil consiste na construção de uma matriz que evidencia a variabilidade da composição de nucleótidos para cada posição, tendo em conta uma escolha particular de motivos. Desta forma, obtém-se: Tabela 2 Representação em perfil do motivo A C T G Representação do motivo utilizando uma sequência de consenso Após a determinação do perfil, é possível estabelecer qual a sequência consenso, podendo esta ser vista como um motivo ancestral, a partir do qual os motivos mutados emergem. Esta sequência apresenta em cada posição o nucleótido com o score mais elevado. Por esta razão, com base nas instâncias dos motivos seleccionadas, é possível encontrar mais do que uma sequência consenso, pois para cada posição existem nucleótidos com igual frequência. Assim, encontraram-se as seguintes sequências consenso: ACTCATGG AATCATGG ACGCATGG AAGCATGG Figura 2 Sequências consenso 2

3 Ana Calhau Ângela Pisco Nuno Santos 1.4 Determinação da importância do perfil obtido, utilizando como medida de mérito a entropia A entropia define as frequências de ocorrência de cada nucleótido em cada coluna do alinhamento múltiplo efectuado. Desta forma, a entropia de um alinhamento múltiplo é definida pela soma da entropia de cada coluna. Concretamente para o nosso caso temos: (1) onde p x (j) corresponde à probabilidade de o nucleótido X surgir na posição j do perfil determinado. Coluna 1 = 0,7log 2 (0,7) + 0,1log 2 (0,1) + 0,2log 2 (0,2) = Coluna 2 = 0,5log 2 (0,5) + 0,5log 2 (0,5) = -1 Coluna 3 = 0,5log 2 (0,5) + 0,5log 2 (0,5) = -1 Coluna 4 = 0,2log 2 (0,2) + 0,8log 2 (0,8) = Coluna 5 = 0,8log 2 (0,8) + 0,2log 2 (0,2) = Coluna 6 = 0,1log 2 (0,1) + 0,2log 2 (0,2) + 0,5log 2 (0,5) + 0,2log 2 (0,2) = Coluna 7 = 0,9 log 2 (0,9) + 0,1 log 2 (0,1) = Coluna 8 = 1 log 2 (1) = 0 Assim, com base em (1), a entropia do perfil apresentado é de -6, Ao se utilizar como medida de mérito a entropia há que ter em conta que se esta for zero o alinhamento feito corresponde ao melhor possível e portanto o perfil apresenta a conservação máxima. Tal ocorre quando não existem mutações nas instâncias do motivo representado. Neste caso particular, o pior alinhamento possível corresponderia a uma entropia de -15,77 [(2*(0,2log 2 0,2)+2*(0,3log 2 0,3))*8], que ocorre quando os nucleótidos estão igualmente distribuídos por todas as colunas. Como a entropia obtida apresenta um valor mais próximo de 0 do que de é possível concluir que este perfil se encontra relativamente conservado, pelo que tem uma importância significativa. 1.5 Contrução de um Logo para o alinhamento de sequências utilizando o programa WebLogo O WebLogo é uma aplicação web que permite a criação de logos de forma fácil e simples. Estes logos são representações gráficas correspondentes ao alinhamento múltiplo de sequências de aminoácidos ou ácidos nucleicos e são formados por pilhas de símbolos (letras) em cada posição da sequência. Se se trata de uma região muito conservada, essa pilha será formada por poucos símbolos ou até mesmo só por um, se for pouco conservada é formada por vários. Além disso, se for uma zona muito conservada a pilha tem uma altura elevada, isto porque Altura da base k na posição i = P k (i)d(i) (2) em que D(i) é a entropia de Shannon na posição i. A frequência relativa de cada aminoácido ou ácido nucleico, em cada posição, é dada pela altura do símbolo que lhe corresponde. 3

4 Pesquisa de Motivos Figura 3 Representação de um logo resultante do alinhamento múltiplo de sequências 1 Pela análise do logo apresentado, é possível observar que a posição 8 é a posição mais conservada, seguida da posição 7 e depois das posições 4 e 5. A posição 2 apresenta igual quantidade de adeninas e citosinas e a posição de 3 igual quantidade de timinas e guaninas. A posição 1 apresenta maior quantidade de adeninas mas também se verificam outros nucleótidos como citosinas e timinas. Na posição 6 embora não se observe qualquer nucleótido, tal é enganador. Se se ampliasse esta imagem, no weblogo, começaria a ser visível a letra e cor correspondente à timina (o T vermelho). Nesta posição se não se tiver uma timina, tem-se uma citosina ou uma guanina as quais têm igual probabilidade. Como o tamanho de cada base no logo é determinado por (2), T não surge com uma grande expressão. Este tipo de representação permite uma descrição mais precisa e rica, face às representações anteriores, podendo revelar rapidamente características importantes do alinhamento, que de outra forma seriam difíceis de perceber. Uma grande vantagem é a fácil intuição da sequência consenso do alinhamento dos motivos, já que é bastante rápido identificar visualmente as bases mais comuns para cada posição. 1.6 Cálculos Considerando que a probabilidade de uma dada sequência (de tamanho L=8) estar a uma distância de Hamming 1 da sequência consenso encontrada é o número de vezes que se espera encontrar uma sequência a uma distância de Hamming igual a 1 numa sequência de tamanho é igual a Quanto ao número de vezes que se espera encontrar exactamente esta sequência de consenso (distância de Hamming igual a 0) numa sequência de tamanho , este rondará os 1 Figura retirada de [2] 4

5 Ana Calhau Ângela Pisco Nuno Santos 2. FERRAMENTAS PARA PESQUISA DE MOTIVOS A bactéria que serviu de modelo a este estudo foi Pseudomonas putida KT2440, cujo genoma está já sequenciado. Nos estudos de sequências desta bactéria foi identificada uma sequência consenso, reconhecida pela RNApolimerase, com o factor sigma alternativo σ 54. O que se pretende nesta parte do trabalho é identificar, recorrendo a três métodos diferentes de pesquisa de motivos, a sequência consenso, reconhecida pelo factor σ 54. Para tal analisou-se um conjunto de sessenta e nove regiões promotoras, de forma a poder concluir-se qual é a sequência consenso à qual se liga este factor de transcrição. A sequência consenso que se pretende identificar é mrnrtggcacg-n4-ttgcwnnw [3]. 2.1.MEME O MEME [4] é um modelo estatístico, bastante utilizado na identificação de regiões conservadas, em sequências desalinhadas de DNA (e também de proteínas). As sequências em estudo são partidas em subsequências de tamanho n. São identificadas as subsequências semelhantes, sendo as sequências originais alinhadas de forma a que as subsequências candidatas a motivo fiquem alinhadas. O algoritmo, após este processo inicial, consiste em dois passos. O primeiro, expectation step, consiste em utilizar a composição, coluna a coluna, do local para estimar a probabilidade de encontrar a base em questão em qualquer posição de cada sequência. No segundo passo, maximization step, as bases encontradas para cada posição do local são substituídas pelo conjunto encontrado no passo anterior. Submeteu-se o ficheiro que se pretendia testar, deixando todos os parâmetros com os valores pré-definidos. Obtiveram-se três motivos, abaixo indicados. Figura 4 Motivos obtidos com o algoritmo MEME 2 Tabela 3 Resultados fornecidos pelo MEME em relação ao tempo que demorou a pesquisa do motivo e também em relação à expressão regular do motivo. Motivo Regular expression Tempo (segundos) 1 G[CT]TGGCA[CT][GA][GC][GCT][TCG]CTTGCT 458,85 2 [CG][CG]T[CG]TTCGCGGG[TC][AG][AC][AG]CCCGCTCC[TC]AC[AG][GAC] 910,07 3 G[GC]C[CT][CT][CT]TTC[GA]CGGG[CT]A[AT][GA]CCCGC[TG]CC[CT]AC 1359,63 Por análise da tabela é possível concluir que quanto maior o motivo, mais tempo demora a 2 Imagem extraída de [4] 5

6 Pesquisa de Motivos ser compilado pelo algoritmo. As bases entre parêntisis rectos são as possíveis, de acordo com a sequência consenso do motivo, para a posição correspondente. 2.2.RISO Este algoritmo é do tipo combinatório [5]. Utiliza uma estrutura de dados diferente da anterior, que são caixas ligadas (boxs), nas quais é guardada a informação sobre as regiões conservadas. Este tipo de regiões conservadas, designadas por motivos estruturados, são extremamente relevantes na pesquisa por mecanismos regulatórios de genes. Com este método é possível encontrar motivos complexos, distanciados entre si de um número variável de pares de bases. Em termos do modelo, tal corresponde a ter mais do que uma box, onde o espaço que separa as boxs consecutivas é variável e possível de definir pelo utilizador, bem como o tamanho de cada caixa do motivo. Tem uma desvantagem muito significativa, que é a necessidade de introduzir muitos parâmetros, os quais na maioria dos casos não são conhecidos à partida, tais como o tamanho dos motivos, o número de erros permitidos e ainda o número de caixas pelas quais é constituído o motivo. Foi carregado o mesmo ficheiro e utilizados os parâmetros abaixo indicados. Todos os restantes foram deixados com o valor de default. Figura 5 Parâmetros fornecidos ao algoritmo RISO O resultado obtido encontra-se na figura seguinte. Figura 6 Resultados obtidos com o algoritmo RISO Tentou fazer-se uma pesquisa mais genérica, na qual se estendiam as boxs às partes em que o consenso que se pretende encontrar não está bem definido. No entanto este resultado não se 6

7 Ana Calhau Ângela Pisco Nuno Santos consegue analisar, pois o ficheiro de output excede o limite permitido pelo programa. Os resultados obtidos apresentam bastante relevância estatística, como se pode constatar pelos valores de Chi2 e Z-Score. Nada garante, porém, que esta relevância estatística seja também importância biológica. Há que constatar que o primeiro resultado, ou seja, aquele que reuniu um maior consenso, é exactamente o que se pretendia encontrar. Por outro lado a obtenção do resultado foi bastante rápida, sustentando-se assim a descrição feita do algoritmo [5]. 2.3.MUSA Este modelo de pesquisa é também um algoritmo do tipo combinatório [6]. O que faz é procurar por motivos simples e estruturados num dado conjunto de sequências de DNA. A sua grande vantagem é que não precisa de detalhes sobre a estrutura do motivo complexo para fazer a pesquisa. Pode ser utilizado tanto para pesquisa de motivos complexos, como para estimar parâmetros de pesquisa para outros algoritmos. Consiste num algoritmo de biclustering, que opera numa matriz de co-ocorrências de pequenos motivos. O método é independente da estrutura do motivo, já que faz poucos compromissos com as suas características. O algoritmo foi testado para o conjunto de promotores que se encontra em estudo neste trabalho e os resultados obtidos indicaram que esta abordagem é bastante exacta na identificação de motivos complexos com significância biológica [6]. Concretamente nesta situação o que se fez foi carregar o mesmo ficheiro que no ponto anterior. Está indicado na figura seguinte o resultado, de forma parcial. Figura 7 Resultados obtidos com o algoritmo MUSA O tempo gasto na obtenção deste resultado foi estimado à volta dos 900 segundos, bastante mais do que o necessário para o RISO. 2.4.Comparação dos resultados Tal como tem vindo a ser discutido ao longo desta secção, os resultados obtidos pelos três algoritmos estão bastante próximos do esperado. É importante ter em linha de consideração que os algoritmos combinatórios, apesar de por vezes mais lentos, são mais exactos que os estatísticos. O melhor resultado (melhor relação solução vs tempo) foi obtido com o algoritmo RISO, para o qual se considera que o motivo mais relevante é aquele que dá exactamente o pretendido, isto é, coincide exactamente com a região mais conservada do motivo que se 7

8 Pesquisa de Motivos pretendia identificar. Para o MEME assume-se que o motivo mais relevante é o primeiro. São duas as razões que sustentam esta afirmação. Por um lado é aquele que apresenta maior número de bases semelhantes com a sequência consenso que se pretende identificar. Por outro é o que apresenta o menor valor-e. O valor-e de uma sequência é o número expectável de sequências existentes numa base de dados aleatória com o mesmo tamanho e que terão os mesmos motivos correspondentes que a sequência em estudo tem, pelo que quanto menor o seu valor, menor essa probabilidade e mais importante é o motivo. O algoritmo MUSA apresenta uma vantagem, já acima referida, face aos dois anteriores, que é não precisar que se definam os parâmetros do modelo à partida. Estes parâmetros aqui estimados podem por exemplo ser utilizados no RISO, já que este algoritmo é bastante exigente neste aspecto. O quarto resultado apresentado por este método é bastante próximo daquele que se pretendia. O valor-p para este motivo é bastante pequeno. O valor-p de um score é definido como a probabilidade de que uma sequência aleatória do mesmo comprimento contenha correspondências com score igual ou maior. Em termos do significado biológico que as sequências obtidas contêm, há que ter em conta duas situações, dado que os motivos obtidos são ordenados por ordem decrescente da sua relevância nos testes estatísticos. A significância estatística, em termos gerais, determina a probabilidade do motivo considerado ser encontrado numa sequência aleatoriamente gerada. Por um lado, nem todos os resultados estatisticamente significativos são biologicamente relevantes, dado que pelo motivo não aparecer numa sequência random, isso não quer dizer que seja importante ao nível da informação biológica que codifica. Por outro lado, existem motivos biologicamente importantes que surgem com grande probabilidade em sequências random, razão pela qual não têm significância estatística, sendo descorados a priori. Há ainda um outro aspecto a focar, que é a ausência de caixas TATA com relevância estatística. Tal deve-se ao que foi dito no parágrafo acima. No entanto era expectável ter sido encontrado uma maior número, já que o conjunto analisado é um conjunto de promotores, que por definição têm sequências TATA. 3. ALGORITMO PARA PESQUISA DE MOTIVOS Entre os genes presentes num genoma, existem segmentos de cadeias de DNA que possuem uma ou várias zonas semelhantes entre si, designados por motivos. O desejo de encontrar esses motivos, isto é, de solucionar o problema de Motif Finding, foi a motivação do algoritmo de força bruta. Este algoritmo consiste em encontrar um motivo de tamanho L em várias sequências de DNA (T amostras), de tamanho N cada uma, de forma unívoca. Para isso, o método considera todas as combinações de motivos existentes entre as várias sequências de DNA, calcula o score de cada uma e extrai o melhor entre elas. Desta última, obtém a sequência consenso, extraindo também os índices correspondentes ao nucleótido onde inicia cada motivo nas diferentes sequências. Apesar deste algoritmo retornar um valor exacto, na medida em que o resultado possui o score mais elevado de todos os possíveis, o seu tempo de execução é computacionalmente bastante pesado, uma vez que é da ordem de O ( L N T ). Em cada sequência, o algoritmo fixa-se num determinado nucleótido i e constrói o motivo, a partir dele até ao nucleótido i + L -1. Assim, para cada sequência, o algoritmo faz N L + 1 operações, mas como existem T sequências, no total fará (N-L+1) T operações. A estas operações simples incluem-se a determinação do score, assim como o alinhamento e a determinação do motivo consenso. Por serem operações finitas, ou seja, o seu número ser constante à medida que o algoritmo decorre, não têm influência na ordem de grandeza do método. No entanto, estas operações são feitas L vezes, uma vez que o motivo tem esse tamanho. Desta forma obtém-se a ordem de grandeza referida antes. De forma a completar este raciocínio, decidiu testar-se computacionalmente o algoritmo de 8

9 Ana Calhau Ângela Pisco Nuno Santos força bruta. Para isso, este foi implementado no software MatLab. Na tabela seguinte são apresentados os valores temporais de duração da execução do algoritmo para os diferentes valores de N, T e L. Tabela 4 Estudo do desempenho do algoritmo com a variação dos parâmetros do sistema N T L Tempo (s) Tempo (min) Através dos valores obtidos foi possível construir três gráficos de relação N/T/L versus tempo, e assim confirmar o seu tempo de duração Figura 8 Representação dos pontos e do gráfico da interpolação desses pontos, cuja relação é N com o tempo, em segundos. A interpolação foi obtida em software Mathematica, tendo como funções de base 1, x, x 2 e x 3. 9

10 Pesquisa de Motivos Figura 9 Representação dos pontos e do gráfico da interpolação desses pontos, cuja relação é L com o tempo, em segundos. A interpolação foi obtida em software Mathematica, tendo como funções de base 1 e x Figura 10 Representação dos pontos e do gráfico da interpolação desses pontos, cuja relação é T com o tempo, em segundos. A interpolação foi obtida em software Mathematica, tendo como funções de base 1 e 25 x. Por análise dos gráficos, facilmente se observa um crescimento polinomial, de grau 3 (pois a análise foi feita com T = 3) ao se aumentar N, e um crescimento exponencial, de base 25 (valor do N), aquando do aumento de T. Relativamente à figura 9, esperar-se-ia um crescimento linear do tempo de execução. No entanto este diminui sempre, lentamente para L próximo da unidade e com maior gradiente para L próximo de N. Uma vez que a parcela N T tem uma componente que varia com L (de facto tem-se (N L +1) T, como já foi referido), em ordens de grandeza equivalentes o L torna-se significativo e faz diminuir a base N L + 1. Neste caso específico em que se considerou N = 50, a contribuição do L no produto com (N L + 1) T é menor que a sua influência na base. Assim, à medida que o L aumenta, o tempo de execução diminui. Uma hipótese para uma melhor visualização do comportamento linear positivo, ou seja, tornar a contribuição do L na base desprezável, seria escolher valores de forma a ter N >>> L, o que em contra partida tornaria o tempo de execução do algoritmo bastante elevado, razão pela qual não foi testado. 10

11 Ana Calhau Ângela Pisco Nuno Santos Através dos resultados obtidos, é possível chegar a uma conclusão do dimensionamento dos parâmetros considerados, tendo em conta a sua utilidade como algoritmo de pesquisa de motivos. Para tal considera-se que o algoritmo é bem dimensionado desde que o seu tempo de execução não ultrapasse 1 hora, visto que existem outras soluções mais rápidas e quase tão exactas como este método. É preciso ter em atenção que os tempos de execução variam com o processador e por isso dimensiona-se os parâmetros de forma subjectiva em forma de intervalos. O comprimento máximo das cadeias de DNA (N) deverá rondar entre os 250 e os 400 nucleótidos, para se poder ter até 4 a 6 sequências (T). No que toca ao tamanho do motivo (L), este poderá ser qualquer valor dentro da gama de N, visto que para sequências pequenas, o seu tempo de execução não varia muito, baixando mesmo para valores de L próximos de N. O ficheiro teste (promotores.txt) possui 4 cadeias de DNA, tendo cada uma 50 nucleótidos. Ao se testar o algoritmo para este ficheiro, e procurando com L = 7, encontra-se o motivo consenso ACGTATT. Este é formado pelos motivos: acgtatt a partir dos nucleótidos 26, 21, 3 e 38 das sequências 1, 2, 3 e 4 respectivamente. Este alinhamento cria assim um score de CONCLUSÃO A pesquisa de motivos é um tema bastante actual. Do ponto de vista biológico reveste-se de toda a importância na medida em que permite inferir regiões reguladoras, que por terem um papel tal que não pode ser descurado, são mantidas durante toda a evolução. Por outro lado permite ainda inferir relações filogenéticas, já que a sequência consenso é encarada como um motivo ancestral, do qual emergem todos os restantes motivos. A utilização da entropia como medida de mérito da representação em perfil é bastante adequada, já que a entropia varia linearmente com a ordem da representação em perfil, pelo que quanto maior a entropia, mais conservado é o motivo, e consequentemente mais importante. Mais uma vez pôde constatar-se que existem inúmeras ferramentas disponíveis on-line, as quais permitem fazer praticamente todos os tipos de testes pretendidos de forma simples e mais ou menos rápida. Foram utilizadas apenas três, duas das quais são bastante recentes, o que mostra que esta área está ainda em grande expansão. O algoritmo de força bruta implementado, apesar de dar como output o melhor resultado, não é utilizável para um elevado número de sequências, já que a complexidade neste parâmetro é exponencial, de base n, com n correspondente ao comprimento de cada sequência de DNA. 5. BIBLIOGRAFIA [1] Freitas, Ana T., Pesquisa de Motivos, Guia do 3º Laboratório de Biologia Computacional, Outubro de 2007 [2] T.D. Schneider and R.M. Stephens Sequence Logos: A New Way to Display Consensus Sequences. Nucleic Acids Res. 18: [3] Barrios H, Valderrama B., Morett E. (1999) Compilation and analysis of σ 54 - dependent promoter sequences. Nucleic Acids Research 27: [4] Timothy L. Bailey and Michael Gribskov, "Combining evidence using p-values: application to sequence homology searches", Bioinformatics, 14(48-54), 1998 [5] Carvalho A. M. and Freitas A. T. and Oliveira A. L. and Sagot M-F, An Efficient Algorithm for the Identification of Structured Motifs in DNA Promoter Sequences, IEEE Transactions on Computational Biology and Bioinformatics, 3(2), pp , Apr [6] Mendes N.D., Casimiro A.C., Santos P.M., Sá-Correia I., Oliveira A.L., Freitas A.T., MUSA: A parameter free algorithm for the identification of biologically significant motifs, Bioinformatics 22, ,