I - Bioquímica. Saliva. Curso de Bioquímica da Cárie Dental. descamativas, bactérias e produtos bacterianos, além de outros componentes INTRODUÇÃO

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1 Curso de Bioquímica da Cárie Dental I - Bioquímica da Saliva CARLOS EDUARDO PINHEIRO(*) 40 INTRODUÇÃO A saliva é um líquido secretado pelas glândulas salivares diretamente na cavidade bucal. Seu maior componente é a água, que chega a ocupar aproximadamente 99% de seu peso, sendo o restante formado por componentes orgânicos e minerais que constituem a parte sólida da saliva. Várias são as glândulas que contribuem para a formação da saliva, sendo que no homem e na maior parte dos animais existem três pares de glândulas maiores, ou seja, parótidas, submandibulares, sublinguais e por inúmeras glândulas menores, localizadas principalmente na mucosa bucal. Ao conjunto das diversas secreções glandulares que se juntam dentro da cavidade bucal deu-se o nome genérico de saliva mista. Na verdade, a saliva mista contém, além das secreções glandulares, componentes estranhos como fluído gengival, células (*) Professor Titular do Departamento de Bioquímica Faculdade de Odontologia de Bauru da Universidade de São Paulo. descamativas, bactérias e produtos bacterianos, além de outros componentes variáveis. As salivas secretadas por cada par de glândulas maiores só são obtidas por meio da canulação de seus ductos excretares. As salivas individuais, isto é, as secretadas por cada par de glândulas, diferem entre si tanto na proporção de volume secretado quanto em sua composição química, dependendo da existência ou não de estímulos como também da natureza e intensidade dos mesmos. A saliva é muito impo rtante para o meio bucal como também para o próprio organismo. Costuma-se atribuir geralmente à saliva um papel digestivo e excretor. A saliva contém a enzima amilase, capaz de hidrolizar o amido contido nos alimentos, transformando-o em dextrina, maltose e glicose. Contudo, como o tempo de permanência do alimento na cavidade bucal é diminuto, o papel digestivo desta enzima é relativamente insignificante. Não obstante, a atividade amilolítica da saliva atua continuamente sobre os amiláceos Revista Paulista de Odontologia 4

2 que permanecem aderidos à superfície dos dentes, nos espaços existentes entre os mesmos, favorecendo a remoção de restos alimentares retentivos, pela transformação destes em produtos mais solúveis. Além da atividade enzimática, a saliva contribui para o processo digestivo, lubrificando o bolo alimentar e, desta forma, facilitando sua mastigação e deglutição. Inúmeras substâncias nocivas ao organismo e alguns medicamentos são excretados pela saliva, que assim funciona como um veículo de desintoxicação. A saliva desempenha função de proteção do meio bucal, mediante a ação de substâncias antibacterianas, como também participa na manutenção do equilíbrio hídrico, regulando a excreção de líquido do organismo. A Composição química da saliva Os componentes químicos da saliva, não obstante a mesma ser constituída por aproximadamente 99% de água, são essenciais para o desempenho do papel fisiológico deste importante líquido. Através desses componentes menores, a saliva provê uma cobertura orgânica às mucosas e dentes; promove a lubrificação dos alimentos; favorece a remineralização das superfícies dos dentes comprometidos pela cárie e, também, ativa a acuidade gustativa. E principalmente devido ao conteúdo de bicarbonato que a saliva exerce seu poder tampão, isto é, a capacidade de manter o ph constante, frente as contínuas variações químicas do meio bucal. Finalmente, é através de seus componentes químicos que a saliva protege os tecidos bucais de agentes microbianos, normalmente existentes na cavidade bucal. A.1 Componentes orgânicos Sem dúvida alguma, os componentes mais abundantes e importantes da saliva são as proteínas. As proteínas são classificadas preponderantemente de acordo com suas caracteristicas químicas e atividades biológicas. PROTEINAS SALIVARES RICAS EM PROLINA As características químicas imprimidas às proteínas por este aminoácido (iminoácido!) são de rigidez estrutural, isto é, determinadas estruturas adquiridas pelas moléculas protéicas que lhe conferem maior resistência ou estabilidade às mudanças conformacionais. Exemplo típico desta classe de proteínas é o colágeno, que serve de suporte estrutural ao tecido conjuntivo. Na saliva, as espécies moleculares encontradas são representadas pelas fosfoproteínas, glicoproteínas ácidas e básicas e mucinas. Os principais papéis fisiológicos dessas proteínas são os de formarem coberturas orgânicas sobre super fícies das mucosas e dos dentes, além de envolverem os alimentos, lubrificando-os e favorecendo sua mastigação e deglutição. Estas proteínas apresentam regiões moleculares com alta densidade de cargas elétricas negativas (geralmente resíduos de ácidos aspártico e glutâmico), o que lhes facilita a aderência às superfícies dos tecidos orais. As fosfoproteínas, proteínas de baixo peso molecular ( daltons), além dos constituintes ácidos da classe, possuem radicais de ácido fosfórico ligados às hidroxilas da serina e treonina das cadeias polipeptídicas. Decorrente da concentração relativamente alta de radicais ácidos, estas proteínas apresentam grande afinidade pela hidroxiapatita, sendo um dos principais contribuintes da película adquirida, filme orgânico que se forma rapidamente sobre as superfícies dos dentes. As fosfoproteínas também estão implicadas nos processos de remineralização do esmalte e na estabilização da concentração supersaturada dos íons de cálcio e fosfato da saliva. Em virtude de seus radicais ácidos, estas proteínas quando adsorvidas à superfície dos dentes, podem agregar os íons de cálcio da saliva em uma determinada região do esmalte, favorecendo termodinamicamente a precipitação desses íons sobre superfícies destruídas pela cárie ou agentes ácidos. Neste particular merece menção especial a estaterina, um tipo de fosfoproteína relativamente rica em tirosina e que possui grande afinidade pelos íons cálcio. O nome estaterina deriva do grego "Statheropio", que significa estabilizar. Este peptídeo é rico em tirosina, prolina e ácido glutânico, tendo um peso molecular de daltons e um ponto isoelétrico de 4,2. Os resíduos ácidos estão localizados na extremidade amino-terminal da cadeia polipeptídica. O mecanismo envolvido na estabilização dos íons cálcio e fosfato da saliva é semelhante ao já mencionado para a remineralização, contudo, neste caso, as fosfoproteínas estão em solução, aderidas aos agregados iniciais de fosfato de cálcio, impedindo assim o seu crescimento. PROTEINAS SALIVARES RICAS EM AMINOACIDOS AROMÁTICOS Proteínas pertencentes a este grupo geralmente possuem função especializada. A estaterina foi fo- Revista Paulista de Odontologia 41

3 calizada juntamente com as fosfoproteínas, mais concernentes com sua atividade biológica. De qualquer forma, esta proteína está envolvida com a estabilização e o transporte do cálcio salivar. Outra proteína típica da classe é a gustina, cuja atividade está ligada ao transporte (e arma- 6zenamento) do íon zinco, junto às papilas gustativas. A gustina é a proteína que contém a maior quantidade de zinco da saliva da parótida humana, seu peso molecular é de daltons, sendo que a histidina ocupa 8% dos resíduos de aminoácidos. Cada molécula de gustina tem a capacidade de ligar 1 átomo de zinco. O mecanismo pelo qual a gustina promove o crescimento e a acuidade das papilas gustativas é ainda desconhecido. Esta proteína apresenta uma atividade biológica semelhante ao fator de crescimento nervoso, isolado das glândulas submandibulares do camundongo macho. Lactoferrina é outra proteína rica em resíduos aromáticos, sendo ligeiramente básica. Diferindo das outras proteínas mencionadas, possui alto peso molecular (aproximadamente daltons). Acredita-se que a lactoferrina, que possui um núcleo porfirínico em sua estrutura, esteja ligada ao transporte de íons ferro da saliva. Cada molécula de proteína liga-se a dois átomos de ferro. A lactoferrina apresenta atividade antimicrobiana, inclusive contra os estrentococos mutans, que necessitam de íons ferro para o seu crescimento. AGLUTININAS SALIVARES Quando se adiciona saliva a uma suspensão de bactérias, ocorre geralmente uma agregação específica dos microorganismos que se depositam em poucos minutos no fundo do tubo de ensaio. A aglutinação 42 de bactérias pelas proteínas salivares é decorrência da neutralização das cargas elétricas negativas da superfície celular. As proteínas ácidas salivares, fosfoproteínas, glicoproteínas e mucinas são capazes de interagirem com as cargas negativas bacterianas através de uma ponte de cálcio. Contudo, as proteínas salivares pertencentes à classe das aglutininas são consideradas glicoproteínas de alto peso molecular (acima de 1 milhão de daltons!). A especificidade das aglutininas para determinado tipo de microorganismo está na dependência da variedade de radicais de carboidratos ligados à cadeia polipeptídica. As aglutininas exercem um papel antimicrobiano, considerando que os agregados macromoleculares em solução podem ser eliminados pela deglutição. Por outro lado, quando em condições favoráveis, esses agregados podem aderir às superfícies dos dentes, durante a formação da placa dental. Como geralmente essas proteínas possuem uma extremidade hidrofóbica (não polar) na cadeia polipeptídica e, portanto, sem carga elétrica, a interação entre elas é mais facilmente conseguida, provocando assim a agregação bacteriana. Além da interação entre cargas elétricas, outros tipos de ligações, como receptores específicos da membrana, podem ligar as aglutininas salivares aos microorganismos, sendo neste caso uma agregação mais específica. É interessante mencionar que a remoção dos íons cálcio por quelantes retarda ou mesmo impede a formação *de agregados bacterianos. ENZIMAS SALIVARES A secreção salivar, assim como outras secreções digestivas, contém várias enzimas hidrolíticas destinadas a promoverem, mediante sua atividade catalítica, a degração dos componentes alimentares, tornando-os adequados à absorção intestinal. A enzima mais abund ante da secreção salivar é a alfa-amilase. Esta enzima hidroliza a ligação alfa 1-4 de resíduos glicosídicos do amido e glicogênio. Esta atividade enzimática não é essencial ao processo digestivo, uma vez que na sua ausência a digestão se processa normalmente às expensas da enzima pancreática. Contudo, a amilase salivar exerce importante papel na digestão de restos de alimentos aderidos aos espaços interdentais, colaborando assim em sua solubilização e limpeza. A lisozima é uma enzima altamente positiva que cataliza a degradação de peptidoglicanos, macromoléculas que se apresentam negativamente carregadas, encontradas nas paredes das células bacterianas. Os peptidoglicanos bacterianos são polímeros moleculares, insolúveis, constituídos por unidades de dissacarideos do ácido acetil-murâmico e acetil-glicosamina. A ligação hidrolizada pela enzima é do tipo alfa 1-4, sendo os fragmentos resultantes da hidrólise, solúveis no meio bucal. Portanto, esta enzima exerce, mediante sua atividade catalítica, ação antibacteriana. Por outro lado, a lisozima modificada, isto é, sem atividade muramidásica, também impede o crescimento bacteriano, possivelmente atuando de forma ainda desconhecida sobre a permeabilidade da membrana plasmática bacteriana. A lisozima é encontrada em alta concentração na saliva, sendo capaz, também, de produzir a agregação de estreptococos da cavidade bucal. Ao contrário da alfa-amilase, a lisozima é secretada principalmente pelas glândulas mucosas e Revista Paulista de Odontologia

4 por fagócitos existentes na cavidade bucal. A lactoperosidade salivar é uma enzima de alto peso molecular ( daltons) que contém anel de porfirina e ferro como núcleo prostético. Catalisa a decomposicão de peróxidos, liberando radicais capazes de oxidarem outras substâncias. Na saliva, a peroxidase utiliza particularmente o íon tiocianato como substrato em presença do peróxido de hidrogênio, e os produtos liberados desta reação, particularmente o 'íon hipotiocianito (OSCN-), são capazes de oxidar compostos importantes, como por exemplo os grupamentos tióis de proteínas existentes nas células bacterianas, tornando-as inativas. Desta forma, a lactoperoxidase exerce também uma ação antibacteriana. IMUNOGLOBULINAS As imunoglobulinas são importantes proteínas existentes no plasma sangüíneo e desempenham a função de defesa contra a invasão de agentes estranhos (antígenos), nocivos ao organismo. Existem vários tipos de imunoglobulinas, sendo que na saliva e outras secreções a classe predominante são sa imunoglobulinas secretórias (IGA). Devido à importância que se tem dado atualmente às imunoglobulinas salivares, particularmente com relação à cárie dental, consideraremos esta classe de proteínas um pouco mais aprofundada. As imunoglobulinas pertencem a uma classe quimicamente heterogênea, diferindo em peso molecular, conteúdo em carboidratos, mobilidade eletroforética e antigenicidade. Contudo, todas elas apresentam a propriedade em comum de se combinarem especificamente aos antígenos. Existem cinco classes mainres de imunoglobulinas e várias subclasses. As principais imunoglobulinas são designadas por siglas: IgG, IgM, IgA, IgD e IgE. As imunoglobulinas são compostas de unidades básicas de monômeros de peso molecular entre daltons (coeficiente de sedimentação 7S). A unidade básica compõe-se de quatro cadeias polipeptídicas: um par de cadeias pesadas, de peso molecular entre daltons, e um par de cadeias leves, de daltons. As cadeias leves, que existem em vários tipos, são comuns a todas as imunoglobulinas. Contudo, cada imunoglobulina apresenta uma composição específica para as cadeias pesadas (Figura 1). Muitas imunoglobulinas existem no plasma como polímeros da unidade básica, como IgM e IgA, que se encontram na forma de pentâmero (P.M daltons) e dímero ou trímero, respectivamente. Cada classe FURA 1 - Estrutura da IgG, mostrando o padrão de pontes dissulteto e as regiões de sequencia homóloga. A NH: S $ S CH2 CH2 S S S S Ci Ci, V t. I-- NH; - S S CH3 CH3 S C0o- C00- Legenda: CH t - CH3 = regiôes constantes da cadeia pesada. CL VH VL ^ região constante da cadeia leve. reglio variável da cadeia pesada. a regido variivel da cadeia leve. ^ Revista Paulista de Odontologia 43

5 de imunoglobulinas é responsável por um tipo de reação biológica, assim a IgE está ligada à reações do tipo alérgico; a IgM e IgG são capazes de fixar complemento e, portanto, participarem das reações mediadas pela fixação de complemento; a IgA são as imunoglobu- Iinas encontradas normalmente nas secreções; a IgD, juntamente com uma forma de IgM, são as principais imunoglobulinas da superfície dos linfócitos. As imunoglobulinas secretórias (IgA) diferem das de sua classe plasmática por apresentarem, além das quatro cadeias polipeptídicas comum a todas elas, um componente secretório (glicoproteína de P.M daltons) e uma cadeia de ligação (aproximadamente daltons). A molécula completa de IgA tem um peso molecular de daltons, sendo encontrada normalmente nas secreções salivares, gastrointestinais e brônquicas, como também na lágrima e leite. As imunoglobulinas secretórias representam uma primeira linha de defesa do organismo contra a invasão virótica e bacteriana, normalmente presentes no tubo gastrointestinal. Pela maior afinidade que as imunoglobulinas secretórias têm pelos antígenos dos microorganismos, elas formam com os mesmos, agregados macromoleculares, impedindo assim sua aderência às superfícies das mucosas e facilitando sua remoção pela deglutição. COMPONENTES PROTEICOS MENORES Além dos componentes protéicos maiores, a saliva contém também alguns peptídeos que apresentam atividade biológica particularmente ativa sobre o metabolismo de microorganismos encontrados na saliva e placa dental. A sialina é um peptídeo rico em arginina, capaz de aumentar o ph da placa, após a imbebição da mesma com solução diluída de glicose ou sacarose. A estrutura da sialina é bem simples, formada apenas por quatro resíduos de aminoácidos (H2N-glicina-glicina-Iisina-arginina-COOH). E interessante notar que a sialina produz um maior efeito sobre o aumento de ph da placa ou sedimento salivar do que a mesma quantidade de arginina. Isto significa que as células bacterianas apresentam uma permeabilidade maior ao peptídeo do que ao aminoácido. Além da sialina, que aumenta o ph da placa dental e estimula também a atividade glicolítica de estreptococos, outros peptídeos salivares foram descritos na literatura, particularmente o peptídeo ativante da glicólise, de peso molecular aproximadamente daltons, rico em histidina, lisina e arginina. Este peptídeo estimula a atividade glicolítica da placa dental e sedimento salivar sem, contudo, ter qualquer efeito sobre o aumento do ph. A.2 Componentes inorgânicos A osmolaridade da saliva, independente do fluxo salivar, é devido somente à concentração de quatro íons: sódio, potássio, cloreto e bicarbonato. Contudo, as concentrações destes íons alteram-se dramaticamente com a velocidade do fluxo salivar. As concentrações destes quatro íons nas secreções salivares em repouso e estimuladas estão expressos na figura 2. Uma característica importante da saliva, e que dependente da concentração desses íons, é a sua hipotonicidade com relação ao plasma e líquidos celulares. Esta propriedade da saliva tem um profundo significado biológico, de vez que a integridade dos tecidos da cavidade oral dependem de certa forma de trocas osmóticas entre saliva e as superfícies mucosas e dentais. A concentrações de água da saliva é maior do que a das células mucosas e a do dente, portanto, em condições normais, a tendência do fluxo aquoso é de fora para dentro das células mucosas e estruturas dentais, levando assim os componentes salivares em íntimo contato com a superfície destas est ruturas. Disso depende o íntimo contato entre as proteínas salivares e a superfície mucosa da cavidade bucal, particularmente no que se refere às imunoglobulinas. Por outro lado, quando a saliva se torna hipertônica pela dissolução de substâncias solúveis do alimento (particularmente sal e açúcar), o sentido do fluxo aquoso pode ser revertido. Neste caso, a tendência da água dos tecidos orais, principalmente do líquido dentinário, é a de seguir a força centrífuga, isto é, no sentido de dentro para fora. Destas trocas dependem em parte os processos de maturação e de dissolucão interna do esmalte durante a formação da lesão inicial da cárie dental. B Interação dos componentes salivares: ph e poder tampão da saliva O ph salivar, isto é, a concentração de íons hidrogênicos (H±) da saliva, depende basicamente da sua concentração de bicarbonato. A pressão parcial de CO2 da saliva é aproximadamente igual à do plasma, portanto o ph variará com a concentração de bicarbonato de acordo com a equação de Henderson-Hasselbach: HCO3 ph=pk -I-log H 2 CO3 44 Revista Paulista de Odontologia

6 FIGURA 2 - Alterações nas concentrações de sódio, potássio, cloreto, bicarbonato e na osmolaridade da secreção da parótida humana, em função do fluxo salivar K+ W 50- E o 60-` Na+ + K Na+ Cl- + HCO3 repouso estimulada repouso estimulada 60 - V. 30='' } ú 20 J C É 120 a o E mosm/g ,, Cl" HCO3 20-0,01 Q02 0,05 0,1 0,2 0,5 1,0 log. fluxo salivar ml/min. 0,01 0,02 0,05 0,1 0,2 0,5 1,0 log. fluxo salivar ml/min. O pk é aproximadamente 6,1 e a pressão parcial de CO2 depende da concentração de ácido carbônico expressa na equação. Portanto, o ph salivar aumenta com o fluxo salivar, visto que a concentração de bicarbonato também aumenta nesta circunstância. Por outro lado, quando a saliva é exposta à atmosfera, o seu CO 2 difunde para o meio ambiente e, com isso, ocasiona um aumento de ph salivar, tornando a saliva alcalina. Nestas condições, muitos íons que estavam em solução, principalmente os fosfatos, podem se precipitar. A concentração de outros componentes menores e que em determinadas condições podem exercer um papel importante nas propriedades da saliva, como uréia, tiocianato e flúor estão na tabela 1. C Saliva e cárie dentária Embora a saliva não seja imprescindível à digestão dos alimentos, ela é, contudo, essencial à integridade dos tecidos orais. Inúmeras experiências em seres humanos quanto em animais de laboratório têm demonstrado amplamente o importante papel biológico da saliva. Indivíduos que sofrem de xe- Revista Paulista de Odontologia 45

7 TABELA 1 CONCENTRAÇÃO DE ALGUNS CONSTITUINTES ESPECIFICOS DO SORO E SALIVA SANGUE Soro, plasma ou sangue total SALIVA Parótida Submandibular Mista R E R E R E ph 7,35-7,45 5,8 7,7 6,5 7,4 6,7 6,8-7,5 Bicarbonato (mm) , , Sódio (mm) ,5-2, ,6 26 Potássio (mm) 3,5-5, Cálcio (mm) 2-2,5 1,0 1,0 1-1,6 1,6-2 1,6-4 1,5-3 Magnésio (mm) 1-1,5 0,1-0,2 0,02 0,05-0,1 0,035 0,2 0,1-02 Cloreto (mm) Fósforo (inorg.mm) 1-1, Glicose (mg%) ,8 0,2 0,5-0,6-1,0 1,0 Amônia (mg%) 0,08-0,11 0,09 0,06 0,7 0, Uréia (mg%) , Tiocianato (mg%) 0,1-1, Proteína Total (mg%) 6,5-8,2 (g%) Iodeto (micrograma%) 3-8 (ligado) Fluoreto (micrograma%) Ferro (micrograma%) ,60 20 Zinco (micrograma%) Cobre (micrograma%) Cromo (micrograma%) Chumbo (micrograma%) ,4 R = repouso E = estimulada 46 Revista Paulista de Odontologia

8 rostomia ou que apresentam um fluxo salivar reduzido devido ao tratamento do câncer do pescoço ou da cabeça por radioterapia apresentam inflamações da mucosa oral e da gengiva com mais freqüência e um maior índice de cárie. Isto também é verdade para indivíduos que estão sob tratamento de drogas que reduzem o fluxo salivar, como por exemplo a anfetamina. Animais de laboratório nos quais foram removidos total ou parcialmente as suas glândulas salivares também apresentam um maior índice de cárie do que seus controles. Nestes casos, a saliva exerce uma função de limpeza e de proteção como um todo, sem nenhum destaque particular de qualquer de seus componentes. Atualmente tem-se dado muita importância às imunoglobulinas salivares em decorrência da possibilidade da saliva servir de meio de transporte para anticorpos resultantes de vacinas anticárie. Se de um lado a vacinação anticárie pode representar o mais alto objetivo da odontologia preventiva, de forma semelhante a outros tipos de vacinas alcançadas em medicina preventiva, as possibilidades, neste caso, não são tão favoráveis como nos de imunização geral. As células plasmáticas que produzem anticorpos e as próprias imunoglobulinas, em quantidades adequadas, estão em contato direto que os agentes específicos introduzidos no organismo. Com relação à imunização anticárie, as imunoglobulinas secretoras (IgA) não são secretadas na saliva em quantidades ditas adequadas, isto é, suficientes para a neutralização dos microorganismos específicos alojados na cavidade bucal. Por outro lado, a cárie dentária não é uma doença produzida especificamente por um tipo de microorganismo. Mesmo considerando os estreptococos mutans como as bactérias de maior poder virulento, especialmente na capacidade de destruição do dente, a sua neutralização não significa que outras bactérias não sejam capazes de executar a mesma função. A diminuição da microbiota oral pode dar origem ao crescimento de fungos que antes não teriam a capacidade de se proliferar em virtude da competição biológica natural de cavidada bucal e, finalmente, ninguém poderá prever, a longo prazo, quais os efeitos colaterais que a introdução de antígenos bacterianos poderá trazer ao organismo. Além de todos estes inconvenientes, soma-se o fato de que a prevenção da cárie pode ser alcançada com medidas mais simples e seguras, como dieta, nutrição e higiene bucal. Contudo, isso não significa que devemos assumir uma posição contrária a uma possível implantação futura da imunização anticárie, apenas queremos deixar patente que no momento as evidências atuais nos colocam numa posição de espectativa. 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