QUALIDADE MICROBIOLÓGICA DE ÁGUAS MINERAIS EM GALÕES DE 20 LITROS

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1 ISSN Alim. Nutr., Araraquara v.19, n.3, p , jul./set QUALIDADE MICROBIOLÓGICA DE ÁGUAS MINERAIS EM GALÕES DE 20 LITROS Adalberto FARACHE FILHO* Maria Fernanda Falcone DIAS** RESUMO: O objetivo deste trabalho foi avaliar alguns aspectos de qualidade microbiológica em amostras de água mineral natural, envasadas em galões de 20 litros, das diversas marcas comercializadas nas cidades de Araraquara e Américo Brasiliense SP. Foram analisadas 84 amostras, 4 de cada uma das 21 marcas encontradas no comércio varejista. Para determinação de coliformes totais e coliformes fecais/e. coli foi utilizada a técnica de substratos cromogênicos, para determinação da presença de Pseudomonas aeruginosa foi utilizada a técnica de tubos múltiplos específica e para contagem de bactérias heterotróficas foi utilizada a técnica de cultivo em profundidade. Os resultados das análises para coliformes e Pseudomonas aeruginosa foram comparados com os padrões de qualidade para água mineral citados na Resolução nº 275/2005 e para bactérias heterotróficas com o padrão da Portaria nº 518/2004. Verificou-se que 2 amostras (2,4%) de 2 marcas (9,5%) estavam fora do padrão para coliformes fecais, 13 amostras (15,5%) de 8 marcas (38,1%) estavam fora do padrão para coliformes totais, 8 amostras (9,5%) de 6 marcas (28,6%) estavam fora do padrão para Pseudomonas aeruginosa e 52 amostras (61,9%) das 21 marcas (100,0%) apresentaram contagens elevadas (>500UFC/mL) para bactérias heterotróficas. Portanto, nenhuma das marcas apresentou as 4 amostras de acordo com os padrões utilizados nesta pesquisa. PALAVRAS-CHAVE: Água mineral; coliformes; Pseudomonas aeruginosa; bactérias heterotróficas. INTRODUÇÃO No Brasil, aproximadamente 60% das internações anuais é resultado da falta de saneamento e cerca de 30% das mortes de crianças com menos de um ano ocorrem por diarréia; no mundo, são 4 milhões de casos por ano enquanto 72% das internações em hospitais são de pacientes vítimas de doenças de origem hídrica. 13 No Brasil, a qualidade da água distribuída para a população pelos serviços públicos de abastecimento determina a confiabilidade no sistema e na segurança do consumidor em relação ao produto que recebe em casa. Quando isso não ocorre a população passa a procurar fontes alternativas para consumir água segura. 13 Além da grande preocupação com a qualidade da água proveniente da rede pública a busca pelo bem estar proporcionado pelos sais minerais contidos nas águas minerais têm provocado, nos últimos anos, uma contínua demanda por água mineral, em todos os países. 3 É importante considerar que os consumidores de água mineral buscam uma água de boa qualidade e livre de impurezas. 22 Água mineral natural é considerada como a água obtida diretamente de fontes naturais ou artificialmente captadas de origem subterrânea, caracterizada pelo conteúdo definido e constante de sais minerais (composição iônica) e pela presença de oligoelementos e outros constituintes. 4 A água mineral natural deve apresentar qualidade que garanta ausência de risco à saúde do consumidor, devendo ser captada, processada e envasada obedecendo às condições higiênico-sanitárias e as boas práticas de fabricação. 7 Várias pesquisas foram realizadas no Brasil avaliando a qualidade de águas minerais consumidas em diversas formas de embalagens. Entre elas citam-se pesquisas realizadas com amostras provenientes de indústrias do Estado de São Paulo, 11 consumidas nos Estados de Minas Gerais e Rio de Janeiro, 18 em Curitiba, 8 Cuiabá, 23 Recife, 10 São Luiz, 14 Marília, 1 São José do Rio Preto 16 e Ouro Preto, 17 entre outras, cujos resultados serão apresentados mais adiante com a discussão dos resultados obtidos nesta pesquisa. Observa-se hoje em dia o grande aumento do consumo de água mineral, principalmente em garrafões de 20 litros, substituindo a água dos sistemas de abastecimento público para consumo nas residências, escritórios, empresas e escolas, o que levou à realização desta pesquisa. A presente pesquisa teve como objetivo avaliar alguns aspectos gerais de qualidade microbiológica determinando a presença de indicadores de contaminação, coliformes totais e coliformes fecais/e. coli, Pseudomonas aeruginosa e bactérias heterotróficas, em amostras de água mineral natural, não carbonatada, em garrafões de 20 litros, de diversas marcas comercializadas nas cidades de Araraquara e Américo Brasiliense SP. * Departamento de Ciências Biológicas Faculdade de Ciências Farmacêuticas UNESP Araraquara SP Brasil. ** Programa de Pós-Graduação em Alimentos e Nutrição Curso de Doutorado Faculdade de Ciências Farmacêuticas UNESP Araraquara SP Brasil. 243

2 MATERIAIS E MÉTODOS Foram analisadas 84 amostras provenientes de 21 marcas de água mineral em garrafões de 20 litros. Por se tratar de pesquisa sem objetivo de fiscalização, foram analisadas 4 amostras de cada marca, distribuídas nos 4 semestres do ano, não considerando amostra representativa ou indicativa citadas na legislação. 4 As amostras foram adquiridas em vários estabelecimentos no comércio varejista das cidades de Araraquara e Américo Brasiliense-SP, de forma aleatória, em períodos diferentes, sem preocupação com a data de embalagem, mas observando-se o prazo de validade, simulando as condições de consumidor. As amostras foram retiradas diretamente dos garrafões, adequadamente higienizados, tomando-se cuidados para não contaminá-las; foram analisadas quanto à presença de coliformes totais, coliformes fecais/e. coli, Pseudomonas aeruginosa e bactérias heterotróficas. Para verificação da qualidade microbiológica referente aos parâmetros coliformes totais, coliformes fecais/e. coli e Pseudomonas aeruginosa foi adotada a Resolução nº 275, de 22 de setembro de 2005, que dispõe sobre o Regulamento Técnico de Características Microbiológicas para Água Mineral Natural e Água Natural; essa resolução determina como padrão a ausência desses microrganismos. 4 A Portaria nº 518 de 25 de março de 2004, que estabelece a qualidade da água para consumo humano e seu padrão de potabilidade, foi adotada como base para o padrão de bactérias heterotróficas e estabelece um limite de 500 UFC/mL. 5 Técnicas Determinação do número mais provável (NMP) de coliformes totais e coliformes fecais/e.coli. Para determinação da presença (NMP/100mL número mais provável em 100 ml de amostra) de coliformes totais e coliformes fecais/e. coli foi utilizada a técnica de substratos cromogênicos (definidos), empregando-se o produto da marca comercial Colillert/IDEXX, seguindo as orientações da American Public Health Association 2 e do fabricante. Transferiu-se 100mL da amostra para um frasco descartável estéril, em condições assépticas, adicionandose o conteúdo de um blister com o substrato (ONPG-MUG) e agitou-se vigorosamente até que todos os grânulos fossem dissolvidos. Com auxílio de pipeta estéril, transferiuse 10mL para cada um de 10 tubos de ensaio com tampa de rosca, estéreis, posteriormente incubados a C por 24 h. Após esse período foram feitas as leituras e a coloração amarelada indicou positividade para coliformes totais. A partir do número de tubos positivos estimou-se o número mais provável de coliformes totais (NMP/100mL) empregando-se tabela apropriada. Para a determinação do NMP/100mL de coliformes fecais/e. coli, os tubos com coloração amarela foram expostos à luz ultravioleta (366 nm de comprimento de onda) para a verificação de fluorescência azul, que indica positividade para coliformes fecais/e. coli. A partir do número de tubos positivos estimou-se o NMP/100mL utilizando-se tabela apropriada. Determinação do número mais provável (NMP) de Pseudomonas aeruginosa. Para determinação da presença (NMP/100mL número mais provável em 100 ml de amostra) de Pseudomonas aeruginosa foi utilizada a técnica de tubos múltiplos específica, empregando-se os meios caldo asparagina e caldo acetamida nas provas presuntiva e confirmatória, respectivamente, seguindo orientações da American Public Health Association. 2 Para o teste presuntivo inocularam-se alíquotas de 10 ml da amostra em cada um de dez tubos contendo caldo asparagina em concentração dupla, incubados em estufa à temperatura entre 35 37ºC. Após 24 h e após 48 h de incubação, foram examinados sob luz ultravioleta (366 nm de comprimento de onda) em câmara escura. O aparecimento de pigmento esverdeado fluorescente constituiu teste presuntivo positivo. Para o teste confirmatório inoculou-se 0,1mL da cultura dos tubos positivos em tubos contendo caldo acetamida. A reação confirmatória positiva ocorre pelo ph elevado indicado pela coloração púrpura em 24/36 h de incubação a 35 37ºC. A partir dos tubos positivos na prova confirmatória estimou-se o número mais provável de Pseudomonas aeruginosa (NMP/100mL) empregando-se tabela apropriada. Contagem de bactérias heterotrófi cas. Para contagem de bactérias heterotróficas utilizou-se a técnica de cultivo em profundidade (pour plate method) empregando-se o meio Plate Count Agar (PCA), seguindo as orientações da American Public Health Association 2 e Companhia de Tecnologia de Saneamento Ambiental. 9 Em cada uma de duas placas foi distribuído 1,0mL da amostra e adicionou-se o meio Plate Count Agar (PCA) fundido; as placas foram homogeneizadas e, após solidificação do meio, incubadas em posição invertida por 72 ±3 horas a 35 37ºC; realizou-se a leitura do número de colônias nas duas placas e calculou-se a média das contagens obtidas; o resultado foi expresso em unidades formadoras de colônias/ml (UFC/mL). 244

3 RESULTADOS Tabela 1 Número e porcentagem de amostras e marcas de água mineral em garrafões de 20 litros, que atenderam e não atenderam aos padrões recomendados pela legislação em vigor, comercializadas na cidade de Araraquara e Américo brasiliense SP. Amostras Marcas Atende Não atende Total Atende Não atende Total Parâmetros Nº % Nº % Nº % Nº % Nº % Nº % Coliformes fecais/e. coli 82 97,6 2 2, ,5 2 9, Coliformes totais 71 84, , ,9 8 38, Pseudomonas aeruginosa 76 90,5 8 9, ,4 6 28, Bactérias heterotróficas 32 38, , , Tabela 2 Número de amostras e combinação de resultados positivos e negativos para coliforme total, coliforme fecal, Pseudomonas aeruginosa e bactérias heterotróficas em águas minerais em embalagens de 20 L comercializadas nas cidades de Araraquara e Américo Brasiliense. Coliforme total Coliforme fecal P. aeruginosa Bact. Heterotróficas* Nº amostras P P N N 1 P P N P 1 P N P P 1 P N N P 8 P N N N 2 N N P P 3 N N P N 4 N N N P 39 N N N N 25 T o t a l 84 *N <500UFC/mL; P >500UFC/mL Na Tabela 1 estão distribuídos o número e porcentagem de amostras e marcas de água mineral que atenderam e não atenderam aos padrões de qualidade recomendados pela legislação utilizada como base de comparação nesta pesquisa. A Tabela 2 apresenta o número de amostras de águas minerais em embalagens de 20 L segundo as combinações de resultados positivos (P) e negativos (N) para coliforme total, coliforme fecal e Pseudomonas aeruginosa; para bactérias heterotróficas o significado de N é <500UFC/mL e P >500UFC/mL. Nesta pesquisa verificou-se que 13 amostras (15,5%) de 8 marcas (38,1%) apresentaram positividade para coliformes totais; dessas 13 amostras 2 (2,4 %) de 2 marcas (9,5%) também foram positivas para coliformes fecais/e. coli (Tabelas 1 e 2). Ainda na Tabela 1 observa-se que 8 amostras (9,5%) de 6 marcas (28,6%) não atenderam a legislação para Pseudomonas aeruginosa e apenas uma amostra foi também positiva para coliformes totais (Tabela 2). Nesta pesquisa 20 (23,8%) amostras (Tabela 2) de 11 (52,4%) marcas não atenderam ao padrão para, pelo menos, um dos parâmetros estudados coliformes totais, coliformes fecais/e. coli estabelecidos pela legislação específica para águas minerais (Resolução n 275, de 22 de Setembro de 2005); 4 por outro lado, 10 (47,6%) marcas não apresentaram nenhuma amostra positiva para esses parâmetros. Observa-se na Tabela 2 que 25 (29,8%) amostras não apresentaram resultados fora do padrão para nenhum dos parâmetros estudados e que as 59 (70,2%) restantes foram positivas para, pelo menos, um dos microrganismos avaliados. Verifica-se na Tabela 1 que 52 amostras (61,9%) das 21 marcas (100,0%) apresentaram contagens elevadas (> 500UFC/mL) para bactérias heterotróficas. Portanto, nenhuma das marcas apresentou as 4 amostras de acordo com os padrões utilizados nesta pesquisa. DISCUSSÃO A legislação específica para águas minerais (Resolução n 275, de 22 de Setembro de 2005) 4 estabelece alguns parâmetros e os respectivos padrões de qualidade para essas águas, incluindo bactérias coliformes totais, coliformes fecais/escherichia coli e Pseudomonas aeruginosa, entre outros. 245

4 A presença de coliformes totais em água é menos representativa como indicação de contaminação fecal que a de coliformes fecais ou E. coli. Porém é muito utilizada em indústrias alimentícias, indicando contaminação pós-sanitização ou pós-processo, evidenciando práticas de higiene e sanificação aquém dos padrões requeridos para o processamento de alimento. 20 A presença do grupo de bactérias coliformes denota que ocorreu uma interferência externa na água mineral, já que esse grupo de bactérias não faz parte da composição natural dessas águas. 1 Coliformes fecais indicam a possibilidade da presença de enteropatógenos, dentre eles a E. coli que possui alguns sorotipos responsáveis por gastroenterites, tendo a diarréia como principal sintoma. 19 Na Tabela 1 observa-se que, das 84 amostras analisadas, 13 (15,5%) de 8 (38,1%) das 21 marcas estudadas apresentaram positividade para coliformes totais; dessas 13 amostras 2 (2,4 %) de 2 marcas (9,5%) também foram positivas para coliformes fecais/e. coli (Tabela 2). Coelho et al. 8 avaliaram a qualidade microbiológica de seis marcas de água mineral destinadas ao mercado consumidor de Curitiba e encontraram duas marcas (33%) contaminadas com coliformes totais, mas apresentaram ausência de E. coli. Para os autores a presença de coliformes na água mineral pode indicar ausência de cuidados sanitários, problemas nas operações de captação, canalização, filtração, envasamento ou outros que possam alterar as propriedades características e a composição das mesmas. 8 Alves et al. 1 analisaram dezoito amostras de diferentes marcas de água mineral, em embalagens de diferentes tamanhos, comercializadas em Marília-SP. Encontraram uma amostra (5,6%) contaminada por coliformes totais e nenhuma contaminada por coliformes fecais. Para esses autores o fato de ser encontrada uma amostra de água mineral contaminada permite afirmar que sua contaminação pode ter sido durante a fase de captação e/ou processamento do produto. Wendpap et al. 23 avaliaram 180 amostras de água mineral em embalagens de diversos tamanhos, da região central de Cuiabá-MT. Detectaram contaminação por coliformes totais em vinte e uma delas (11,7%), e por coliformes fecais em dezessete (9,4%). Considerando a presença de Pseudomonas aeruginosa, na presente pesquisa 8 amostras (9,5%) de 6 marcas (28,6%) não atenderam ao padrão estabelecido pela legislação em vigor (Tabela 1). Dessas apenas uma amostra também apresentou resultado positivo para coliformes totais (Tabela 2) A preocupação com a presença de P. aeruginosa nas águas minerais, reside no fato de muitas espécies serem resistentes a antibióticos, sua alta capacidade de multiplicação em águas com reduzido conteúdo de nutrientes e pelo fato de ser um patógeno oportunista com capacidade de causar infecções em indivíduos imunocomprometidos, além de poderem alterar cor, turbidez e sabor de águas. 18 Sant Ana et al. 18 analisaram quarenta e quatro amostras de água mineral de diferentes marcas, originárias do Estado do Rio de Janeiro e Minas Gerais. Encontraram 25% delas contaminadas por coliformes totais e 20,4% por E. coli, sugerindo falhas higiênicas ao longo do processo e contaminação fecal recente. Em nenhuma das amostras foi detectada a presença de Pseudomonas aeruginosa e enterococos. Guilherme et al. 12 pesquisaram a presença de Pseudomonas aeruginosa em quarenta e quatro amostras de água mineral enviadas ao Laboratório de Saúde Pública Noel Nutels no Rio de Janeiro das quais 10 (22,7%) estavam contaminadas por Pseudomonas aeruginosa. Eiroa et al. 11 ao avaliarem as características microbiológicas de 92 amostras de água mineral em diferentes pontos da linha de envase de quatro indústrias engarrafadoras no Estado de São Paulo, não detectaram a presença de microrganismos do grupo coliforme, clostrídios e estreptococos fecais, mas encontraram Pseudomonas aeruginosa em 60% das amostras. Esses autores observaram que, dependendo da época de amostragem, P. aeruginosa podia ou não estar presente nas fontes e que mesmo não havendo a contaminação da fonte por este microrganismo, ocasionalmente a bactéria esteve presente nas envasadoras e produto final. Nascimento et al. 14 avaliando a qualidade microbiológica de 70 amostras de águas minerais comercializadas em São Luís-MA, observaram que 35 (50%), não apresentavam contaminação por coliformes totais, fecais, Pseudomonas aeruginosa e bactérias heterotróficas acima dos padrões. Entretanto, as outras trinta e cinco (50%), embora não apresentassem contaminação por coliformes totais e fecais, estavam impróprias para o consumo humano devido à presença de P. aeruginosa e de bactérias heterotróficas acima dos padrões, colocando em risco a saúde dos consumidores. David et al. 10 avaliaram quatro amostras de águas minerais, de diferentes marcas, comercializadas em Recife-PE. Encontraram em duas amostras (50%) coliformes totais e Pseudomonas. Todas as amostras apresentaram contagem de heterotróficos superiores a 300UFC/mL, sugerindo possível contaminação durante o engarrafamento e armazenamento. Sabioni & Silva 17 avaliaram cinqüenta amostras de águas minerais, em embalagens de 500mL, 1500mL e 20litros, de diferentes marcas, comercializadas em Ouro Preto- MG. Em sete amostras (14%) foi encontrada Pseudomonas aeruginosa e em vinte e cinco amostras (50%) foi encontrada contagem de heterotróficos maior que 500UFC/mL. Em nenhuma das amostras foram detectados coliformes totais, fecais e enterococos. Reis et al. 16 avaliaram amostras de águas minerais de diferentes marcas, vendidas em São José do Rio Preto SP. Nas vinte amostras analisadas não encontraram a presença de coliformes totais, fecais e E. coli. Embora a legislação para águas minerais não determine a contagens de bactérias heterotróficas como parâmetro de qualidade, tomando-se como base a recomendação da portaria 518 que estabelece limite de 500 UFC/mL para 246

5 água de consumo humano, utilizou-se esse padrão como uma variável a mais neste estudo. Bactérias heterotróficas também foram avaliadas por alguns autores em amostras de água mineral. Verifica-se na Tabela 1 que 52 amostras (61,9%) das 21 marcas (100,0%) analisadas nesta pesquisa apresentaram contagens elevadas (> 500UFC/mL) para bactérias heterotróficas. Portanto, todas as marcas tiveram pelo menos uma amostra fora do padrão considerado para bactérias heterotróficas. Das 11 amostras positivas apenas para coliformes totais 10 provenientes de 6 marcas apresentaram contagens para bactérias heterotróficas acima do padrão (>500UFC/mL); das duas amostras positivas para coliformes totais e fecais/e. coli uma estava também fora do padrão para heterotróficas e 39 amostras não atendiam apenas ao padrão para bactérias heterotróficas (Tabela 2). Nesta pesquisa observou-se que a utilização do padrão para bactérias heterotróficas igual ao recomendado para águas de sistemas de abastecimento público classificaria grande parte das amostras analisadas como impróprias para consumo humano, alertando para a necessidade de estudos detalhados que estabeleçam padrões para a presença dessas bactérias em águas minerais naturais envasadas, considerando os riscos que podem oferecer à saúde e à qualidade dessas águas. Reis et al. 16 avaliaram amostras de águas minerais de diferentes marcas, vendidas em São José do Rio Preto- SP. Nas vinte amostras analisadas encontraram em quatro amostras (20%) contagens de heterotróficos maiores que 500 UFC/mL. Mesmo que a maioria das bactérias heterotróficas da flora natural da água não seja considerada patogênica, é importante que sua densidade seja mantida sob controle, pois densidades muito elevadas dessas bactérias na água podem causar riscos á saúde do consumidor. Algumas dessas bactérias podem atuar como patógenos oportunistas, deteriorantes da qualidade da água; ocasionando odores e sabores desagradáveis e produzindo limbo e películas, e influência inibidora de alguns microrganismos; pois quando presentes em número elevado podem impedir a detecção de coliformes. 6 Os organismos contaminantes chegam até a água por contaminação fecal ou outras vias, sejam diretamente na fonte ou durante o engarrafamento. 8 Por isso é importante proteger as fontes de água mineral de infiltração de águas de superfície ou águas de drenagem dos solos no lugar da fonte ou perfuração. Estas águas podem conduzir grande população de organismos aquáticos e do solo até a água subterrânea, mudando suas propriedades físicas e químicas e fornecendo nutrientes para as bactérias. 21 Os equipamentos que são usados para conduzir a água até os locais de engarrafamento, equipamentos usados durante o processo de engarrafamento e reservatórios de estocagem podem também abrigar populações de organismos contaminantes, 21 que podem ser provenientes também 11, 15 do ambiente e das embalagens e tampas. A reutilização das garrafas sem adequada limpeza 21, 24 e desinfecção é outra possível fonte de contaminação. Sendo assim, as águas minerais em garrafões reutilizáveis de 20 litros estão mais sujeitas à contaminação. CONCLUSÃO Avaliando os dados obtidos nesta pesquisa concluiuse que ocorre uma variação de qualidade entre amostras diferentes coletadas de uma mesma marca de água mineral em garrafões de 20 litros, que pode ser resultante da variação das condições climáticas durante o ano e/ou da higienização dos garrafões. Nesta pesquisa, considerando apenas microrganismos cujo padrão foi definido pela legislação específica para água mineral coliformes totais, coliformes fecais/e. coli e Pseudomonas aeruginosa somente vinte (23,8%) amostras de onze (52,4%) marcas seriam consideradas inadequadas enquanto cinqüenta e duas amostras (61,9%) das vinte e uma marcas (100,0%) apresentaram contagens elevadas (> 500UFC/mL) para bactérias heterotróficas. É preciso avaliar a importância das bactérias heterotróficas, definindo padrão para águas minerais, pois podem alterar a qualidade do produto e oferecer riscos ao consumidor. FARACHE FILHO, A.; DIAS, M.F.F. Microbiological quality of mineral water in gallon of 20 liters. Alim. Nutr., Araraquara, v.19, n.3, p , jul./set ABSTRACT: The objective of this study was to evaluate some aspects of microbiological quality in samples of natural mineral water, potted in gallon of 20 liters, the various brands marketed in the cities of Araraquara and Americo Brasiliense SP. In total 84 samples were analyzed, 4 of each of the 21 marks found in retail trade. For determination of total coliforms and fecal coliforms / E. coli was used the cromogenic substrate technique, for determining the presence of Pseudomonas aeruginosa was used the technique of multiple tubes specific and for counts of heterotrophic bacteria was used the pour plate method. The results of coliforms bacteria and Pseudomonas aeruginosa were comparate with quality standards to mineral water regulation 275/2005 and heterotrophic bacteria with standard in regulation 518/2004. It was found that 2 samples (2.4%) of 2 marks (9.5%) were outside the standard for fecal coliform, 13 samples (15.5%) of 8 marks (38.1%) were outside the standard for total coliform, 8 samples (9.5%) of 6 marks (28.6%) were outside the standard for Pseudomonas aeruginosa and 52 samples (61.9%) from 21 marks (100.0%) had high counts ( > 500UFC/mL) to heterotrophic bacteria. Therefore, none of the marks showed the 4 samples in accordance with the standards used in this study. KEYWORDS: Mineral water; coliforms; Pseudomonas aeruginosa; heterotrophic bacteria. 247

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