Estágio n.º Manual de Estágio 1

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1 INIAV é Ciência Viva Projeto Escolher Ciência: da Escola à Universidade A FLORESTA AO MICROSCÓPIO I Estágio n.º a 5 Julho de 2013 Responsável - Maria de Lurdes Inácio Manual de Estágio 1

2 Semana de Estágio 2ª feira, 1 Julho manhã Receção dos alunos e apresentação da Unidade de investigação florestal e da equipa do projeto; enquadramento das atividades a desenvolver ao longo do estágio tarde Instalação de amostras para extração do nemátode da madeira do pinheiro; observações à lupa e ao microscópio 3ª feira, 2 Julho manhã Observação das fases do ciclo de vida de insetos vetores de doenças na floresta: observações à lupa; demonstração dos principais meios de luta (ex: armadilhas iscadas com feromonas) tarde Isolamento de fungos em cultura pura a partir de árvores infetadas 4ª feira, 3 Julho manhã Extração e purificação de DNA de fungos patogénicos e envio do material para sequenciação tarde Continuação do isolamento de fungos patogénicos; observação de preparações microscópicas de fungos simbiontes (micorrizas) ou de antagonistas; extração de nemátodes das amostras instaladas. 5ª feira, 4 Julho manhã Avaliação dos resultados obtidos na Patologia e Biologia Molecular tarde Análise das sequências de DNA obtidas e possível identificação dos fungos atendendo às suas características morfológicas e aos resultados da sequenciação do DNA ribossomal 6ª feira, 5 Julho manhã Apresentação (em grupos) do estágio pelos alunos no auditório da ex-efn tarde Continuação das apresentações Entrega dos diplomas do estágio Ciência Viva Lanche Nota: os alunos em estágio têm ainda a possibilidade de assistir diariamente a palestras subordinadas a diversos temas, entre as h, antes do período de almoço. Manual de Estágio 2

3 2ª feira, 1 Julho 10:00 - Receção dos estagiários pelos dinamizadores dos estágios no edifício da ex- Estação Florestal Nacional, Oeiras (EAN, Quinta do Marquês) Entrega das Pastas de Acolhimento 10:45 - Abertura do evento INIAV é Ciência Viva pelo Conselho Diretivo do INIAV Dr. Carlos Caldas 11:00 - Apresentação do Programa Estágios INIAV é Ciência Viva pela Coordenadora do Programa - Paula Sá Pereira. 11:20 Início do estágio A Floresta ao Microscópio I Apresentação da equipa de trabalho Visita às instalações/ laboratórios Enquadramento das atividades a desenvolver ao longo do estágio Almoço Breve introdução aos principais agentes causadores de doenças na floresta: nemátodes e fungos; o seu transporte por insetos. Caso particular da doença da murchidão do pinheiro, causada pelo nemátode da madeira do pinheiro (NMP), Bursaphelenchus xylophilus. Laboratório de Nematologia (Mª Lurdes Inácio + Margarida Fontes) Normas de funcionamento num laboratório de organismos de quarentena. Preparação e instalação de amostras de pinheiro bravo para extração e deteção do NMP Observação da suspensão de nemátodes à lupa. Técnica de pescagem de nemátodes. Observação ao microscópio ótico (MO) de preparações entre lâmina e lamela. Microfotografia. Manual de Estágio 3

4 Laboratório de Nematologia O nemátode da madeira do pinheiro (NMP), Bursaphelenchus xylophilus é um animal de dimensões muito reduzidas (em média 1 mm de comprimento), filiforme (tipo lombriga) e ataca os pinheiros na floresta (sobretudo o pinheiro bravo), causando a doença da murchidão do pinheiro, que mata milhares de árvores no nosso país todos os anos. Como os sintomas são comuns a outras doenças, são retiradas amostras de serrim do tronco (com uma broca) dos pinheiros que se apresentem com as agulhas secas e acastanhadas, e trazidas para o nosso laboratório. Aqui, são instaladas de acordo com um protocolo específico para se extrair o NMP e efetuar a sua identificação através das características morfológicas e por métodos de biologia molecular. Há outros nemátodes naturalmente presentes no pinheiro muito parecidos com o NMP mas que não causam doença e por isso a identificação desses nemátodes só pode ser feita por especialistas (Nematologistas). Para passar de uma árvore para a outra, os nemátodes têm de ser transportados pelo inseto Monochamus galloprovincialis (longicórnio do pinheiro). Por isso, o NMP também pode ser identificado diretamente a partir destes insetos (Figura 1). a b Figura 1. a) Inseto vetor do nemátode da madeira do pinheiro (NMP); b) suspensão de nemátodes; c) pormenor da cabeça e da cauda do NMP (macho). c Nota: As diferentes etapas do trabalho são devidamente enquadradas e exemplificadas e todos os trabalhos serão acompanhados por técnicos de laboratório. Está também instalado um computador com uma apresentação em diapositivos, possibilitando aos estagiários a qualquer momento rever todo o processo de instalação das amostras até à identificação do NMP ao microscópio. Manual de Estágio 4

5 Laboratório de Nematologia (cont.) PROTOCOLO de INSTALAÇÃO das AMOSTRAS para EXTRAÇÃO de NMP 1. As amostras de serrim são pesadas e anotado o seu peso em tabela de laboratório 2. São colocadas sobre uma folha de papel que por sua vez está sobre uma folha de tecido (étamine) 3. Faz-se um embrulho (com a maior espessura de tecido virada para cima) que se coloca sobre a rede do tabuleiro 4. Enche-se o tabuleiro com água (cerca de metade da altura) e deixa-se ficar durante 48 h. PROTOCOLO de EXTRAÇÃO de NMP a partir do inseto Monochamus galloprovincialis 1. Os insetos são divididos em machos (antenas pretas) e fêmeas (antenas brancas e pretas) 2. São esmagados com um pequeno pilão dentro de uma placa de Petri pequena 3. Com o esguicho, enche-se a placa com água até cerca de metade 4. Deixa-se ficar durante 2-3 h 5. Côa-se a suspensão para nova placa para observação PROTOCOLO de OBSERVAÇÃO DO NMP À LUPA e ao MO ENTRE LÂMINA E LAMELA 1. A suspensão de nemátodes é colocada numa siracusa. 2. Faz-se a focagem e o ajuste das ampliações para observação de machos, fêmeas e estados juvenis do NMP. 3. Com o auxílio de uma pestana, pesca-se um nemátode (acompanhando a focagem) e colocase na gota de água na lâmina. 4. Mata-se o nemátode passando a lâmina gentilmente à chama e depois coloca-se a lamela por cima. 5. Observa-se ao MO, focando com a objetiva de menor ampliação (x4) e passando para as seguintes, de forma a ver as diferentes estruturas distintivas da espécie. 6. Microfotografias do material biológico observado. Manual de Estágio 5

6 3ª feira, 2 Julho 10:00 Breve introdução às principais pragas florestais de pinheiro, sobreiro e eucalipto com visita à Entomoteca Florestal do INIAV e às câmaras de crescimento de insetos para acompanhamento das diferentes fases dos ciclos de vida (larva, pupa e adulto). Observações das diferentes estruturas dos insetos à lupa binocular. Breves noções de bioecologia e de meios de luta para controlo das populações de pragas florestais, com particular ênfase nos métodos biotécnicos com recurso a armadilhas iscadas com feromonas e luta biológica com utilização de parasitoides e fungos entomopatogénicos. 12:15- Palestra P1 O ciclo da água no sistema solo-planta-atmosfera. A água e os ecossistemas florestais. Paulo Brito Luz e Clara Pinto. Auditório da ex-efn Almoço Visita à Micoteca Florestal do INIAV Isolamento em meio artificial de cultura de fungos causadores de doença em sobreiro para obtenção de culturas puras. Laboratório de Entomologia (Pedro Naves) Observação e manipulação de insetos à lupa binocular: o longicórnio do pinheiro M. galloprovincialis, (Cerambicídeo), o plátipo do sobreiro Platypus cylindrus (Platipodídeo) e o gorgulho do eucalipto Gonipterus scutellatus (Curculionídeo). Captação de imagens. Breves noções sobre montagem e etiquetagem de insetos para coleção. Observação das principais armadilhas usadas para o controlo de pragas florestais. Observação de insetos parasitados e/ou infetados com fungos entomopatogénicos. Laboratório de Micologia (Helena Bragança) Existem muitos fungos nos ecossistemas florestais com diferentes funções: saprófitas, simbiontes (micorrizas), antagonistas de outros fungos, entomopatogénicos (causadores de infeção nos insetos, sobretudo nos nocivos) e fitopatogénicos (causadores de doenças nas plantas). Pelo seu interesse, vamos trabalhar sobretudo com estes últimos. A partir de tecidos de árvores doentes (tronco, agulhas), com suspeita de infeção por fungos, será efetuado o isolamento do agente patogénico em cultura pura, com recurso a meios artificiais de cultura, com a chamada de atenção para a enorme biodiversidade micológica contida numa amostra de tecido vegetal. Será estudado com maior pormenor o fungo Biscogniauxia mediterranea, causador da doença do carvão do entrecasco no sobreiro. Manual de Estágio 6

7 Laboratório de Entomologia PROTOCOLO de OBSERVAÇÃO DOS INSETOS À LUPA 1. Os insetos têm de ser manuseados delicadamente com recurso a pinças de bicos moles 2. Os insetos de maiores dimensões são colocados diretamente no prato da lupa e observados com incidência de duplo foco de luz fria 3. Os insetos de menores dimensões são colocados numa esfera de observação para mais fácil manipulação 4. Captação de imagens prestando particular atenção às principais regiões (cabeça, tórax e abdómen) e às estruturas de forma a ser capaz de efetuar a legenda da Figura 2. Figura 2. Os insetos são artrópodes cujo corpo é revestido por quitina e está dividido em três regiões. Coloca as letras A, B e C à frente dos nomes da coluna: Abdómen Cabeça Tórax Completa as frases abaixo com as estruturas convenientes: patas, antenas, élitros, asas membranosas. O inseto vetor do NMP é o longicórnio do pinheiro. Tem esta designação porque tem umas muito longas. As asas coriáceas designam-se por e protegem o corpo do inseto e as que servem para voar. Os insetos têm 3 pares de que às vezes podem estar modificadas ou ausentes. Nota: como nos ecossistemas florestais é frequente os patogénios (nemátodes e fungos) serem transportados por insetos para vencerem as distâncias entre as árvores hospedeiras, às vezes a observação de insetos à lupa permite distinguir a presença de nemátodes ou de micélio de fungo no corpo dos artrópodes. Manual de Estágio 7

8 Laboratório de Micologia PROTOCOLO de ISOLAMENTO DE FUNGOS PATOGÉNICOS EM CULTURA PURA Breve demonstração sobre a preparação de meios artificiais de cultura (Malt Extract Agar, MEA Difco ): pesagens, diluições, autoclavagem e enchimento de placas de Petri 5mm. Desinfeção (álcool 70%) da bancada de trabalho, dos instrumentos a usar (pinça e bisturi) e das mãos (em alternativa, trabalhar com luvas de latex). Avaliação da lesão no tecido vegetal e seleção do material a isolar: na zona de transição do tecido são e tecido afetado, cortam-se pequenos pedaços com o auxílio de um bisturi. Estes pedaços são imersos em álcool a 1% cerca de 30 seg e depois passados por água destilada e esterilizada. Em seguida, são colocados sobre papel de filtro estilizado para remover o excesso de água e postos na placa de Petri (1 pedaço/ placa), sobre o meio de cultura. Estas operações decorrem em câmara de fluxo laminar e/ou com a lamparina acesa e colocada a uma distância de segurança. Cada placa de isolamento tem de ser devidamente identificada com o nº/nome da amostra, a data e o meio de cultura. As placas são colocadas em estufa de incubação, na obscuridade e a cerca de 24±1ºC, temperatura adequada para o crescimento da maior parte dos fungos com que trabalhamos e observadas diariamente. É natural que apareçam diferentes fungos (Figura 3), até na mesma placa, porque na natureza não há culturas puras, nós é que as tentamos obter no laboratório! Para isso, teremos de fazer um acompanhamento diário das placas e fazer a repicagem do que interessa para novas placas. Figura 3. Isolamento de fungos a partir de tecido vegetal. O que obtemos na placa de cultura são as hifas do fungo, que no seu conjunto constituem o micélio. Após alguns dias, podem formar-se esporos (conídios) que servem para propagar a doença. Em laboratório temos de ter cuidado e adotar procedimentos para que estes esporos não se libertem das placas e vão contaminar outros trabalhos e até mesmo fazer-nos mal à saúde! Contudo, estas estruturas reprodutivas são muito importantes para a caracterização morfológica do isolado, essencial para a identificação dos fungos. Ao estudar os esporos, avalia-se a sua forma, tamanho, modo de formação, inserção nos conidióforos (estrutura especializada formada por hifas simples ou ramificadas de onde são originados os conídios). Manual de Estágio 8

9 4ª feira, 3 Julho 10:00 Extração de DNA de fungos patogénicos Quantificação do DNA extraído Reação PCR Preparação do gel para eletroforese 12:15 - Palestra P2 Visita ao Laboratório de Solos Solo: um recurso multifuncional. Amélia Castelo Branco. Auditório da ex-efn Almoço Continuação do isolamento de fungos patogénicos em cultura pura; repicagens. Observação de preparações ao MO entre lâmina e lamela Conclusão da extração de nemátodes por crivagem debaixo de água (crivo 38 mesh) e confirmação da presença do NMP por observação à lupa e ao MO. Laboratório de Genética Florestal (Filomena Nóbrega + Joana Henriques) Discussão da importância do diagnóstico preciso em Fitopatologia, do conhecimento dos ciclos de vida dos fungos e decorrente aplicação de meios de controlo. A genética molecular como ferramenta imprescindível no diagnóstico das doenças florestais pelo conhecimento dos genes do fungo: através da sequenciação parcial do seu genoma, e comparação com as bases de dados mundiais (Genbank), é possível completar a identificação do fungo patogénico. O DNA existe em praticamente todas as células vivas e no caso dos fungos em cultura pura, a sua extração é feita diretamente a partir do micélio que se desenvolveu na placa de Petri. Para obter o DNA, tem que se separar dos outros componentes celulares. Assim, as células são fragmentadas e o DNA separado do conteúdo lipídico das membranas da célula e dos organitos e depois das proteínas. Este DNA tem de ser analisado por espectrofotometria para sabermos a quantidade e qualidade de material genético que obtivemos. Depois de extraído o DNA, é-lhe adicionada uma mistura (mix) que contém os dntps (desoxirribonucleotídeos trifosfatos), que são as bases azotadas ligadas com um três fosfato, os primers (também designados oligonucleotídeos ou iniciadores) e a enzima DNA polimerase numa solução tampão. Toda esta mistura é colocada no termociclador, o qual faz ciclos de temperatura préestabelecidos com tempos exatos específicos para cada reação (fragmento a ser amplificado). Este processo é conhecido como PCR (Polimerase Chain Reaction) e destina-se a obter maiores quantidades de material genético. Manual de Estágio 9

10 Laboratório de Genética Florestal PROTOCOLO de EXTRAÇÃO de DNA de FUNGO PATOGÉNICO Manual de Estágio 10

11 Laboratório de Genética Florestal (cont.) PROTOCOLO de PCR A técnica da PCR (reação em cadeia da polimerase) é um método de amplificação enzimática in vitro (de criação de múltiplas cópias) de DNA. Durante a PCR são usadas elevadas temperaturas de forma a separar as moléculas de DNA em duas cadeias simples, permitindo então a ligação de oligonucleótidos iniciadores (primers). Para realizar PCR são necessárias pequenas quantidades do DNA alvo, uma solução tampão salina contendo a enzima Taq DNA polimerase, os oligonucleótidos iniciadores, os quatro desoxinucleótidos constituintes do DNA e o cofactor Mg2+. Esta mistura é submetida a vários ciclos de amplificação que consistem em: desnaturação do DNA alvo pelo calor de modo a separar as duas cadeias; hibridação ou emparelhamento dos iniciadores por ligações de hidrogénio ao DNA alvo em cadeia simples, por arrefecimento da mistura de reação e extensão dos iniciadores através da síntese da cadeia complementar de cada cadeia molde, catalisada pela Taq DNA polimerase. O processo envolvendo estes três passos pode ser repetido várias vezes (25 a 30 ciclos) sendo possível aumentar, em cada ciclo, duas vezes a concentração de DNA existente, levando a uma amplificação exponencial. Manual de Estágio 11

12 Laboratório de Genética Florestal (cont.) PROTOCOLO de ELETROFORESE A electroforese é o método mais utilizado para estimar o tamanho dos fragmentos do DNA. A separação eletroforética de DNA é feita normalmente em gel de agarose. Por aplicação de um campo elétrico as amostras colocadas no gel vão migrar para o polo positivo (ânodo), uma vez que os ácidos nucleicos têm carga negativa em ph neutro. Esta migração dos ácidos nucleicos origina bandas que podem ser visualizadas com o auxílio de luz ultravioleta, após coloração com brometo de etídeo, uma substância mutagénica que se intercala nas cadeias de DNA e que exposta a radiação UV emite uma fluorescência alaranjada. Durante o endurecimento (polimerização) do gel, coloca-se um pente que cria poços que serão utilizados para a colocação das amostras. Cada uma é uma pista e na presença de uma corrente elétrica vai deixando o seu rasto. São estes rastos ou bandas que vamos comparar. Manual de Estágio 12

13 Laboratório de Micologia (cont.) PROTOCOLO de OBSERVAÇÂO de FUNGOS AO MO (preparação entre lâmina e lamela) 1. com o auxílio de um bisturi esterilizado (passado à chama) raspa-se ligeiramente um pouco de micélio de placa de Petri. 2. coloca-se esse micélio entre a lamina e a lamela, sobre uma gota de ácido láctico. 3. observação ao microscópio ótico, começando por focar na ampliação mais baixa (x100) 4. microfotografia com escala ampliação x Desenha aqui em traços largos o que observaste ao microscópio. Não te esqueças de anotar a ampliação que deves calcular efetuando a seguinte multiplicação ampliação das oculares (=x10) x ampliação da objetiva Nota: para além do microscópio ótico, também se recorre a observações no microscópio eletrónico de varrimento (SEM = scanning electron microscope) que permite ampliações muito superiores às do MO e microfotografias de grande beleza. Manual de Estágio 13

14 5ª feira, 4 Julho 10:00 Eletroforese em gel de agarose 12:15 - Palestra P3 Exploração sustentável dos recursos cinegéticos/ Uma viagem pelo mundo das abelhas melíferas. Ricardo Paiva e Joana Godinho. Auditório da ex-efn Almoço Observação e discussão dos resultados obtidos no gel de agarose Explicação e discussão dos resultados obtidos na sequenciação do gene em estudo (Figura 4) possível identificação do fungo patogénico isolado de sobreiros doentes, em conjunção com as características morfológicas do fungo observadas anteriormente. Figura 4. representação esquemática dos genes do DNA ribossomal do fungo com particular destaque para a região dos ITS (internal transcribed spacer). Manual de Estágio 14

15 Laboratório de Genética Florestal (cont.) Cola aqui o teu gel e identifica cada uma das bandas obtidas Quando o DNA do nosso fungo corresponde a uma única banda significa que todo o processo correu bem e que podemos enviar esse DNA purificado para a sequenciação (num sequenciador). Vamos obter a sequência de bases da região do DNA escolhida para estudo do fungo e visualizamo-la num cromatograma. Por comparação desta sequência com as bases de dados internacionais, conseguimos identificar o fungo patogénico do sobreiro. Cola aqui o teu cromatograma e identifica cada uma das letras de cores diferentes e a que corresponde o tamanho dos picos Manual de Estágio 15

16 6ª feira, 5 Julho 10:00 Apresentações dos estágios Ciência Viva 12:15 - Palestra P4 Produtos florestais madeira, cortiça e resina; principais aplicações. Abel Rodrigues, Miguel Pestana e Amélia Palma. Auditório da ex-efn Almoço Continuação da apresentação dos estágios Ciência Viva Entrega dos diplomas Ciência Viva Lanche Viva a Ciência! (no Lab. de Nematologia) Despedida e um até breve! A equipa do A Floresta ao Microscópio I Manual de Estágio 16