BIOLISA T4 LIVRE K097 INSTRUÇÕES DE USO

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1 BIOLISA T4 LIVRE K097 INSTRUÇÕES DE USO FINALIDADE Teste para determinação quantitativa de concentração de T4 LIVRE, em soro humano, por imaimunoensaio, em microplaca. Somente para uso diagnóstico in vitro. PRINCÍPIO DE AÇÃO O kit Biolisa T4 Livre é altamente sensível e requer pouca manipulação técnica. Neste método, primeiro são pipetados nas respectivas microcavidades da placa, os padrões de referência, amostras de pacientes e controles. Em seguida, adiciona-se o Conjugado imático de T4 (método análogo ao do T4 Total) e a reação é homogeneizada. Uma reação competitiva resulta da combinação entre o Conjugado imático e o Tiroxina Livre, presente na amostra, com o número limitado de anticorpos combinantes imobilizados nas microcavidades da placa. Essa interação é ilustrada pela seguinte equação: Ag + Ag + Ac mc + Onde: Ac mc = Anticorpo monoclonal imobilizado na microcavidade (constante) Ag = Antígeno nativo (variável) Ag = Conjugado enzimático = Complexo antígeno-anticorpo = Conjugado enzima-antígeno - complexo anticorpo = razão constante de associação = razão constante de dissociação K= / = Equilíbrio constante Após completado o período de incubação, o anticorpo aderente Conjugado é separado do antígeno não aderente por aspiração ou decantação. A atividade enzimática na superfície da microcavidade é quantificada pela reação de cor, produzida com substrato. O uso de diversos padrões de referência de concentrações conhecidas de T4 Livre permite a construção de um gráfico de atividade e concentração. A atividade enzimática das amostras desconhecidas (pacientes) é comparada com a curva-padrão, determinando-se a concentração dessas amostras através da correlação das mesmas com a curva-padrão. REAGENTES 1- Padrões referência ( A-F ) - Conservar entre 2 e 8ºC. Seis (6) frascos ( A-F ) de Padrões referência contendo Tiroxina Livre em diferentes concentrações, em solução de tampão ph 7,4 e azida sódica. Obs.: Níveis exatos de lotes específicos são dados nos rótulos. Consultar os frascos de padrões do kit em uso e considerar os valores dos mesmos. 2- Conjugado - Conservar entre 2 e 8ºC. Tiroxina conjugada com enzima peroxidase (HRP). Contém azida sódica. 3- Placa Sensibilizada - Conservar entre 2 e 8ºC. 4- Lavagem concentrada - Conservar entre 2 e 8ºC. Solução de fosfato salina ph 7,4 e azida sódica. 5- Substrato A - Conservar entre 2 e 8ºC. Tetrametilbenzidina (TMB). 6- Substrato B - Conservar entre 2 e 8ºC. Solução de Peróxido de hidrogênio (H 2 O 2 ). 7- Solução de parada - Conservar entre 2 e 8ºC. Ácido Clorídrico (HCl) 1N. APRESENTAÇÃO APRESENTAÇÃO 1 2 REAGENTES 96 CAVIDADES 192 CAVIDADES 1- Padrões Referência 2 - Conjugado 1 Frasco x 13 ml 2 Frascos x 13 ml 3 - Placa Sensibilizada 4 - Lavagem concentrada 1 Unidade (96 cavidades) 2 Unidades (96 cavidades) 1 Frasco x 20 ml 1 Frasco x 20 ml 5 - Substrato A 1 Frasco x 7 ml 2 Frascos x 7 ml 6 - Substrato B 1 Frasco x 7 ml 2 Frascos x 7 ml 7 - Solução de Parada EQUIPAMENTOS E INSUMOS OPERACIONAIS Materiais contidos no Kit: -Reagentes descritos no quadro anterior -Instruções de uso (manual). 1 Frasco x 8 ml 2 Frascos x 8 ml Materiais necessários, mas não contidos no kit: 1- Pipeta(s) com capacidade de dispensar volumes de 50 ml, com precisão maior que 1,5%. 2- Repipetador(es) para dispensagens repetitivas de volumes de 100 ml e 300 ml, com precisão maior que 1,5% (opcional) ou pipeta multicanal. 3- Lavadora de microplaca (opcional) ou pipetas para lavagem das 4- Leitora de ELISA com capacidade de absorbância em 450/630 nm de comprimento de onda. 5- Pipetas com volumes reguláveis (200 ml a 1000 ml) para diluição do Substrato. 6- Tubos de ensaio para a diluição do Substrato A e B. 7- Papel absorvente para secar as 8- Embalagem plástica ou cobertura de microplaca para os passos de incubação. 9- Cronômetro ou relógio. 10- Frasco para estocar a solução de lavagem. 11- Água destilada ou deionizada. 12- Ferramentas de Controle de Qualidade. CONDIÇÕES DE ARMAZENAMENTO E TRANSPORTE A temperatura de armazenamento deverá ser de 2 a 8 C. O transporte em temperaturas entre 15 e 30 C não deverá exceder a 72 (setenta e duas) horas. Não congelar. Manter ao abrigo da luz e evitar umidade. CUIDADOS ESPECIAIS 1- Somente para uso diagnóstico in vitro. 2- Seguir com rigor a metodologia proposta para a obtenção de resultados exatos. 3- Recolocar as tiras de microcavidades não utilizadas no invólucro de alumínio, vedar e estocar a 2-8 C. 4- A água utilizada na limpeza do material deve ser recente e isenta de contaminantes. 5- Colunas deionizadoras saturadas liberam água alcalina, íons diversos e agentes oxidantes e redutores, que podem alterar de forma significativa os resultados. 6- Por medida de proteção, pode-se cobrir a placa durante a reação. Caso opte por este procedimento, é necessário que seja estabelecido como rotina. 7- Toda matéria-prima do produto é testado e deve ser não reagente para HBsAg, Anti-HIV 1&2 e Anti-HCV. Entretanto, esses testes não oferecem total segurança da ausência de agentes infecciosos. A manipulação manual de todo produto que ontém soro humano é potencialmente capaz de transmitir doenças. Portanto, é preciso tomar os devidos cuidados de biossegurança na manipulação desses produtos. 8- Pipetar os reagentes sempre na mesma ordem para minimizar a diferença de tempo de reação entre as 9- Recomendamos aplicar as normas locais, estaduais e federais de proteção ambiental para que o descarte dos reagentes e do material biológico seja feito de acordo com a legislação vigente. 10- Para obtenção de informações relacionadas à biossegurança ou em caso de acidentes com o produto, consultar as FISPQ (Ficha de Informações de Segurança de Produtos Químicos) disponibilizadas no site ou através de solicitação pelo SAC (Serviço de Assessoria ao Cliente) da Quibasa. AMOSTRAS As precauções e tipos usuais de punção venosa devem ser observadas na coleta das amostras. Para melhor parâmetro de comparação com valores normais, colher a amostra à primeira hora da manhã. Colher em tubo sem aditivos. Separar as células vermelhas por centrifugação e usar o soro obtido para o ensaio de T4 LIVRE. Amostra(s) hemolisadas ou altamente lipêmicas não devem ser usadas. As amostras podem ser conservadas sob refrigeração, entre 2 e 8ºC pelo período máximo de cinco (5) dias. Se as amostras não puderem ser analisadas dentro de cinco dias, podem ser estocadas por até 30 dias a temperatura de -20ºC (freezer). Se o ensaio for feito em duplicata, o volume necessário de amostra é de 0,100 ml. DESCRIÇÃO DO PROCESSO PREPARO DOS REAGENTES DE TRABALHO Solução de lavagem Diluir o conteúdo do frasco Nº4 (Lavagem Concentrada) em 1000 ml de água destilada ou deionizada. Estocar em temperatura ambiente até a validade impressa no frasco original. Substrato Solução de Trabalho Determinar a quantidade de cavidades a serem utilizadas para preparo de um volume adequado. Preparar a solução misturando partes iguais do Substrato A e Substrato B 15 minutos antes de sua utilização. Mantenha-o protegido da luz até ser utilizado. Para cada microcavidade (teste), utilizar: 50 ml de Substrato A + 50 ml de Substrato B Por exemplo: misture 1 ml de Substrato A e 1 ml de Substrato B para duas tiras de 8 microcavidades (16 testes). Ocorre sobra de reagente. Usar no máximo até uma (1) hora após preparo. TÉCNICA Antes de começar o ensaio, colocar todos os reagentes, padrões de referência e controles em temperatura ambiente (15-30ºC). 1- Separar as microcavidades a serem utilizadas considerando: Padrões, controles e amostras (podendo ser testados em duplicata.) 2- Pipetar 0,050 ml (50 ml) dos padrões, controles e amostras em suas respectivas 3- Pipetar 0,100 ml (100 ml) do reagente Conjugado em todas as 4- Homogeneizar gentilmente por 20 a 30 segundos. 5- Incubar por 60 minutos em temperatura ambiente. 6- Descartar o conteúdo das microcavidades por aspiração (Lavadora), ou decantação; 7- Pipetar aproximadamente 300 ml de solução de lavagem, previamente preparada,* em todas as *Vide PREPARO DOS REAGENTES DE TRABALHO. Decantar ou aspirar (lavadora), para um total de cinco (5) Ciclo de lavagens. Para a garantia da secagem da placa, bater em papel absorvente. 8- Pipetar 0,100 ml (100 ml) do Substrato, previamente preparado,* em todas as *Vide PREPARO DOS REAGENTES DE TRABALHO. 9- Incubar por quinze (15) minutos em temperatura ambiente, ao abrigo da luz. 10- Pipetar 0,050 ml (50 ml) de solução de parada em todas as Homogeneizar gentilmente por 15 a 20 segundos. 11- Ler a absorbância de cada microcavidade em 450/630 nm em uma leitora de ELISA. Os resultados podem ser lidos em até trinta (30) minutos após a adição da solução de parada. CÁLCULOS Uma curva de calibração é usada para determinar a concentração de Tiroxina Livre em amostras desconhecidas (pacientes). Preparo da curva de calibração Registrar as absorbâncias obtidas na Leitora de microplaca, como apresentado no exemplo 1. Plotar as absorbâncias de cada soro de referência (padrão) versus a concentração correspondente de T4 Livre em ng/dl em papel de gráfico linear (não calcule as médias das duplicatas antes de plotá-las no gráfico). Traçar a curva. Exemplo 1 Figura 1 Absorbância PADRÕES MICROCAVIDADE ABS. (60 MIN.) A (0,0 ng/dl) B (0,4 ng/dl) C (1,1 ng/dl) D (2,1 ng/dl) E (4,2 ng/dl) F (7,4 ng/dl) 1 2, , , , , , , , , , , ,421 Concentração de T4 Livre (ng/dl) Os dados apresentados no exemplo 1 e figura 1 são apenas para ilustração e não podem ser usados em substituição à curva-padrão, que deve ser construída em cada ensaio. LIMITAÇÃO DO PROCESSO Performance do ensaio Os padrões referência e controles podem ficar turvos com o tempo. Isso não afeta a performance do teste. Use até o término ou até a data de validade. É muito importante que o tempo de reação de cada microcavidade seja constante para a boa reprodutibilidade dos resultados. A pipetagem das amostras não pode se estender por mais de dez (10) minutos para evitar desvios no ensaio. Se for usada mais que uma (1) placa, é recomendável repetir a curva.

2 A adição do Substrato inicia a reação cinética, que é encerrada pela adição da solução de parada. Logo, a adição do Substrato e da solução de parada deve ocorrer na mesma seqüência para eliminar desvios de tempo durante a reação. Leitoras de elisa lêem na vertical. Não toque o fundo das Falhas no processo de lavagem podem resultar em resultados imprecisos ou incorretos. Interpretação Se for usado um programa para interpretar os resultados, é imprescindível que se estabeleça uma margem de erro de 10% para os resultados dos calibradores e amostras. A Tiroxina, principal hormônio da tireóide, circula na corrente sangüínea transportado por proteínas. O veículo transportador é o TBG. Apenas a porção livre da Tiroxina (não transportada por TBG) é responsável pela ação biológica CONTROLE INTERNO DE QUALIDADE O Laboratório Clínico deve possuir um programa interno de controle da qualidade, onde procedimentos, normas, limites e tolerância para variações sejam claramente estabelecidos. É importante ressaltar que todos os sistemas de medição apresentam uma variabilidade analítica característica, que deve ser monitorada pelos próprios laboratórios. Para tanto, é recomendável a utilização de controles, que permitem avaliar a precisão e a exatidão das dosagens. PARÂMETRO DE CONTROLE DE QUALIDADE Absorbância Calibrador (0 ng/dl) 1,5 VALORES DE REFERÊNCIA Valores normais para o KIT BIOLISA T4 LIVRE em ng/dl Adultos Gestantes Variação normal 0,8 a 2 ng/dl 0,8 a 2,2 ng/dl DESEMPENHO DO PRODUTO CONTROLE DE QUALIDADE Exatidão COMPARAÇÃO DE MÉTODOS E ESPECIFICIDADE METODOLÓGICA O Biolisa T4 Livre foi comparado com outro método ELISA disponível comercialmente. Foram utillizadas 07 amostras de população hipotireóide, eutireóide e hipertiróide (0,36 a 6,4 ng/dl). A equação de regressão linear obtida foi Y = 0,8993X + 0,1528 e o coeficiente de correlação igual a 0,9995. Com estes resultados pode-se concluir que o kit apresenta boa especificidade metodológica. Precisão REPETIBILIDADE Foram realizadas 20 dosagens consecutivas com 3 amostras, obtendo-se os seguintes resultados: AMOSTRA 1 AMOSTRA 2 AMOSTRA 3 Concentração (ng/dl) 1,74 5,53 0,40 Desvio Padrão (ng/dl) 0,08 0,26 0,02 Coeficiente de Variação (%) 4,74 4,73 4,88 REPRODUTIBILIDADE Foram realizadas 20 dosagens sucessivas com três amostras, durante 3 dias consecutivos, obtendo-se os seguintes resultados : AMOSTRA 1 AMOSTRA 2 AMOSTRA 3 Concentração (ng/dl) 1,84 5,82 0,40 Desvio Padrão (ng/dl) 0,09 0,26 0,01 Coeficiente de Variação (%) 4,83 4,39 2,50 Sensibilidade A sensibilidade do Kit é 0,05 ng/dl. A sensibilidade foi estabelecida pelo determinante de variabilidade do padrão de 0 ng/dl. Linearidade A reação é linear até a concentração do ponto mais alto da curva de calibração. Para amostras com valores superiores, diluir a mesma com Cloreto de Sódio 0,85%, repetir a dosagem e multiplicar o resultado obtido pelo fator de diluição. Especificidade As reações cruzadas de Anti-Tiroxina com determinadas substâncias, foram avaliadas com adição de interferentes em um padrão, em várias concentrações. As reações cruzadas foram calculadas pela razão entre uma dosagem de substância interferente e dosagem de tiroxina necessária para substituir a mesma quantidade do marcador. SUBSTANCIA REAÇÕES CRUZADAS CONCENTRAÇÃO L-Tiroxina 1, D-Tiroxina 0, mg/ml D-Triiodotironina 0, mg/ml L-Triiodotironina 0, mg/ml Iodotirosina 0, mg/ml Diiodotirosina 0, mg/ml Diiodotironina 0, mg/ml SIGNIFICADO DIAGNÓSTICO As concentrações das proteínas transportadas (TBG) são alteradas em diversas situações clínicas, como, por exemplo, na gestação. Numa tireóide de função normal, se as proteínas transportadoras (TBG) se alteram, os níveis de T4 Total também mudam, mas a porção livre permanece constante. Portanto, a quantificação da concentração do T4 Livre constitui parâmetro melhor que o T4 Total para a determinação de quadro clínico. Por exemplo, o aumento dos níveis de T4 Total estão associados a estados de gestação, uso de contraceptivos orais e tratamentos com estrógenos, resultando em níveis de T4 Total acima do limite de normalidade, enquanto que a concentração de T4 Livre permanece dentro da faixa de normalidade. Alterações nos níveis de TBG podem levar a diagnósticos equivocados de Hiper e Hipotireoidismo, se for considerada apenas a concentração de T4 Total. Ressaltando, o T4 Livre, normalmente, revela o quadro clínico atual do paciente. NÚMERO DE TESTES 96/192 Testes REFERÊNCIAS 1) Barker, S.B., Determination of Protein Bound Iodine. Journal Biological Chemestry, 173, 175 (1948) 2) Chopra, I.J., Solomon, D.H., and Ho, R.S., A Radioimunoassay of Thyroxine. Journal Clinical Endocrinol., 33,865 (1971) 3) Young, D.S., Pestaner, L.C., and Gilberman, U. Effects of Drugs on Clinical Laboratory Tests. Clinical Chemestry, 21, 3660 (1975) 4) Sterling, L., Diagnosis and treatment of Thyroid Disease, Cleveland CRC Press, P (1975). GARANTIA DA QUALIDADE Antes de serem liberados para consumo, todos os reagentes Bioclin são testados pelo Departamento de Controle de Qualidade. A qualidade dos reagentes é assegurada até a data de validade mencionada na embalagem de apresentação, desde que armazenados e transportados nas condições adequadas. DADOS DO FABRICANTE QUIBASA QUÍMICA BÁSICA Ltda Rua Teles de Menezes, 92 - Santa Branca CEP Belo Horizonte - MG - Brasil Tel.: ( 31 ) Fax: ( 31 ) bioclin@bioclin.com.br CNPJ: / Indústria Brasileira ATENDIMENTO AO CONSUMIDOR Serviço de Assessoria ao Cliente Tel.: sac@bioclin.com.br Número de registro do kit Biolisa T4 Livre na ANVISA: Revisão: Maio/12

3 BIOLISA T4 LIBRE K097 INSTRUCCIONES DE USO FINALIDAD Test para determinación cuantitativa de concentración de T4 LIBRE, en suero humano, por imainmunoensayo, en microplaca. Solamente para uso diagnóstico in vitro. PRINCIPIO DE ACCIÓN El kit BIOLISA T4 LIBRE es altamente sensible y requiere poca manipulación técnica. En este método, primero son pipeteados en las respectivas microcavidades de la placa, los patrones de referencia, muestras de pacientes y controles.en seguida, se adiciona el Conjugado imático de T4 (método análogo al del T4 Total) y la reacción es homogenizada. Una reacción competitiva resulta de la combinación entre el Conjugado imático y la Tiroxina Libre, presente en la muestra, con el número limitado de anticuerpos combinantes inmobilizados en las microcavidades de la placa. Esa interacción es ilustrada por la siguiente ecuación: Ag + Ag + Ac mc + Donde: Ac mc = Anticuerpo monoespecífico inmobilizado en la microcavidad (constante) Ag = Antígeno nativo (variable) Ag = Conjugado enzimático = Complejo antígeno-anticuerpo = Conjugado enzima-antígeno - complejo anticuerpo = razón constante de asociación = razón constante de disociación K = / = Equilibrio constante Luego de completado el periodo de incubación, el anticuerpo adherente Conjugado imático-t4 es separado del antígeno no adherente por aspiración o decantación. La actividad enzimática en la superficie de la microcavidad es cuantificada por la reacción de color, producida con sustrato. El uso de diversos patrones referencia de concentraciones conocidas de T4 Libre permite la construcción de un gráfico de actividad y concentración. La actividad enzimática de las muestras desconocidas (pacientes) es comparada con la curva-patrón, determinándose la concentración de esas muestras a través de la correlación de las mismas con la curva-patrón. REACTIVOS 1- Patrones Referencia ( A-F ) - Almacenar entre 2 y 8ºC. Seis (6) frascos ( A-F ) de Patrones referencia conteniendo Tiroxina Libre en diferentes concentraciones, en solución de tampón ph 7,4 y azida sódica. Nota: Níveles exactos de lotes específicos son datos en los rótulos. Consultar los frascos de patrones do kit en uso y considerar los valores de los mismos. 2- Conjugado - Almacenar entre 2 y 8ºC. Tiroxina conjugada con enzima peroxidasis (HRP). Contiene azida sódica. 3- Placa Sensibilizada - Almacenar entre 2 y 8ºC. 4- Solución de lavado concentrado - Almacenar entre 2 y 8ºC. Solución de fosfato salina ph 7,4 y azida sódica. 5- Sustrato A - Almacenar entre 2 y 8ºC. Tetrametilbenzidina (TMB). 6- Sustrato B - Almacenar entre 2 y 8ºC. Solución de Peróxido de hidrógeno (H 2 O 2 ). 7- Solución de parada - Almacenar entre 2 y 8ºC. Ácido Clorídrico (HCl) 1N. PRESENTACIÓN PRESENTACIÓN 1 2 REACTIVOS 96 CAVIDADES 192 CAVIDADES 1 - Patrones Referencia 2 - Conjugado 1 Frasco x 13 ml 2 Frascos x 13 ml 3 - Placa Sensibilizada 4 - Solución de lavado concentrado 1 Unidade (96 Cavidades) 2 Unidades (96 Cavidades) 1 Frasco x 20 ml 1 Frasco x 20 ml 5 - Sustrato A 1 Frasco x 7 ml 2 Frascos x 7 ml 6 - Sustrato B 1 Frasco x 7 ml 2 Frascos x 7 ml 7 - Solución de parada 1 Frasco x 8 ml 2 Frascos x 8 ml EQUIPAMIENTOS E INSUMOS OPERACIONALES Materiales contenidos en el Kit: -Reactivos descritos en el cuadro anterior -Instrucciones de uso (manual). Materiales necesarios, pero no contenidos en el kit: 1- Pipeta(s) con capacidad de expender volúmenes de 50 ml, con precisión mayor que 1,5%. 2- Repipetador(es) para distribución repetitivas de volúmenes de 100 ml y 300 ml, con precisión mayor que 1,5% (opcional) o pipeta multicanal. 3- Lavadora de microplaca (opcional) o pipetas para lavado de las 4- Lectora de ELISA con capacidad de absorbancia en 450/630 nm de longitud de onda. 5- Pipetas con volúmenes regulables (200 ml a 1000 ml) para dilución del Sustrato. 6- Tubos de ensayo para la dilución del Sustrato A y B. 7- Papel absorvente para secar las 8- Embalaje plástico o cobertura de microplaca para los pasos de incubación. 9- Cronómetro o reloj. 10- Frasco para almacenar la solución de lavado. 11- Agua destilada o deionizada. 12- Herramientas de Controle de Calidad. CONDICIONES DE ALMACENAMIENTO Y TRANSPORTE La temperatura de almacenamiento deberá ser de 2 a 8 C. El transporte en temperaturas entre 15 y 30 C no deberá exceder a 72 (setenta y dos) horas. No congelar. Mantener al abrigo de la luz y evitar humedad. CUIDADOS ESPECIALES 1- Solamente para uso diagnóstico in vitro. 2- Seguir con rigor la metodología propuesta para la obtención de resultados exactos. 3- Recolocar las tiras de microcavidades no utilizadas en el involtorio de aluminio, vedar y almacenar a 2-8 C. 4- El agua utilizada en la limpieza del material debe ser reciente e exenta de contaminantes. 5- Columnas deionizadoras saturadas liberan agua alcalina, íones diversos y agentes oxidantes y reductores, que pueden alterar de forma significativa los resultados. 6- Por medida de protección, se puede cubrir la placa durante a reacción. Caso opte por este procedimiento, es necesario que sea establecido como rutina. 7- Toda materia prima del producto es testado y debe ser no reactivo para HBsAg, Anti-HIV 1&2 y Anti-HCV. Sin embargo, esos tests no ofrecen total seguridad de la ausencia de agentes infecciosos. La manipulación manual de todo producto que contiene suero humano es potencialmente capaz de transmitir dolencias. Por lo tanto, es preciso tomar los debidos cuidados de bioseguridad en la manipulación de esos productos. 8- Pipetear los reactivos siempre en el mism orden para minimizar la diferencia de tiempo de reacción entre las 9- Se recomienda la aplicación de la ley local, estatal y federal de protección ambiental para la eliminación de reactivos y material biológico se hace de acuerdo con la legislación vigente. 10- Para obtener información relacionada con la seguridad biológica o en caso de accidentes con el producto, consultar la FISPQ (Ficha de Informaciones de la Seguridad de Productos Químicos) disponibles en el site o solicitando a través del SAC (Servicio de Asesoría al Cliente) de Quibasa. MUESTRAS Las precauciones y tipos usuales de punción venosa deben ser observadas en la colecta de las muestras. Para mejor parámetro de comparación con valores normales, coger la muestra a la primera hora de la mañana. Coger en tubo sin aditivos. Separar las células rojas por centrifugación y usar el suero obtenido para el ensayo de T4 LIBRE. Muestra(s) hemolizadas o altamente lipémicas no deben ser usadas. Las muestras puedem ser conservadas bajo refrigeración, entre 2 y 8ºC, por el período máximo de 5 días. Si las muestras no pudieran ser analizadas dentro de 5 días, pueden ser almacenadas por hasta 30 días a temperatura de -20ºC (congelado). Para muestras que sean testadas en duplicado, el volumen necesario de muestra es de 0,100 ml. DESCRIPCIÓN DEL PROCESO PREPARO DE LOS REACTIVOS DE TRABAJO Solución de lavado Diluir el contenido del frasco Nº4 (Solución de Lavado Concentrado) en 1000 ml de agua destilada o deionizada. Almacenar en temperatura ambiente hasta la validad impresa en el frasco original. Sustrato Solución de Trabajo Determinar la cantidad de cavidades a ser utilizadas para preparo de un volúmen adecuado. Preparar la solución mezclando partes iguales de Sustrato A y Sustrato B, 15 minutos antes de su utilización. Manténgalo protegido de la luz hasta ser utilizado. Para cada microcavidad (test), utilizar: 50 L de Sustrato A + 50 L de Sustrato B Por ejemplo: mezcle 1mL de Sustrato A y 1mL de Sustrato B para dos tiras de 8 microcavidades (16 tests). Ocurre sobra de reactivo. Usar máximo hasta una (1) hora luego del preparo. TÉCNICA Antes de comenzar el ensayo, colocar todos los reactivos, muestras, patrones referencia y controles para estabilizarlos en temperatura ambiente (15-30ºC). 1- Separar las microcavidades a ser utilizadas considerando: Patrones, controles y muestras (pudiendo ser testados en duplicada.) 2- Pipetear 0,050 ml (50 ml) de los patrones, controles y muestras en sus respectivas 3- Pipetear 0,100 ml (100 ml) del reactivo Conjugado en todas las 4- Homogenizar la placa de 20 a 30 segundos. 5- Incubar por 60 minutos en temperatura ambiente 6- Descartar el contenidodo de las microcavidades por aspiración (Lavadora), o decantación; 7- Pipetear aproximadamente 300 ml de solución de lavado, previamente preparado,* en todas las *Ved PREPARO DE LOS REACTIVOS DE TRABAJO*. Decantar o aspirar (lavadora), para un total de cinco (5) ciclos de lavado. Para la garantía de secado de la placa, batir en papel absorvente. 8- Pipetear 0,100 ml (100 ml) del Sustrato, previamente preparado,* en todas las *Ved PREPARO DE LOS REACTIVOS DE TRABAJO. 9- Incubar por quince (15) minutos en temperatura ambiente, al abrigo de la luz. 10- Pipetear 0,050 ml (50 ml) de solución de parada en todas las Homogenizar gentilmente por 15 a 20 segundos. 11- Leer la absorbancia de cada microcavidad en 450/630 nm en una lectora de ELISA. Los resultados pueden ser leídos en hasta treinta (30) minutos después de la adición de la solución de parada. CÁLCULOS Una curva de calibración es utilizada para determinar la concentración de Tiroxina Libre en muestras desconocidas (pacientes). Preparo de la curva de calibración. Registrar la absorbancia obtenida en la lectora de microplaca como discriminado en el Ejemplo 1. Plotear las absorbancias de patrones referencia versus la concentración de T4 Libre en ng/dl en papel de gráfico linear(no calcule los promedios de las duplicadas antes de plotearlas en el gráfico). Trazar la curva. Ejemplo 1 Figura 1 Absorbancia PATRONES MICROCAVIDAD ABS. (60 MIN.) A (0,0 ng/dl) B (0,4 ng/dl) C (1,1 ng/dl) D (2,1 ng/dl) E (4,2 ng/dl) F (7,4 ng/dl) 1 2, , , , , , , , , , , ,421 Concentración de T4 Libre (ng/dl) Los datos presentados en el ejemplo 1 y Figura 1 son solamente para ilustrar y no deben ser usados en lugar de la curva-patrón que debe ser constituida en cada ensayo. LIMITACIÓN DEL PROCESO Performance del ensayo Los patrones referencia y controles pueden quedar turbios con el tiempo. Eso no afecta la performance del test. Use hasta el término o hasta la fecha de validad.

4 Es muy importante que el tiempo de reacción en cada microcavidad sea observado constantemente para la reproducción de los resultados. Pipetear las muestras no debe llevar más que 10 (diez) minutos para evitar desvío del test. Si más de 1 (una) placa es usada, es recomendable repetir la curva. La adición de sustrato inicia una reacción cinética, la cual es encerrada con la adición de la solución de parada. Sin embargo, la adición del sustrato y de la solución de parada debe ser procesada en la misma secuencia para eliminar qualquier desvío de tiempo durante la reacción. Lectoras de elisa leen en la vertical. No tocar en la base de las Fallas en el proceso de lavado pueden generar resultados imprecisos o incorrectos. Interpretación Si fuera usado un programa de computador para interpretar los resultados del test, es necesario que el valor de los calibradores caiga dentro de 10% para los resultados de los calibradores y muestras. La Tiroxina, principal hormona da tiróides, circula en la corriente sangüínea transportado por proteínas. El vehículo transportador es el TBG. Apenas la porción libre da Tiroxina (no transportada por TBG) es responsable por la acción biológica CONTROL INTERNO DE CALIDAD El Laboratorio Clínico debe poseer un programa interno de control de calidad, donde procedimientos, normas, límites y tolerancia para variaciones sean claramente establecidos. Es importante resaltar que todos los sistemas de medición presentan una variabilidad analítica característica, que debe ser vigilada por los propios laboratorios. Por lo tanto, es recomendable la utilización de controles, que permiten la evaluación, la precisión y la exactitud de las dosificaciones. PARÁMETRO DE CONTROL DE CALIDAD Absorbancia calibrador (0 ng/dl) 1,5 VALORES DE REFERENCIA Valores normais para o KIT BIOLISA T4 LIBRE en ng/dl Adultos Gestantes Variación normal 0,8 a 2 ng/dl 0,8 a 2,2 ng/dl DESEMPEÑO DEL PRODUCTO CONTROL DE CALIDAD Exactitud COMPARACIÓN DE MÉTODOS Y ESPECIFICIDAD METODOLÓGICA El BIOLISA T4 LIBRE fue comparado con otro método ELISA disponible comercialmente. Fueron utillizadas 07 muestras de poblacióno hipotiroides, eutirodes y hipertiroides(0,36 a 6,4 ng/dl). La ecuación de regresión linear obtenida fue Y = 0,8993X + 0,1528 y el coeficiente de correlación igual a 0,9995. Con estos resultados se puede concluir que el kit presenta buena especificidad metodológica. Precisión REPETIBILIDAD Fueron realizadas 20 dosificaciones consecutivas con 3 muestras, obteniéndose los siguientes resultados: MUESTRA 1 MUESTRA 2 MUESTRA 3 Concentración (ng/dl) 1,74 5,53 0,40 Desvío Patrón (ng/dl) 0,08 0,26 0,02 Coefficiente de Variación (%) 4,74 4,73 4,88 REPRODUCTIBILIDAD Fueron realizadas 20 dosificaciones sucesivas con tres muestras, durante 3 días consecutivos, obteniéndose los siguientes resultados: MUESTRA 1 MUESTRA 2 MUESTRA 3 Concentración (ng/dl) 1,84 5,82 0,40 Desvío Patrón (ng/dl) 0,09 0,26 0,01 Coefficiente de Variación (%) 4,83 4,39 2,50 Sensibilidad La sensibilidad del Kit BIOLISA T4 LIBRE es 0,05 ng/dl. La sensibilidad fue establecida por el determinante de variabilidad del patrón de 0 ng/dl. Linearidad La reacción es linear hasta la concentración del punto más alto de la curva de calibración. Para muestras com valores superiores, diluir la misma con Cloruro de Sódio 0,85%, repetir la dosificación y multiplicar el resultado obtenido por el factor de dilución. Especificidad Las reaccines cruzadas de Anti-Tiroxina con determinadas sustancias, fueron evaluadas con adición de interferentes en un patrón, en varias concentraciones. Las reacciones cruzadas fueron calculadas por la razón entre una dosificación de sustancia interferente y dosificación de tiroxina necesaria para substituir la misma cantidad del marcador. SUBSTANCIA REACCIONES CRUZADAS CONCENTRACIÓN L-Tiroxina 1, D-Tiroxina 0, mg/ml D-Triiodotironina 0, mg/ml L-Triiodotironina 0, mg/ml Iodotirosina 0, mg/ml Diiodotirosina 0, mg/ml Diiodotironina 0, mg/ml SIGNIFICADO DIAGNÓSTICO Las concentraciones de las proteínas transportadas (TBG) son alteradas en diversas situaciones clínicas, como, por ejemplo, en la gestación. En una tiroides de función normal, si las proteínas transportadoras (TBG) se alteran, los niveles de T4 Total también cambian, pero la porción libre permanece constante. Por lo tanto, la cuantificación de la concentración de T4 Libre constituye parámetro mejor que el T4 Total para la determinación del cuadro clínico. Por ejemplo, el aumento de los niveles de T4 Total estan asociados al estado de gestación, uso de anticonceptivos orales y tratamientos con estrógenos, resultando en niveles de T4 Total encima del límite de normalidad, en cuanto que la concentración de T4 Libre permanece dentro del rango de normalidad. Alteraciones en los niveles de TBG pueden llevar a diagnósticos equivocados de Hiper y Hipotiroidísmo, si fuera considerada apenas la concentración de T4 Total. Resaltando, el T4 Libre, normalmente, revela el cuadro clínico actual del paciente. NÚMERO DE PRUEBAS 96/192 Pruebas REFERENCIAS 1) Barker, S.B., Determination of Protein Bound Iodine. Journal Biological Chemestry, 173, 175 (1948) 2) Chopra, I.J., Solomon, D.H., and Ho, R.S., A Radioimunoassay of Thyroxine. Journal Clinical. Endocrinol., 33,865 (1971) 3) Young, D.S., Pestaner, L.C., and Gilberman, U. Effects of Drugs on Clinical Laboratory Tests. Clinical Chemestry, 21, 3660 (1975) 4) Sterling, L., Diagnosis and treatment of Thyroid Disease, Cleveland CRC Press, P (1975). GARANTÍA DE CALIDAD Antes de ser liberado para el consumo, todos los reactivos Bioclin son testados por el Departamento de Control de Calidad. La calidad de los reactivos es asegurada hasta la fecha de validad mencionada en el embalaje de presentación, desde que sean almacenados y transportados en las condiciones adecuadas. DATOS DEL FABRICANTE QUIBASA QUÍMICA BÁSICA Ltda Rua Teles de Menezes, 92 - Santa Branca CEP Belo Horizonte - MG - Brasil Tel.: +55 (31) Fax: +55 (31) bioclin@bioclin.com.br CNPJ: / Industria Brasileña ATENDIMIENTO AL CONSUMIDOR Servicio de Asesoría al Cliente Tel.: sac@bioclin.com.br Número de registro del kit Biolisa T4 libre en la ANVISA: Revisión: Mayo/12

5 T4 FREE BIOLISA K097 USAGE INSTRUCTIONS FUNCTION Method for the quantitative detection of Free T4 concentration in human serum or plasma, by enzyme immunoassay in microplates. For in vitro diagnostic only. PRINCIPLE OF ACTION The Biolisa Free T4 kit is highly sensitive and requires little technical manipulation. In this method, at first pipette into respective micro cavities of the plate, reference standards, samples from patients and controls. Then, you add the enzyme conjugate T4 (T4 method similar to that of Total) and the reaction is mixed. A competition reaction results between the enzyme conjugate and Free Thyroxine, present in thesample to a limited number of immobilized combining antibodies in the micro cavities of the plate. This interaction is illustrated by the following equation: enz Ag + Ag + Ac mc + Where: Ac mc = Monospecific Antibody immobilized in micro cavity (constant) Ag = Native Antigen (Variable) Ag = ymatic Conjugate = Antigen-antibody complex =enzymatic-antigen-complex conjugated antibody = Constant Rate of Association = Constant Rate of dissociation K = / Constant Equilibrium After completing the incubation period, the antibody-bound T4-enzyme conjugate is separated from unbound antigen by decantation or aspiration. The enzyme activity on the surface of the micro cavities is quantified by the color of the reaction was produced with the substrate. The use of different reference standards of known concentrations of free T4 allows the construction of a graph of activity and concentration. The enzymatic activity of unknown samples (patients) is compared with the standard curve by determining the concentration of these samples by correlation the same with the standard curve. REAGENTS 1- Reference Standards (A - F) - Store between 2 and 8ºC. Six (6) flasks (A - F) of reference patterns containing thyroxine in different concentrations in tampon solutions ph 7,4 and Sodium Azide. Note: Accurate levels of specific plots are given on the labels. Consult bottles kit standard in use and consider the values of the same. 2- Conjugate - Store between 2 and 8ºC. Thyroxine conjugated with peroxidase (HRP). 3- Sensitized Plate - Store between 2 and 8ºC. 4- Concentrated Washing Solution - Store between 2 and 8ºC. Phosphate saline solution ph 7,4 and sodium azide. 5- Substrate A - Store between 2 and 8ºC. Tetramethylbenzidine (TMB). 6- Substrate B - Store between 2 and 8ºC. Solution of hydrogen peroxide (H 2 O 2 ). 7- Stop Solution - Store between 2 and 8ºC. Chloridric Acid (HCl) 1N. PRESENTATION PRESENTATION 1 2 REAGENTS 96 CAVITIES 192 CAVITIES 1- Reference Standards 6 Flasks A-F x 1,0mL 6 Flasks A-F x 1,0mL 2- Conjugate 1 Flask x 13mL 2 Flasks x 13mL 3- Sensitized Plate 1 Unity (96 cavities) 2 Units (96 cavities) 4- Concentrated Washing Solution 1 Flask x 20mL 1 Flask x 20mL 5-Substrate A 1 Flask x 7mL 2 Flasks x 7mL 6-Substrate B 1 Flask x 7mL 2 Flasks x 7mL 7-Stop Solution 1 Flask x 8mL 2 Flasks x 8mL EQUIPMENTS AND OPERATIONAL INPUTS Materials contained in this kit: - Reagents described in the above board. - Instructions of usage (manual) Materials necessary, but not present in this kit: 1- Pipette(s) capable of dispensing a volumes of 25 and 50 ml with a precision greater than 1,5%. 2- Re-pipettor(s) for repetitive dispensing volumes of 100 ml and 300 ml, with precision greater than 1,5% (optional) or multichannel pipette. 3- Micro plate washer (optional) or pipettes for for micro cavity washing. 4- ELISA reader capable of absorbance at 450/630 nm wavelength. 5- Adjustable volume pipettes (200 ml to 1000 ml) for substrate dilution. 6- Test tubes for dilution of substrates A and B. 7- Paper towel to dry micro cavities. 8- Plastic wrap or micro plate lid for incubation steps. 9- Timer or clock. 10- Container to store the washing solution. 11- Distilled or deionized water. 12- Quality Control tools. TRANSPORTATION AND STORAGE CONDITIONS The storage temperature should be between 2 to 8 C. The transport at temperatures between 15 and 30 C should not exceed 72 (seventy two) hours. Do not freeze. Protect from light and avoid moisture. SPECIAL CARE 1- For in vitro diagnostic only. 2- Strictly follow the methodology proposed to obtain exact results. 3- Place the strips from unused micro cavities in the aluminum wrapper, seal and store in temperatures between 2-8 o C. 4- Water used in material cleaning must to be recent and free of contaminants. 5- Saturated deionizer columns release alkaline water, many ions, oxidizing agents and reducers that may alter the results significantly. 6- For safety matter, plates can be covered during the reaction. If you opt for this procedure it is necessary for it to be established as routine. 7- All raw material generated by the product is tested and should be nonreactive for HBs Antigen, Anti-HIV 1 & 2 and Anti-HCV. However, these tests do not provide total assurance as to the absence of infectious agents. Manual manipulation of any product containing serum is potentially capable of transmitting disease. Therefore, we must take proper bio safety care while handling these products. 8- Always add reagents in the same order to minimize the difference in reaction time between cavities. 9- We recommend applying the local, state and federal rules for environmental protection, so that disposal of reagents and biological material can be made in accordance with current legislation. 10- To obtain information related to biosafety or in case of accidents with the product, consult the MSDS (Material Safety Data Sheet) available on the website or upon request by the SAC (Advisory Service Customer) of Quibasa. SAMPLES The type and the usual precautions for venipuncture should be observed in the sample collection. For accurate comparison with normal values, collect the sample first thing in the morning. Spoon into tube without additives. Separate the red blood cells by centrifugation and the serum obtained to use the free T4 assay. Hemolyzed Sample(s) or highly lipemic should not be used. Samples may be refrigerated at between 2 and 8 C for a maximum of five (5) days. If samples can not be assayed within five days, can be stored for up to 30 days at -20ºC (freezer). If the test is done in duplicate, the required volume of sample is 0,100 ml. PROCESS DESCRIPTION PREPARATION OF WORKING REAGENTS Washing Solution Dilute the content of flask N o 4 (Concentrated Washing Solution) in 1000 ml of distilled or deionized water. Store at room temperature up to the expiration date printed in the original flask. Substrate - Working Solution Determine the amount of cavities to be used for preparation of an appropriate volume. Prepare the solution by mixing equal parts of Substrate A and Substrate B, 15 minutes before use. Keep it protected from light until used. To each cavity (test), use: 50 L of substrate A + 50 L of substrate B For example: mix 1 ml of Substrate A and 1 ml of Substrate B to two strips with 8 cavities (16 tests). Leftover reagent occurs. Use no later than one (1) hour after preparation. TECHNIQUE Before starting the assay, bring all reagents, samples, reference standards and controls to stabilize at room temperature (15-30 C) 1- Select the micro cavities to be used considering: Standards, controls and samples (which may be tested in duplicate). 2- Pipette 0,050 ml (50 ml) of standards, controls and samples in their micro cavities. 3- Pipette 0,100 ml (100 ml) of conjugated reagent in all microcavities. 4- Homogenize gently for 20 to 30 seconds and cover the plate. 5- Incubate for 60 minutes at room temperature. 6- Discard the contents of the micro cavities by aspiration (Washer), or settlement; 7- Pipette approximately 300 ml of the previously prepared* washing solution in all micro cavities. *See PREPARATION OF WORKING REAGENTS. Decant or aspirate for a total of five (5) washing cycles. In order to guarantee the proper drying of the plate, use absorbent paper. 8- Pipette 0,100 ml (100 ml) of the previously prepared* substrate to all micro cavities. *See PREPARATION OF WORKING REAGENTS. 9- Incubate for fifteen (15) minutes at room temperature away from light. 10- Pipette 0,050 ml (50 ml) of stop solution to all micro cavities. Homogenize it gently for 15 to 20 seconds. Always pipette the reagents in the same order to minimize reaction time differences between micro cavities. 11- Read the absorbance of each micro cavity at 450 nm in a plate reader. Results can be read within thirty (30) minutes after adding the stop solution. CALCULATIONS A calibration curve is used to determine the free thyroxine concentration in unknown samples (patients). Preparation of calibration curve Record the absorbance obtained in the microplate reader as outlined in Example 1. Plot the absorbance for each serum reference (standard) versus the corresponding concentration of Free T4 in mg/dl on linear graph paper (do not calculate the average of the duplicates before plotting them in graph.) Plot the curve. Example 1 Figure 1 Standard Micro cavity Abs. (60min) A (0,0 mg/dl) B (0,4 mg/dl) C (1,1 mg/dl) D (2,1 mg/dl) E (4,2 mg/dl) F (7,4 mg/dl) 1 2, , , , , , , , , , , ,421 T4 Free Concetracion (ng/dl) All the data presented in example 1 and figure 1 are only illustrative and can t be used substituting the standard-curve, that must be built in each assay. PROCEDURE LIMITATIONS Assay Performance The reference serum (standards) and controls may become cloudy with time. This does not affect performance test. Use until completion or until the expiration date. It is very important that the reaction time of each well is held constant for reproducibility of results. Pipetting of samples should not extend beyond ten (10) minutes to avoid assay drift. If you use more than one (1) plate is recommended to repeat the curve. The addition of the substrate solution initiates a kinetic reaction, which is terminated by the addition of stop solution. Therefore, the addition of the substrate and stop solution must be in the same sequence to eliminate deviations time during the reaction. Plate readers read vertically. Do not touch the bottom of the micro cavities. Flaws in the washing process can result in poor or incorrect results. Interpretation If you use a program to interpret the results, it is imperative to to establish a margin of error of 10% for the results of the calibrators and samples. Thyroxine, the main thyroid hormone, circulates in the bloodstream transported by proteins. The TBG is the carrier vehicle. Only the Portion of free thyroxine (not carried by TBG) is responsible for the biological action

6 INTERNAL QUALITY CONTROL The Clinical Laboratory must have an internal quality control, where all procedures, rules, limits and tolerance to variations be clearly established. It is important to mention that all measurement systems present a analytical variety, and it must be monitor by the laboratory. Therefore, it is recommendable the use of controls, allowing the precision and accuracy of the dosages. PARAMETERS FOR QUALITY CONTROL Absorbance calibrator (0 ng/dl) 1,5 REFERENCE VALUES Normal values for Biolisa Free T4 Kit in ng/dl Adults Pregnant Normal Variation 0,8 to 2 ng/dl 0,8 to 2,2 ng/dl PRODUCT PERFORMANCE QUALITY CONTROL Accuracy COMPARISON OF METHODS AND METHODOLOGICAL SPECIFICITY Biolisa T4 Free was compared with another ELISA method commercially available. 07 samples of populations with a hypothyroid, euthyroid and hyperthyroidism (0,36 to 6,4 ng/dl). The linear regression equation obtained was Y = 0,8993X + 0,1528 and a correlation coefficient of 0,9995. With these results we can conclude the kit has good methodological specificity. Precision REPEATABILITY 20 consecutive measurements were performed with 3 samples, obtaining the following results: SAMPLE 1 SAMPLE 2 SAMPLE 3 Concentration (ng/dl) 1,74 5,53 0,40 Standard Deviation (ng/dl) 0,08 0,26 0,02 Coefficient of variation (%) 4,74 4,73 4,88 REPRODUCIBILITY 20 successive dosages were performed for 3 consecutive days with three samples, obtaining the following results: SAMPLE 1 SAMPLE 2 SAMPLE 3 Concentration (ng/dl) 1,84 5,82 0,40 Standard Deviation (ng/dl) 0,09 0,26 0,01 Coefficient of variation (%) 4,83 4,39 2,50 DIAGNOSTIC SIGNIFICANCE The concentrations of proteins transported (TBG) are altered in many clinical situations, for example, during pregnancy. In a normal thyroid function, if the transport proteins (TBG) change, total T4 levels also change, but the free portion remains constant. Thus, measurements of the concentration of Free T4 is the best parameter for Total T4 the determination of clinical status. For example, the increase in total T4 levels are associated with states of pregnancy, use of oral contraceptives and estrogen therapy, resulting in total T4 levels above the limit of normality, while the concentration of Free T4 remains within the normal range. Changes in TBG levels can lead to misdiagnosis of Hyper and Hypothyroidism, if considered only the concentration of total T4. Underscoring the Free T4 usually reveals clinical data of patient s radioimmunoassay. NUMBER OF TESTS 96/192 tests BIBLIOGRAPHIC REFERENCES 1) Barker, S.B., Determination of Protein Bound Iodine. Journal Biological Chemestry, 173, 175 (1948) 2) Chopra, I.J., Solomon, D.H., and Ho, R.S., A Radioimunoassay of Thyroxine. Journal Clinical Endocrinol., 33,865 (1971) 3) Young, D.S., Pestaner, L.C., and Gilberman, U. Effects of Drugs on Clinical Laboratory Tests. Clinical Chemestry, 21, 3660 (1975) 4) Sterling, L., Diagnosis and treatment of Thyroid Disease, Cleveland CRC Press, P (1975). QUALITY ASSURANCE Before being released for consumption, all Bioclin reagents are tested by the Department of Quality Control. The quality of reagents is assured until expiration date stated on the presentation packaging, when stored and transported under appropriate conditions. MANUFACTURER S DATA QUIBASA QUÍMICA BÁSICA Ltda Rua Teles de Menezes, 92 - Santa Branca CEP Belo Horizonte - MG - Brasil Phone.: +55 (31) Fax: +55 (31) bioclin@bioclin.com.br CNPJ: / Indústria Brasileira CUSTOMER SERVICE Customer Advisory Service Phone.: sac@bioclin.com.br ANVISA registration for Biolisa Free T4 kit: Review: May/12 Sensitivity The sensitivity of Biolisa Free T4 kit is of 0,05 ng/dl. Sensitivity was established by the determinant of variability from the standard of 0 ng/dl. Linearity The reaction is linear and capable of detecting concentrations up to the concentration of the highest point in the calibration curve. For samples with higher values, dilute it with using Sodium Chloride 0,85%, repeat the dosage and multiply the results obtained by the dilution factor. Specificity The cross-reactivity with certain anti-thyroxine substances was evaluated by adding the interfering in a pattern, in various concentrations. Cross reactions were calculated by the ratio between the dose of interfering substances to the dose of thyroxine needed to displace the same amount of tracer. SUBSTANCE CROSS-REACTION CONCENTRATION L-Thyroxine 1, D-Thyroxine 0, mg/ml D-Triiodothyronine 0, mg/ml L-Triiodothyronine 0, mg/ml Iodotyrosine 0, mg/ml Diiodotyrosine 0, mg/ml Diiodothyronine 0, mg/ml