BIOLISA FERRITINA K109 INSTRUÇÕES DE USO

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1 Português 1/2 BIOLISA FERRITINA K109 INSTRUÇÕES DE USO FINALIDADE Teste para determinação quantitativa de Ferritina, em soro humano, por Enzimaimunoensaio em Microplaca. PRINCÍPIO DE AÇÃO Metodologia: Enzimaimunoensaio ou imunoenzimétrico Neste método, os calibradores de ferrritina, amostras de pacientes ou controles são primeiro adicionados às cavidades revestidas por estreptavidina. Um anticorpo monoclonal biotinilado (específico para ferrritina) é adicionado e os reagentes misturados. O resultado da reação entre o anticorpo biotinilado de ferritina e a ferritina nativa é um imunocomplexo que se deposita na cavidade revestida por estreptavidina. O excesso de proteínas séricas são lavadas através da etapa de lavagem. Outro anticorpo específico para a ferritina, marcado com uma enzima é adicionado às cavidades. O anticorpo marcado se liga à ferritina já imobilizada na cavidade. O excesso de enzima é lavado por uma etapa de lavagem. É gerada uma cor pela adição de um substrato. A intesidade da cor gerada é diretamente proporcional à concentração de ferritina na amostra. A utilização de vários soros de referência com níveis conhecidos de ferritina permite a contrução de uma curva da resposta de atividade/concentração. A partir da comparação da curva de resposta, a concentração de ferritina em uma amostra pode ser correlacionada. Após misturar o anticorpo monocional biotinilado e um soro contendo o antígeno nativo, ocorre uma reação entre o antígeno nativo e o anticorpo, formando um complexo antígeno-anticorpo. A interação é ilustrada pela seguinte equação: (Ferritina) + Btn Ab (m) Btn Ab (m) = Anticorpo monoclonal biotinilado (em excesso) (Ferritina) = Antígeno nativo (quantidade variada) = Complexo antígeno-anticorpo (quantidade variada) = Constante de associação = Constante de dissociação REAGENTES 1- Padrões Referência (A - F) - Conservar entre 2 e 8ºC. Seis (6) frascos (A - F) de Padrões Referência de Ferritina em diferentes concentrações, em solução de tampão ph 7,4 e azida sódica. A= 0,0 ng/ml B= 10 ng/ml C= 50 ng/ml D= 150 ng/ml E= 400 ng/ml F= 800 ng/ml 2- Conjugado Biotinilado - Conservar entre 2 e 8ºC. IgG monoclonal (camundongo) biotinilado em tampão, corante e conservante. 3- Conjugado IgG - Conservar entre 2 e 8ºC. IgG anti-ferritina marcada com peroxidase em tampão, corante e conservante. 4- Placa Sensibilizada - Conservar entre 2 e 8ºC. 5- Lavagem Concentrada (50x) - Conservar entre 2 e 30ºC. Solução de fosfato salina ph 7,4 e azida sódica. 6- Substrato A - Conservar entre 2 e 8ºC. Tetrametilbenzidina (TMB). 7- Substrato B - Conservar entre 2 e 8ºC. Solução de Peróxido de hidrogênio (H 2 O 2 ). 8- Solução de Parada - Conservar entre 2 e 30ºC. Ácido Clorídrico (HCl) 1N. APRESENTAÇÃO REAGENTES 96 TESTES 1- Padrões Referência 6 Frascos (A-F) X 1,0 ml 2- Conjugado Biotinilado 1 Frasco X 13 ml 3- Conjugado IgG 1 Frasco X 13 ml 4- Placa sensibilizada 1 Placa X 96 testes 5- Lavagem Concentrada 1 Frasco X 20 ml 6- Substrato A 1 Frasco X 7 ml 7- Substrato B 1 Frasco X 7 ml 8- Solução de Parada 1 Frasco X 8 ml EQUIPAMENTOS E INSUMOS OPERACIONAIS Materiais contidos no kit: - Reagentes descritos no quadro anterior - Instruções de uso (manual). Materiais necessários, mas não contidos no kit: 1- Pipetas com capacidade de dispensar volumes de 25 ml, 50 ml, com precisão maior que 1,5%. 2- Repipetadores para pipetagens repetitivas de volumes de 100 ml e 300 ml, com precisão maior que 1,5% (opcional) ou pipeta multicanal. 3- Lavadora de microplaca (opcional) ou pipetas para lavagem das microcavidades. 4- Leitora de ELISA com capacidade de absorbância em 450/630 nm de comprimento de onda. 5- Pipetas com volumes reguláveis (200 ml a 1000 ml) para diluição do Substrato. 6- Tubos de ensaio para a diluição dos substratos A e B. 7- Papel absorvente para secar as microcavidades. 8- Cronômetro ou relógio. 9- Frasco para estocar a solução de lavagem após diluida 10- Água destilada ou deionizada. 11- Ferramentas de Controle de Qualidade. CONDIÇÕES DE ARMAZENAMENTO E TRANSPORTE A temperatura de armazenamento deverá ser de 2 a 8 C. O transporte em temperaturas entre 15 e 30 C não deverá exceder a 72 (setenta e duas) horas. Não congelar. Manter ao abrigo da luz e evitar umidade. CUIDADOS ESPECIAIS 1- Somente para uso diagnóstico in vitro. 2- Seguir com rigor a metodologia proposta para a obtenção de resultados exatos. 3- Recolocar as tiras de microcavidades não utilizadas no invólucro de alumínio, vedar e conservar a 2-8ºC. 4- A água utilizada na limpeza do material deve ser recente e isenta de contaminantes. 5- Colunas deionizadoras saturadas liberam água alcalina, íons diversos e agentes oxidantes e redutores, que podem alterar de forma significativa os resultados. 6- A solução de parada contém ácido clorídrico, que é um ácido forte. Portanto, manuseá-lo com devido cuidado. 7- Toda matéria-prima do produto é testada e deve ser não reagente para HBs, Anti-HIV 1&2 e Anti HCV. Entretanto, esses testes não oferecem total segurança da ausência de agentes infecciosos. A manipulação manual de todo produto que contém soro é potencialmente capaz de transmitir doenças. Portanto, é preciso tomar os devidos cuidados de biossegurança na manipulação desses produtos. 8- Pipetar os reagentes sempre na mesma ordem para minimizar a diferença de tempo de reação entre as microcavidades. 9- Por medida de proteção, pode-se cobrir a placa durante a reação. Caso opte por este procedimento, é necessário que seja estabelecido como rotina. 10- Assegurar que o fundo da cavidade esteja limpo e seco e que não haja bolhas na superfície do líquido antes de ler a placa. Não permitir que as cavidades sequem durante o ensaio. 11- Não exponha os reagentes, especialmente o substrato, à luz forte ou vapores de hipoclorito durante armazenamento ou etapas de incubação. 12- Recomendamos aplicar as normas locais, estaduais e federais de proteção ambiental para que o descarte dos reagentes e do material biológico seja feito de acordo com a legislação vigente. 13- Para obtenção de informações relacionadas à biossegurança ou em caso de acidentes com o produto, consultar as FISPQ (Ficha de Informações de Segurança de Produtos Químicos) disponibilizadas no site ou através de solicitação pelo SAC (Serviço de Assessoria ao Cliente) da Quibasa. AMOSTRAS Utilizar soro coletado em tubo sem aditivo. Amostras hemolisadas ou altamente lipêmicas não devem ser usados. As amostras podem ser conservadas sob refrigeração entre 2 e 8 C, pelo período máximo de 5 dias. Se as amostras não puderem ser analisadas dentro de 5 dias, podem ser estocadas por até 30 dias à temperatura de -20 C (freezer). Para amostras que serão testadas em duplicata, o volume requerido é de no minimo 0,050 ml de soro. DESCRIÇÃO DO PROCESSO PREPARO DOS REAGENTES DE TRABALHO Solução de Lavagem Diluir o conteúdo do frasco Nº 5 (Lavagem Concentrada) em 1000 ml de água destilada ou deionizada. Estocar em temperatura ambiente até a validade impressa no frasco original. Substrato - Solução de Trabalho Determinar a quantidade necessária de cavidades a serem utilizadas para preparo de uma quantidade adequada. Preparar a solução misturando partes iguais de Substrato A e Substrato B, 15 minutos antes de sua utilização. Mantenha-o protegido da luz até ser utilizado. Para cada microcavidade (teste): 50 ml de Substrato A + 50 ml de Substrato B Por exemplo: misture 1 ml de Substrato A e 1 ml de Substrato B para duas tiras de 8 microcavidades (16 testes). Ocorre sobra de reagente Usar no máximo até uma (1) hora após preparo. TÉCNICA Antes de iniciar o ensaio, colocar todos os reagentes, Amostras, Padrões Referência e Controles para estabilizarem em temperatura ambiente (15-30ºC) por no mínimo 40 minutos. Retornar as tiras da microplaca que não serão utilizadas para a embalagem original selada. 1- Separar as microcavidades a serem utilizadas considerando: Padrões, Controles e Amostras (Podendo ser testados em duplicata). 2- Separar a primeira cavidade para o Branco (OPCIONAL). 3- Pipetar 25 ml dos Padrões, Controles e Amostras em suas respectivas microcavidades. 4- Pipetar 100 ml do Conjugado Biotinilado a cada Microcavidade. 5- Homogeneizar gentilmente durante ± 30 segundos. 6- Incubar por 30 minutos à temperatura ambiente. 7- Descartar o conteúdo das cavidades por aspiração (Lavadora) ou por decantação (manual). Usar 300 ml aproximadamente de Solução de Lavagem previamente preparada*, para efetuar um total de cinco (5) ciclos de lavagem. Para a garantia da secagem da placa, ao final da lavagem, bater a placa por alguns segundos em papel absorvente; Nota: Lavagem/secagem deficiente pode causar resultados inadequados. 8- Pipetar 100 ml de IgG Anti-Ferritina a cada microcavidade; 9- Homogeneizar gentilmente durante ± 30 segundos; 10- Incubar por 30 minutos à Temperatura Ambiente; 11- Repetir o item ATENÇÃO. Siga um dos seguintes procedimentos: A) Pipetar 100 ml de Substrato previamente preparado* Solução de Trabalho ( A + B ) em cada cavidade * Vide PREPARO DOS REAGENTES DE TRABALHO Ou, B) Pipetar 50 ml de Substrato A em cada cavidade. Pipetar 50 ml de Substrato B em cada cavidade. 13- Homogenizar gentilmente durante ± 30 segundos. 14- Incubar por 15 minutos à temperatura ambiente ao abrigo da luz. 15- Pipetar 50 ml de Solução de Parada em cada microcavidade. 16- Homogeneizar gentilmente durante ± 30 segundos. 17- Ler: 450 nm (filtro primário) / 630 nm (filtro secundário) em até 30 minutos (no máximo). RESULTADOS Uma curva de calibração é utilizada para determinar a concentração de ferritina em amostras. 1- Registrar a absorbância obtida a partir da impressão da leitora de microplaca como especificado no exemplo Construir uma curva de calibração utilizando a absorbância média para cada soro ensaiado em duplicata versus a correspondente concentração de ferritina em ng/ml em papel milimetrado. 3- Desenhar a melhor curva média entre os pontos. (Ver Figura 1). 4- Interpolar as concentrações do controle desconhecido ou a amostra de paciente na curva. (Ver Figura 1). Absorbância Exemplo 1 Figura 1 Valores de Ferritina (ng/ml) I.D Microcav. Absorb. Absorb media Conc. Cal A Cal B Cal C Cal D Cal E Cal F CTRL 1 Paciente 1 Paciente 2 A1 0,002 B1 0,003 C1 0,110 D1 0,113 E1 0,586 F1 0,647 G1 1,204 H1 1,320 A2 1,947 B2 1,887 C2 2,586 D2 2,536 E2 0,707 F2 0,734 G2 1,289 H2 1,285 A3 1,647 B3 1,671 0, , , , , , , , , *Os dados apresentados no exemplo 1 e Figura 1 são apenas ilustrativos e não devem ser utilizados no lugar de padrões em uma curva padrão construída a cada ensaio.

2 PARÂMETROS DE CONTROLES DE QUALIDADE Para que os resultados do teste sejam considerados válidos, devem ser obedecidos os seguintes critérios. 1- A Absorbância (D.O.) do calibrador A deve ser < 0, 1 2- A Absorbância (D.O.) do calibrador F deve ser > 1,2 LIMITAÇÕES DO PROCEDIMENTO 1- É importante que o tempo de reação em cada microcavidade seja constante para resultados reprodutíveis. O tempo para pipetar as amostras não deve ser superior a 10 minutos para evitar inadequação do teste. Se mais de uma placa for utilizada, recomenda-se repetir a curva de calibração. 2- A adição de solução de substrato inicia uma reação cinética, que termina pela adição da solução de parada. No entanto, a adição de substrato e a solução de parada deve ser realizada na mesma seqüência para eliminar qualquer desvio de tempo durante a reação. 3- As leitoras de microplaca doseam verticalmente. Não tocar o fundo da microcavidade 4- A falha em remover solução aderente adequadamente nas etapas de lavagem, aspiração e decantação podem causar uma duplicação deficiente dos resultados e resultados errôneos. 5- Amostras microbiologicamente contaminadas não devem ser utilizadas no teste. Também, amostras altamente lipêmicas ou hemolisadas não devem ser utilizadas. 6- Amostras com concentração de ferritina acima de 800 ng/ml devem ser diluídas com solução salina e testar novamente. A concentração da amostra é obtida multiplicando o resultado pelo fator de diluição. 7- Utilizar componentes do mesmo lote. Não intercambiar reagentes de lotes diferentes. CONTROLE INTERNO DE QUALIDADE O Laboratório Clínico deve possuir um programa interno de controle da qualidade, onde procedimentos, normas, limites e tolerância para variações sejam claramente estabelecidos. É importante ressaltar que todos os sistemas de medição apresentam uma variabilidade analítica característica, que deve ser monitorada pelos próprios laboratórios. Para tanto, é recomendável a utilização de controles, que permitem avaliar a precisão e a exatidão das dosagens. RASTREABILIDADE Os padrões do kit são rastreáveis ao material de referência NIBSC 94/572 (Ferritin Human Recombinant - WHO International Standard). VALOR DE REFERÊNCIA As faixas de referência aproximadas para homens e mulheres adultos normais foram estabelecidas usando-se 400 amostras de soros normais e testando-se com o kit BIOLISA Ferritina. Adultos: Homens ng/ml Mulheres ng/ml Recém-Nascidos: ng/ml 1 Mês - 2 Meses: ng/ml 3 Meses - 5 Meses: ng/ml 6 Meses - 16 Anos: ng/ml Estas faixas devem ser usadas apenas como diretrizes. Recomenda-se que cada laboratório estabeleça suas próprias faixas para populações normais e anormais. Estas faixas sempre são dependentes do local, população, laboratório, técnica e especificidade do método. DESEMPENHO DO PRODUTO CONTROLE DE QUALIDADE Precisão A precisão inter e intra-ensaio do BIOLISA Ferritina foi determinada pela análise em três níveis diferentes em pools de soro de pacientes. O número, valores médios, desvio padrão e coeficiente de variação para cada um destes controles são apresentados na Tabela 2 e Tabela 3. Tabela 2 Precisão Intra-Ensaio Amostra 1 Amostra 2 Amostra 3 Concentração (ng/ml) 185, , ,0333 Desvio Padrão (ng/ml) 0,1258 0,1528 0,1756 Coeficiente de Variação (%) 0,0677 0,0493 0,0471 Tabela 3 Precisão Inter-Ensaio Lote 1 Lote 2 Lote 3 Concentração (ng/ ml) 113, , ,0000 Desvio Padrão (ng/ml) 1,2763 1,4318 1,3377 Coeficiente de Variação (%) 1,1290 1,2676 1,1838 Sensibilidade A sensibilidade do kit BIOLISA Ferritina é 1,0 ng/ml. SIGNIFICADO DIAGNÓSTICO A ferritina é a mais importante proteína de reserva do ferro e é encontrada em todas as células, especialmente naquelas envolvidas na síntese de compostos férricos, no metabolismo e reserva do mesmo. A dosagem de ferritina é o mais fiel indicador da quantidade de ferro armazenada no organismo. Sua grande utilidade clínica está no diagnóstico diferencial entre as anemias hipocrômicas e microcíticas por deficiência de ferro, de anemias por outras etiologias. Nesses casos, a ferritina diminui antes das alterações dos níveis de ferro sérico e das alterações morfológicas da série vermelha. Entretanto, por fazer parte do grupo de proteínas de fase aguda, a ferritina se eleva em resposta a infecções, traumatismos e inflamações agudas. A elevação ocorre nas 24 a 48 horas iniciais, com um pico no terceiro dia, e se mantém por algumas semanas, o que pode dificultar sua interpretação. Seus níveis podem elevar-se no excesso de ferro, em pacientes transfundidos e em neoplasias, especialmente nas leucemias e linfomas e nos carcinomas de mama, fígado, pulmão, cólon e próstata. Elevam-se, também, nas anemias hemolíticas e megaloblásticas e nas lesões hepáticas, especialmente alcoólicas. Cerca de 25% dos pacientes com hepatite crônica têm aumento da ferritina. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 1- Beamish, MR et al; Transferrin iron, chelatable iron and ferritin in idiopathic hemochromatosis.. Br. Jour. Haematology 27: Grace ND, Powel LW: Iron storage disorders of the liver. Gastroenterology; 67: Anonymous. Adult screening for anemie and hemoglobinopathies. Nurse Pract, 20: Corti MC., Gaziano M., Hennekens CH.: Iron status and risk of cardiovascular disease. Ann. Epidemiol.,7:62-68, Edwards CQ., Kushmar Jp,: Screening for hemochromatosis, NEJM., 32: , Jandal JH.: Textbook of hematology. 2 ED.Philadelphia.lippinscott- Raven Pub, Jonxix JHP., Visser HKA.: Determination of low percentage of fetal hemoglobin in the blood of normal children. Am.J.Dis.Child.92:588-98, Jouanolle AM., David V., LeGail JY.: Genetic Hemochromatosis. Ann. Biol.Clin. (Paris). 55: , Lee GR, Ed.: Wintrobe s Clinical Hematology. Baltimore. Williams & Wilkins, Little DR.: Hemochromatosis; Diagnosis and Management. Am.Fam. Physician.53: , Morikawa K, Oseko F., Morikawa S.: A role for ferritin in Lymphoma and the immune system. Leukemia Lymphoma, 18: , Naimark BJ., Reddy AE., Sawasky JA.: Serum Ferritin and Heart Disease; The effect of moderate exercise on iron storage in postmenopausal women. Can.J.Cardiol., 12: , Steiene-Martin EA., Lotspeich-Steininger CA., Koepke JÁ.: Clinical Hematology:Principles, Procedures, Correlations. 2 Ed. Lippinscott-Raven. Philadelphia, Tietz N.: Textbook of clinical Chemistry. Carl A Burtis. 3 Ed. WB Saunders. Philadelphia GARANTIA DA QUALIDADE Antes de serem liberados para consumo, todos os reagentes Bioclin são testados pelo Departamento de Controle de Qualidade. A qualidade dos reagentes é assegurada até a data de validade mencionada na embalagem de apresentação, desde que armazenados e transportados nas condições adequadas. DADOS DO FABRICANTE QUIBASA QUÍMICA BÁSICA Ltda Rua Teles de Menezes, 92 - Santa Branca CEP Belo Horizonte - MG - Brasil Tel.: (31) Fax: (31) CNPJ: / Indústria Brasileira ATENDIMENTO AO CONSUMIDOR Serviço de Assessoria ao Cliente Tel.: Número de registro do kit BIOLISA Ferritina na ANVISA: Revisão: Julho/12 Português 2/2

3 Español 1/2 BIOLISA FERRITINA K109 INSTRUCCIONES DE USO FINALIDAD Test para determinación cuantitativa de Ferritina, en suero humano, por Enzimaimunoensayo en Microplaca. PRINCIPIO DE ACCIÓN Metodología: Enzimainmunoensayo o inmunoenzimétrico En este método, los calibrados de ferrritina, muestras de pacientes o controles son primero adicionados a las cavidades revestidas por estreptavidina. Un anticuerpo monoclonal biotinilado (específico para ferrritina) es adicionado y los reactivos mezclados. El resultado de la reacción entre el anticuerpo biotinilado de ferritina y la ferritina nativa es un inmunocomplejo que se deposita en la cavidad revestida por estreptavidina. Los excesos de proteínas séricas son lavadas a través de la etapa de lavado. Otro anticuerpo específico para la ferritina, marcado con una enzima es adicionado a las cavidades.el anticuerpo marcado se liga a la ferritina ya inmobilizada en la cavidad. El exceso de enzima es lavado por uma etapa de lavado. Es generado un color por la adición de un sustrato. La intensidad del color generado es directamente proporcional a la concentración de ferritina en la muestra. La utilización de varios sueros de referencia con niveles conocidos de ferritina permite la construcción de una curva de la respuesta de actividad/ concentración. A partir de la comparación de la curva de resposta, la actividad de ferritina en una muestra puede ser correlacionada con la concentración de ferritina. Después de mezclar el anticuerpo monoclonal biotinilado y un suero conteniendo el antígeno nativo, ocurre una reacción entre el antígeno nativo y el anticuerpo, formando un complejo antígeno-anticuerpo. La interacción es ilustrada por la siguiente ecuación: (Ferritina) + Btn Ab (m) Btn Ab (m) = Anticuerpo monoclonal biotinilado (en exceso) (Ferritina) = Antígeno nativo (cantidad variada) = Complejo antígeno-anticuerpo (cantidad variada) = Constante de asociación = Constante de disociación REACTIVOS 1- Patrones Referencia (A - F) - Almacenar entre 2 y 8ºC. Seis (6) frascos (A - F) de Patrones Referencia de Ferritina en diferentes concentraciones, en solución de tapón ph 7,4 y azida sodica. A= 0,0 ng/ml B= 10 ng/ml C= 50 ng/ml D= 150 ng/ml E= 400 ng/ml F= 800 ng/ml 2- Conjugado Biotinilado - Almacenar entre 2 y 8 C. IgG monoclonal (ratón) biotinilado en tapón, colorante y conservante. 3- Conjugado IgG - Almacenar entre 2 y 8 C. IgG anti-ferritina marcada con peroxidasa en tapón, colorante y conservante. 4- Placa sensibilizada - Almacenar entre 2 y 8ºC. 5- Solución de Lavado Concentrado (50x) - Almacenar entre 2 y 30ºC. Solución de fosfato salina ph 7,4 y azida sodica. 6- Sustrato A - Almacenar entre 2 y 8ºC. Tetrametilbenzidina (TMB). 7- Sustrato B - Almacenar entre 2 y 8ºC. Solución de Peróxido de hidrógeno (H 2 O 2 ). 8- Solución de parada - Almacenar entre 2 y 30ºC. Ácido Clorídrico (HCl) 1N. PRESENTACIÓN REACTIVOS 96 PRUEBAS 1- Patrones Referencia 6 Frascos (A-F) X 1,0 ml 2-Conjugado Biotinilado 1 Frasco X 13 ml 3- Conjugado IgG 1 Frasco X 13 ml 4- Placa sensibilizada 1 Placa X 96 tests 5- Solución de Lavado Concentrado 1 Frasco X 20 ml 6- Sustrato A 1 Frasco X 7 ml 7- Sustrato B 1 Frasco X 7 ml 8- Solución de Parada 1 Frasco X 8 ml EQUIPOS E INSUMOS OPERACIONALES Materiales contenidos en los kit: - Reactivos descritos en el cuadro anterior - Instrucciones de uso ( manual ). Materiales necesarios, más no contenidos en el kit: 1- Pipetas con capacidad de dispensar volúmenes de 25 ml, 50 ml con precisión mayor que 1,5%. 2- Repipetadores para pipetajes repetitivas de volúmenes de 100 ml y 300 ml, con precisión mayor que 1,5% (opcional) o pipeta multicanal. 3- Lavadora de microplaca (opcional). ou pipetas para lavado de las microcavidades. 4- Lectora de ELISA con capacidad de absorbancia en 450/630 nm de longitud de onda. 5- Pipetas con volúmenes regulables (200 ml a 1000 ml) para dilución de Sustrato. 6- Tubos de ensayo para la dilución del Sustrato A y B. 7- Papel absorbente para secar las microcavidades. 8- Cronómetro o reloj. 9- Frasco para almacenar la Solución de Lavado después de diluida; 10- ua destilada o deionizada. 11- Herramientas de Control de Calidad. CONDICIONES DE ALMACENAMIENTO Y TRANSPORTE La temperatura de almacenamiento deberá ser de 2 a 8 C. El transporte a temperaturas entre 15 y 30 C no deberá exceder a 72 (setenta y dos) horas. No congelar. Mantener al abrigo de la luz y evitar la humedad. CUIDADOS ESPECIALES 1- Solamente para uso diagnóstico in vitro. 2- Seguir con rigor la metodología propuesta para la obtención de resultados exactos. 3- Recolocar las tiras de microcavidades no utilizadas en la envoltura de aluminio, sellar y almacenar a 2-8 C. 4- El agua utilizada en la limpieza del material debe ser reciente e exenta de contaminantes. 5- Columnas deionizadoras saturadas liberan agua alcalina, iones diversos y agentes oxidantes y reductores, que pueden alterar de forma significativa los resultados. 6- La Solución de Parada contiene ácido clorídrico, que es un ácido fuerte. Por lo tanto, manosearlo con el debido cuidado. 7- Toda matéria prima del producto es probado y debe ser no reactivo para HBs, Anti-HIV 1&2 y Anti-HCV. Sin embargo, esos tests no ofrecen total seguridad de la ausencia de agentes infecciosos. La manipulación manual de todo producto que contiene suero es potencialmente capaz de transmitir dolencias. Por lo tanto, es necesario tomar los debidos cuidados de bioseguridad en la manipulación de esos productos. 8- Pipetear los reactivos siempre en el mismo orden para minimizar la diferencia de tiempo de reacción entre las microcavidades. 9- Por medida de protección, se puede cubrir la placa durante la reacción. Caso opte por este procedimiento, es necesario que sea establecido como rutina. 10- Asegurar que el fondo de la cavidad este limpio y seco y que no haya burbujas en la superfície del líquido antes de leer la placa. No permitir que las cavidades sequem durante el ensayo. 11- No exponga los reactivos, especialmente el sustrato, a la luz fuerte o vapores de hipoclorito durante el almacenamiento o etapas de incubación. 12- Se recomienda la aplicación de la ley local, estatal y federal de protección ambiental para la eliminación de reactivos y material biológico se hace de acuerdo con la legislación vigente. 13- Para obtener información relacionada con la seguridad biológica o en caso de accidentes con el producto, consultar la FISPQ (Ficha de Informaciones de la Seguridad de Productos Químicos) disponibles en el site o solicitando a través del SAC (Servicio de Asesoría al Cliente) de Quibasa. MUESTRAS Utilizar suero colectado en tubo sin aditivo. Muestras hemolizadas o altamente lipémicas no deben ser usadas. Las muestras pueden ser conservadas bajo refrigeración, entre 2 y 8ºC, por el período máximo de 5 días. Si las muestras no pudieran ser analizadas dentro de 5 días, pueden ser almacenadas por hasta 30 días a temperatura de -20ºC (freezer). Para muestras que serán analizadas en duplicado, el volúmen requerido es de 0,050 ml de suero. DESCRIPCIÓN DEL PROCESO PREPARO DE LOS REACTIVOS DE TRABAJO Solución de Lavado Diluir el contenido del frasco Nº 5 (Solución de Lavado Concentrado) en 1000 ml de agua destilada o deionizada. Almacenar a temperatura ambiente. Hasta la fecha de validad impresa en el frasco original. Sustrato - Solución de Trabajo Determinar la cantidad necesaria de cavidades a ser utilizadas para preparo de una cantidad adecuado. Preparar la solución mezclando partes iguales de Sustrato A y Sustrato B, 15 minutos antes de su utilización. Manténgalo protegido de la luz hasta ser utilizado. Para cada microcavidad (test): 50 ml de Sustrato A + 50 ml de Sustrato B Por ejemplo: mezcle 1 ml de Sustrato A y 1 ml de Sustrato B para dos tiras de 8 microcavidades (16 tests). Ocurre sobra de reactivo. Usar dentro de una (1) hora después del preparo. TÉCNICA Antes de comenzar el ensayo, colocar todos los reactivos, Muestras, Patrones Referencia y Controles para que se estabilicen en temperatura ambiente (15-30ºC ) por lo minimo 40 minutos. Retornar las tiras de la microplaca que no serán utilizadas para el embalaje original sellado. 1- Separar las microcavidades a ser utilizadas considerando: Patrones, Controles y Muestras (Pudiendo ser probados en duplicado). 2- Separar la primera cavidad para el Blanco (OPCIONAL); 3- Pipetear 25 ml de los Patrones, Controles y Muestras en sus respectivas microcavidades; 4- Pipetear 100 ml del Conjugado Biotinilado a cada Microcavidad; 5- Homogenizar gentilmente durante ± 30 segundos; 6- Incubar por 30 minutos a temperatura ambiente; 7- Desechar el contenido de las cavidades por aspiración (Lavadora) o por decantación (manual); Usar 300 ml aproximadamente de Solución de Lavado previamente preparada*, para efectuar un total de cinco (5) ciclos de lavado. Para la garantía del secado de la placa, al final del lavado, batir la placa por algunos segundos en papel absorbente; Nota: Lavado/secado deficiente puede causar resultados inadecuados. 8- Pipetear 100 ml de IgG Anti-Ferritina a cada microcavidad; 9- Homogenizar gentilmente durante ± 30 segundos; 10- Incubar por 30 minutos a Temperatura Ambiente; 11- Repetir el item ATENCIÓN. Siga uno de los siguientes procedimientos: A) Pipetear 100 ml de Substrato previamente preparado * Solución de Trabajo ( A + B ) en cada cavidad * Ved PREPARO DE LOS REACTIVOS DE TRABAJO O, B) Pipetear 50 ml de Sustrato A en cada cavidad. Pipetear 50 ml de Sustrato B en cada cavidad. 13- Homogenizar gentilmente durante ± 30 segundos. 14- Incubar por 15 minutos a temperatura ambiente al abrigo de la luz. 15- Pipetear 50 ml de Solución de Parada en cada microcavidad. 16- Homogenizar gentilmente durante ± 30 segundos. 17- Leer: 450 nm (filtro primario) / 630 nm (filtro secundario) hasta en 30 minutos (máximo). RESULTADOS Uma curva de calibración es utilizada para determinar la concentración de ferritina en muestras. 1- Registrar la absorbancia obtenida a partir de la impresión de la lectora de microplaca como lo especificado en el Exemplo Construir una curva de calibración utilizando la absorbencia promedio para cada suero ensayado en duplicado contra la correspondiente concentración de ferritina en ng/ml en papel milimetrado. 3- Diseñar la mejor curva promedio entre los puntos. (Ver Figura 1). 4- Interpolar las concentraciones de control desconocidas o la muestra de paciente en la curva. (Ver Figura 1) Absorbancia Ejemplo 1 Figura 1 Valores de Ferritina (ng/ml) I.D Microcav. Absorb. Absorb. promedio Conc. Cal A Cal B Cal C Cal D Cal E Cal F CTRL 1 Paciente 1 Paciente 2 A1 0,002 B1 0,003 C1 0,110 D1 0,113 E1 0,586 F1 0,647 G1 1,204 H1 1,320 A2 1,947 B2 1,887 C2 2,586 D2 2,536 E2 0,707 F2 0,734 G2 1,289 H2 1,285 A3 1,647 B3 1,671 0, , , , , , , , ,

4 *Los datos presentados en el ejemplo 1 y Figura 1 son apenas ilustrativos y no deben ser utilizados en el lugar de los patrones en una curva patrón construida en cada ensayo. PARÁMETROS DE CONTROLES DE CALIDAD Para que los resultados del test sean considerados válidos, deben ser obedecidos los siguientes criterios. 1- La Absorbancia (D.O.) del calibrador A debe ser < 0, 1 2- La Absorbancia (D.O.) del calibrador F debe ser > 1,2 LIMITACIONES DEL PROCEDIMENTO 1- Es importante que el tiempo de reacción en cada microcavidad sea constante para resultados reproducibles. El tiempo para pipetear las muestras no debe ser superior a 10 minutos para evitar que el test sea inadecuado. Si más de una placa fuera utilizada, se recomienda repetir la curva de calibración. 2- La adición de la solución de sustrato inicia una reaccción cinética, que termina por la adición de la solución de parada. Sin embargo, la adición de sustrato y la solución de parada debe ser adicionado en la misma secuencia para eliminar qualquier desvío de tiempo durante la reacción. 3- Las lectoras de microplaca dosifican verticalmente. No tocar el fondo de la microcavidad. 4- La falla en remover solución adherente adecuadamente en las etapas de lavado, aspiración y decantación pueden causar una duplicación deficiente de los resultados y resultados erróneos. 5- Muestras microbiológicamente contaminadas no deben ser utilizadas en el test. También, muestras altamente lipémicas o hemolisadas no deben ser utilizadas. 6- Muestras con concentración de ferritina sobre 800 ng/ml deben ser diluidas con solución salina y probar nuevamente. La concentración de la muestra es obtenida multiplicando el resultado por el factor de dilución. 7- Utilizar componentes del mismo lote. No intercambiar reactivos de lotes diferentes. CONTROL INTERNO DE CALIDAD El Laboratorio Clínico debe poseer un programa interno de control de calidad, donde procedimientos, normas, límites y tolerancia para variaciones sean claramente establecidos. Es importante resaltar que todos los sistemas de medición presentan una variabilidad analítica característica, que debe ser vigilada por los propios laboratorios. Por lo tanto, es recomendable la utilización de controles, que permiten la evaluación, la precisión y la exactitud de las dosificaciones. Tabla 2 Precisión Intra-Ensayo Muestra 1 Muestra 2 Muestra 3 Concentración (ng/ ml) 185, , ,0333 Desvío Patrón (ng/ ml) 0,1258 0,1528 0,1756 Coeficiente de Variación (%) 0,0677 0,0493 0,0471 Tabla 3 Precisión Inter-Ensayos Lote 1 Lote 2 Lote 3 Concentración (ng/ ml) 113, , ,0000 Desvío Patrón (ng/ ml) 1,2763 1,4318 1,3377 Coeficiente de Variación (%) 1,1290 1,2676 1,1838 Sensibilidad A sensibilidad del kit BIOLISA Ferritina es 1,0 ng/ml. SIGNIFICADO DIAGNÓSTICO La ferritina es la más importante proteína de reserva de hierro y es encontrada en todas las células, especialmente en aquellas envolvidas en la síntesis de compuestos férricos, en el metabolismo y reserva del mismo. La dosis de ferritina es el más fiel indicador de la cantidad de hierro almacenado en el organismo. Su gran utilidad clínica está en el diagnóstico diferencial entre las anemias hipocrónicas y microcíticas por deficiencia de hierro, de anemias por otras etiologías. En esos casos, la ferritina disminuye antes de las alteraciones de los niveles de hierro sérico y de las alteraciones morfológicas de la serie roja. Sin embargo, por hacer parte del grupo de proteínas de fase aguda, la ferritina se eleva en respuesta a infecciones, traumatísmos e inflamaciones agudas. La elevación ocurre en las 24 a 48 horas iniciales, con un pico en el tercer día, y se mantiene por algunas semanas, lo que puede dificultar su interpretación. Sus niveles pueden elevarse con el exceso de hierro, en pacientes transfundidos y en neoplasias, especialmente en las leucemias y linfomas y en los carcinomas de mama, higado, pulmón, colon y próstata. Se elevan, también, en las anemias hemolíticas y megaloblásticas y en las lesiones hepáticas, especialmente alcohólicas. Cerca de 25% de los pacientes com hepatitis crónica tienen aumento de la ferritina. GARANTIA DE CALIDAD Antes de ser liberado para el consumo, todos los reactivos Bioclin son testados por el Departamento de Control de Calidad. La calidad de los reactivos es asegurada hasta la fecha de validad mencionada en el embalaje de presentacion, desde que sean almacenados y transportados en las condiciones adecuadas. DATOS DEL FABRICANTE QUIBASA QUÍMICA BÁSICA Ltda Rua Teles de Menezes, 92 - Santa Branca CEP Belo Horizonte - MG - Brasil Tel.: +55 (31) Fax: +55 (31) CNPJ: / Industria Brasileña ATENDIMIENTO AL CONSUMIDOR Servicio de Asesoría al Cliente Tel.: Numero de Registro do kit BIOLISA Ferritina en la ANVISA: Revisión: Julio/12 Español 2/2 TRAZABILIDAD Los patrones del kit son trazables al material de referencia NIBSC 94/572 (Ferritin Human Recombinant - WHO International Standard). VALOR DE REFERENCIA Los rangos de referencia aproximados para hombres y mujeres adultos normales fueron establecidos usándose 400 muestras de sueros normales y probandose con BIOLISA Ferritina. Adultos: Hombres ng/ml Mujeres ng/ml Recién Nacidos: ng/ml 1 Mes - 2 Meses: ng/ml 3 Meses - 5 Meses: ng/ml 6 Meses - 16 Años: ng/ml Estos rangos deben ser usados apenas como directrices. Se recomienda que cada laboratorio establezca sus propios rangos para poblaciones normales y anormales. Estos rangos siempre son dependientes del local, población, laboratorio, técnica y especificidad del método. DESEMPEÑO DEL PRODUCTO CONTROL DE CALIDAD Precisión La precisión inter e intra-ensayo de BIOLISA Ferritina fue determinada por el análisis en tres niveles diferentes en pools de suero de pacientes. El número, valores promedios, desvío patrón (r) y coeficiente de variación para cada uno de estos controles son presentados en la Tabla 2 y Tabla 3. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 1- Beamish, MR et al; Transferrin iron, chelatable iron and ferritin in idiopathic hemochromatosis.. Br.Jour. Haematology 27: Grace ND, Powel LW: Iron storage disorders of the liver. Gastroenterology; 67: Anonymous. Adult screening for anemie and hemoglobinopathies. Nurse Pract, 20: Corti MC., Gaziano M., Hennekens CH.: Iron status and risk of cardiovascular disease. Ann. Epidemiol., 7:62-68, Edwards CQ., Kushmar Jp,: Screening for hemochromatosis, NEJM., 32: , Jandal JH.: Textbook of hematology. 2 ED.Philadelphia.lippinscott- Raven Pub, Jonxix JHP., Visser HKA.: Determination of low percentage of fetal hemoglobin in the blood of normal children. Am.J.Dis.Child.92:588-98, Jouanolle AM., David V., LeGail JY.: Genetic Hemochromatosis. Ann. Biol.Clin. (Paris). 55: , Lee GR, Ed.: Wintrobe s Clinical Hematology. Baltimore. Williams & Wilkins, Little DR.: Hemochromatosis; Diagnosis and Management. Am.Fam. Physician.53: , Morikawa K, Oseko F., Morikawa S.: A role for ferritin in Lymphoma and the immune system. Leukemia Lymphoma, 18: , Naimark BJ., Reddy AE., Sawasky JA.: Serum Ferritin and Heart Disease; The effect of moderate exercise on iron storage in postmenopausal women. Can.J.Cardiol., 12: , Steiene-Martin EA., Lotspeich-Steininger CA., Koepke JÁ.: Clinical Hematology:Principles, Procedures, Correlations. 2 Ed. Lippinscott-Raven.Philadelphia, Tietz N.: Textbook of clinical Chemistry. Carl A Burtis. 3 Ed. WB Saunders. Philadelphia.1999.

5 English 1/2 BIOLISA FERRITIN K109 USAGE INSTRUCTIONS FUNCTION Method for the quantitative detection of the Specific Antigen of Ferritin in human serum, by enzyme immunoassay in microplates. PRINCIPLE OF ACTION Methodology: Enzyme immunoassay or immunoenzymetric. In this method, calibrated Ferritin samples from patients or controls are first added to the micro cavities coated with streptavidin. A biotinylated monoclonal antibody (specific for Ferritin) is added and the reagents mixed. The result of the reaction between the biotinylated Ferritin and native Ferritin is an immune complex that is deposited on streptavidin coated cavity. The excess serum proteins are washed through the washing step. Another specific antibody for Ferritin, labeled with an enzyme is added to the micro cavities. The anti-body marked binds with the already immobilized Ferritin cavity. Excess enzyme is washed through the washing step. It generates a color by adding a substrate. The color-intensive generation is directly proportional to the concentration of Ferritin in the sample. The use of multiple reference serum with known levels of Ferritin allows the construction of a response curve of activity/concentration. From the comparison of the response curve, the activity Ferritin in a sample can be correlated with the concentration of Ferritin. After mixing the biotinylated monoclonal antibody and a serum containing the native antigen, there is a reaction between the native antigen and antibody, comprising an antigen-antibody complex. The interaction is illustrated by the following equation: (Ferritin) + Btn Ab (m) (Ferritin) - Btn Ab (m) Btn Ab (m) = Biotinylated Monoclonal Antibody (Excess Quantity) (Ferritin) = Native Antigen (Variable Quantity) (Ferritin) - Btn Ab (m) = Antigen-Antibody complex (Variable Quantity) K a = Constant Rate of Association K -a = Constant Rate of dissociation REAGENTS 1- Reference Standards (A - F) - Store between 2 and 8ºC. Six (6) flasks (A - F) of reference standards of Ferritin in different concentrations in buffer solution ph 7,4 and Sodium Azide. A= 0,0 ng/ml B= 10 ng/ml C= 50 ng/ml D= 150 ng/ml E= 400 ng/ml F= 800 ng/ml 2- Biotinylated Conjugate - Store between 2 and 8ºC. Monoclonal IgG (mouse) biotinylated in buffer, dye and preservative. 3- IgG Conjugate - Store between 2 and 8ºC. IgG anti-ferritin marked with peroxidase, dye and preservative. 4- Sensitized Plate - Store between 2 and 8ºC. 5- Concentrated Washing Solution (50x) - Store between 2 and 8ºC. Phosphate saline solution ph 7,4 and sodium azide. 6- Substrate A - Store between 2 and 8ºC. Tetramethylbenzidine (TMB). 7- Substrate B - Store between 2 and 8ºC. Solution of hydrogen peroxide (H 2 O 2 ). 8- Stop Solution - Store between 2 and 30ºC. Chloridric Acid (HCl) 1N. PRESENTATION REAGENTS 96 TESTS 1- Reference Standards 6 Flasks (A-F) x 1,0 ml 2- Biotinylated Conjugate 1 Flask x 13 ml 3- IgG Conjugate 1 Flask x 13 ml 4-Sensitized plate 1 Plate x 96 tests 5- Concentrated Washing Solution 1 Flask x 20 ml 6-Substrate A 7-Substrate B 8-Stop Solution EQUIPMENTS AND OPERATIONAL INPUTS Materials contained in the kit: - Reagents described in the above board. - Instructions of usage (manual) 1 Flask x 7 ml 1 Flask x 7 ml 1 Flask x 8 ml Materials necessary, but not present in the kit: 1- Pipette(s) capable of dispensing volumes of 25 ml, 50 ml with a precision greater than 1,5%. 2- Re-pipettor(s) for repetitive dispensing volumes of 100 ml and 300 ml, with precision greater than 1,5% (optional) or multichannel pipette. 3- Micro plate washer (optional) or pipettes for for micro cavity washing. 4- ELISA reader capable of absorbance at 450 and 630 nm wavelength. 5- Adjustable volume pipettes (200 ml to 1000 ml) for substrate dilution. 6- Test tubes for dilution of substrates A and B. 7- Paper towel to dry micro-cavities. 8- Timer or clock. 9- Container to store the washing solution after dilution. 10- Distilled or deionized water. 11- Quality Control tools. TRANSPORTATION AND STORAGE CONDITIONS The storage temperature should be between 2 to 8 C. The transport at temperatures between 15 and 30 C should not exceed 72 (seventy two) hours. Do not freeze. Protect from light and avoid moisture. SPECIAL CARE 1- For in vitro diagnostic only. 2- Strictly follow the methodology proposed to obtain exact results. 3- Place the stripes from unused micro cavities in the aluminum wrapper, seal and store in temperatures between 2-8ºC. 4- Water used in material cleaning must to be recent and free of contaminants. 5- Saturated deionizer columns release alkaline water, many ions, oxidizing agents and reducers that may alter the results significantly. 6- Stop Solution contains hydrochloric acid, which is a strong acid. Handle it with care. 7- All raw material generated by the product is tested and should be nonreactive for HBs Antigen, Anti-HIV 1 & 2 and Anti-HCV. However, these tests do not provide total assurance as to the absence of infectious agents. Manual manipulation of any product containing serum is potentially capable of transmitting disease. Therefore, we must take proper bio safety care while handling these products. 8- Always add reagents in the same order to minimize the difference in reaction time between cavities. 9- For safety matter, plates can be covered during the reaction. If you opt for this procedure it is necessary for it to be established as routine. 10- You must ensure that the bottom of the cavity is clean and dry and there are no bubbles on the surface fluid before reading the plate. Do not let the cavities run dry during the test. 11- Do not expose reagents, especially the substrate, to strong light or hypochlorite fumes during storage or incubation steps. 12- We recommend applying the local, state and federal rules for environmental protection, so that disposal of reagents and biological material can be made in accordance with current legislation. 13- To obtain information related to biosafety or in case of accidents with the product, consult the MSDS (Material Safety Data Sheet) available on the website or upon request by the SAC (Advisory Service Customer) of Quibasa. SAMPLES Using serum collected in tubes without additive. Hemolyzed or lipemic samples should not be highly used. Samples can be refrigerated between 2 and 8 C for a maximum of 5 days. If the samples can not be processed within 5 days, can be stored for up to 30 days will -20 C (freezer). For samples to be tested in duplicate, the volume required is at least 0,050 ml of diluted serum. PROCESS DESCRIPTION PREPARATION OF WORKING REAGENT Washing Solution Dilute the content of flask Nº 5 (Concentrated Washing Solution) in 1000 ml of distilled or deionized water. Store at room temperature up to the expiration date printed in the original flask. Substrate - Working solution Determine amount of cavities to be used for preparation of an appropriate quantity. Prepare the solution by mixing equal parts of Substrate A and Substrate B 15 minutes before use. Keep it protected from light until use. To each cavity (test): 50 ml of Substrate A + 50 ml of Substrate B For example: mix 1 ml of Substrate A and Substrate B 1 ml to two strips of 8 micro cavities (16 tests). Leftover reagent occurs. Use no later than one (1) hour after preparation. TECHNIQUE Before starting the assay, bring all reagents, Samples, Reference Standards and Controls to stabilize at room temperature (15-30 C) for at least 40 minutes. Return the microplate strips not used to its original packing 1- Separate the cavities to be used considering: Standards, Controls and Samples (which may be tested in duplicate.) 2- Select the first cavity for blank (OPTIONAL). 3- Pipette 25 ml of the appropriate Standard, Control and Sample into their respective micro cavities. 4- Add 100 ml of Biotinylated Conjugate in each microcavity. 5- Homogenize gently for ± 30 seconds. 6- Incubate for 30 minutes at room temperature. 7- Discard the contents of the plate by aspiration (Washer) or decanting (manual). Pipette approximately 300 ml of washing solution previously prepared* to make a total of five (5) washing cycles. To ensure the drying of the plate at the end of washing, beat it for a few seconds on absorbent paper. 8- Pipette 100 ml of IgG Anti-Ferritin into each cavity. 9- Homogenize gently for ± 30 seconds. 10- Incubate for 30 (thirty) minutes at room temperature. 11- Repeat step Carry on one of the following procedures: A) Pipette 100 ml of Working Solution ( A + B ), previously prepared*, to each cavity * Refer to PREPARATION OF WORKING REAGENT. Or, B) Pipette 50 ml of Substrate A to each cavity. Pipette 50 ml of Substrate B to each cavity. 13- Homogenize gently for ±30 seconds. 14- Incubate for 15 (fifteen) minutes at room temperature, keep away from light. 15- Pipette 50 ml of Stop Solution to each cavity. 16- Homogenize gently for ± 30 seconds. 17- Reading: at 450 nm (primary filter) / 630 nm (secondary filter) in no longer than 30 minutes (maximum). RESULTS A response curve is used to determine the concentration of ferritin in the samples. 1- Record the absorbance obtained from the printout of the microplate reader as specified in Example Construct a dose response curve using the mean absorbance for each serum adhesion assayed in duplicate versus the corresponding concentration of ferritin in ng/ml on graph paper. 3- Draw the best curve through the points. (See Figure 1). 4- Interpolate the concentration of control or unknown sample of patients in the dose response curve. (See Figure 1). Absorbance Example 1 Figure 1 Ferritin Values (ng/ml) I.D Microcav. Absorb Avg. Absorb. Conc. Cal A Cal B Cal C Cal D Cal E Cal F CTRL 1 Patient 1 Patient 2 A1 0,002 B1 0,003 C1 0,110 D1 0,113 E1 0,586 F1 0,647 G1 1,204 H1 1,320 A2 1,947 B2 1,887 C2 2,586 D2 2,536 E2 0,707 F2 0,734 G2 1,289 H2 1,285 A3 1,647 B3 1,671 0, , , , , , , , , * Data presented in example 1 and Figure 1 are only for illustrative purposes and should not be used in place of the standards in a standard curve must be built for each assay. PARAMETERS OF QUALITY CONTROLS For the test results are considered valid, must be met the following criteria. 1- The absorbance (OD) of calibrator A must be < 0,1 2- The absorbance (OD) of calibrator F must be > 1,2 PROCEDURE LIMITATIONS 1- It is important that the reaction time in each well is held constant for reproducible results. The time for pipetting the samples should not be more

6 than 10 minutes to avoid inappropriateness of testing. If more than one plate is used, we recommend repeating the dose response curve. 2- The addition of the substrate solution initiates a kinetic reaction, which ends by adding the solution stop. However, the addition of substrate and stop solution should be added in the same sequence to eliminate any time deviation during reaction. 3- Microplate Readers dose vertically. Do not touch the bottom of the well 4- Failure to remove adhering solution adequately in the wash, aspiration and decanting may cause a duplication of poor results and erroneous results. 5- Microbiologically contaminated samples should not be used in the test. Also, samples Highly lipemic or hemolyzed should not be used. 6- Patients with a ferritin concentration above 800 ng/ml should be diluted with normal serum free ferritin and try again. The concentration of the sample is obtained by multiplying the result by the dilution factor. 7- Using components from the same batch. Do not interchange reagents from different lots. INTERNAL QUALITY CONTROL The Clinical Laboratory must have an internal quality control, where all procedures, rules, limits and tolerance to variations be clearly established. It is important to mention that all measurement systems present a analytical variety, and it must be monitor by the laboratory. Therefore, it is recommendable the use of controls, allowing the precision and accuracy of the dosages. TRACEABILITY The kit s standards are traceable to the reference material NIBSC 94/572 (Ferritin Human Recombinant - WHO International Standard). REFERENCE VALUES The approximate reference ranges for normal adult men and women were established using 400 normal serum samples and testing with the BIOLISA Ferritin Kit. Adults: Men ng/ml Women ng/ml Newborn: ng/ml 1 Month - 2 Months: ng/ml 3 Months - 5 Months: ng/ml 6 Months - 16 Years: ng/ml These ranges should be used only as guidelines. It is recommended that each laboratory establish its own ranges for normal and abnormal populations. These bands are always dependent on the local population, laboratory technique and specificity of the method. PRODUCT PERFORMANCE QUALITY CONTROL Accuracy The accuracy of inter-and intra-assay BIOLISA Ferritin was determined by analysis at three levels different pools of serum from patients. The number, mean, standard deviation and coefficient of variation for each of these controls are presented in Table 2 and Table 3. Table 2 Intra-assay Precision Sample 1 Sample 2 Sample 3 Concentration (ng/ml) 185, , ,0333 Standard Deviation (ng/ml) 0,1258 0,1528 0,1756 Coefficient of variation (%) 0,0677 0,0493 0,0471 Table 3 Enter-Assay Precision Lot 1 Lot 2 Lot 3 Concentration (ng/ml) 113, , ,0000 Standard Deviation (ng/ml) 1,2763 1,4318 1,3377 Coefficient of variation (%) 1,1290 1,2676 1,1838 DIAGNOSTIC SIGNIFICANCE Ferritin is the most important iron storage protein and is found in all cells, especially those involved in the synthesis of ferric compounds, metabolism and reserve same. The level of ferritin is the most accurate indicator of the amount of iron stored in the body. His clinic is very useful in the differential diagnosis between anemia and hypochromic microcytic iron deficiency, anemia of other etiologies. In these cases, ferritin decreases before changes in serum iron levels and morphological changes of the red series. However, for part of the group of acute phase proteins, ferritin rises in response to infection, trauma and acute inflammation. The increase occurs within 24 to 48 hours, with a peak on the third day, and if keeps for a few weeks, which may hamper its interpretation. Its levels can rise in excess iron in transfused patients and cancer, especially in leukemias and lymphomas and in carcinomas of the breast, liver, lung, colon and prostate. Tower, also in hemolytic anemias and megaloblastic and lesions in the liver, especially beverages. About 25% of patients with chronic hepatitis have increased ferritin. BIBLIOGRAPHIC REFERENCES 1- Beamish, MR et al; Transferrin iron, chelatable iron and ferritin in idiopathic hemochromatosis.. Br. Jour. Haematology 27: Grace ND, Powel LW: Iron storage disorders of the liver. Gastroenterology; 67: Anonymous. Adult screening for anemie and hemoglobinopathies. Nurse Pract, 20: Corti MC., Gaziano M., Hennekens CH.: Iron status and risk of cardiovascular disease. Ann. Epidemiol., 7:62-68, Edwards CQ., Kushmar Jp,: Screening for hemochromatosis, NEJM., 32: , Jandal JH.: Textbook of hematology. 2 ED. Philadelphia. lippinscott- Raven Pub, Jonxix JHP., Visser HKA.: Determination of low percentage of fetal hemoglobin in the blood of normal children. Am.J.Dis. Child.92:588-98, Jouanolle AM., David V., LeGail JY.: Genetic Hemochromatosis. Ann. Biol.Clin. (Paris). 55: , Lee GR, Ed.: Wintrobe s Clinical Hematology. Baltimore. Williams & Wilkins, Little DR.: Hemochromatosis; Diagnosis and Management. Am.Fam. Physician.53: , Morikawa K, Oseko F., Morikawa S.: A role for ferritin in Lymphoma and the immune system. Leukemia Lymphoma, 18: , Naimark BJ., Reddy AE., Sawasky JA.: Serum Ferritin and Heart Disease; The effect of moderate exercise on iron storage in postmenopausal women. Can.J.Cardiol., 12: , Steiene-Martin EA., Lotspeich-Steininger CA., Koepke JÁ.: Clinical Hematology:Principles, Procedures, Correlations. 2 Ed. Lippinscott-Raven. Philadelphia, Tietz N.: Textbook of clinical Chemistry. Carl A Burtis. 3 Ed. WB Saunders. Philadelphia QUALITY ASSURANCE Before being released for consumption, all Bioclin reagents are tested by the Department of Quality Control. The quality of reagents is assured until expiration date stated on the presentation packaging, when stored and transported under appropriate conditions. MANUFACTURER S DATA QUIBASA QUÍMICA BÁSICA Ltda Rua Teles de Menezes, 92 - Santa Branca CEP Belo Horizonte - MG - Brasil Phone.: +55 (31) Fax +55 (31) CNPJ: / Indústria Brasileira CUSTOMER SERVICE Customer Advisory Service Phone.: ANVISA registration for BIOLISA Ferritin kit: Review: July/12 English 2/2 Sensitivity The sensitivity of the BIOLISA Ferritin kit is 1,0 ng/ml.

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