Diferenciação Celular e Terapia Gênica. Martin Bonamino Divisão de Medicina Experimental CPQ - INCA

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1 Diferenciação Celular e Terapia Gênica Martin Bonamino Divisão de Medicina Experimental CPQ - INCA

2 1953 a estrutura do DNA foi descrita e com isso foi descrito logo em seguida o mecanismo da duplicação do DNA, explicando como ele era transmitido de uma geração para outra. Replicação semi-conservativa

3 1966 E.L. Tatum, no simpósio na Columbia University College of Physicians and Surgeons in New York City intitulada: Reflections on Research and the Future of Medicine: Finalmente nós podemos antecipar que os vírus serão usados efetivamente para o benefício humano, em estudos com célula somática, germinativas e possivelmente para terapia gênica. Nós podemos até ser otimistas sobre a possibilidade de uma terapia baseada no isolamento ou design, síntese e introdução de um novo gene em uma célula com um gene defeituoso em um órgão em particular New England Journal of Medicine recusa a publicação de um artigo no qual French Anderson (pai da terapia gênica) teoriza a possibilidade de atacar doenças hereditárias introduzindo no organismo o gene correto ou substituindo aquele defeituoso.

4 Com objetivo de inserir um gene correto em uma célula contendo uma mutação, será primeiro necessário isolar o gene em questão de um cromossomo normal. Então esse gene tem que ser duplicado para se ter várias cópias. E finalmente, será necessário incorporar a cópia correta no genoma da célula defeituosa ; explicação de Dr. Anderson. Enquanto as discussões das possibilidades de se resolver os problemas genéticos sejam somente especulações, um dos métodos mais promissores seria o desenvolvimento de vírus não patogênicos capazes de transferir o material genético para a célula defeituosa. Esses vírus seriam usados para infectar células em cultura contendo o gene normal. Teoricamente, os vírus iriam incorporar a seqüência de DNA desejada. Então os vírus seriam re-isolados, multiplicados em cultura em massa, purificado e guardados para administração em pacientes que sofressem da doença genética em questão...isso seria usado em benefício da humanidade. F.Anderson, 1968

5 Histórico da Terapia Gênica Experimental: 1970 Stanfield Rogers tratou 2 crianças com arginemia (falta de arginase: altos níveis de arginina no sangue) baseado na observação que animais infectados com papiloma-vírus tinham níveis reduzidos de arginina no sangue. Premissas da terapia gênica: papiloma vírus sem sucesso. Conferência: Ethical and Scientific Issues Posed by Human Uses of Molecular Genetics" on May 15-16, 1975, in New York City Artigo: Essas crianças eram epiléticas, tinham espasmos regulares, eram grosseiramente retardadas, e progressivamente se tornavam piores. Por essas razões, parece válido assumir o risco (que nós não acreditávamos existir, de qualquer forma) da administração dos vírus nessas crianças com o objetivo de substituir o gene da enzima defeituosa.

6 1977 M. Wingler e R. Axel 1º experimento bem sucedido de transferência in vitro do gene da timidina cinase em célula de mamíferos (Cell, Vol 11, , May 1977) Martin Cline (primeiro trangênico) terapia gênica experimental em humanos não aprovada EUA, para pacientes com ß- talassemia: células de medula óssea geneticamente modificadas com gene da cadeia ß da hemoglobina e reinfundida nas pacientes. QUESÕES ÉTICAS

7 Genes Dreams and Realities - (MacFarlane Burnet, 1971) O estímulo para escrever esse livro veio da sensação de que muito material sensacionalista têm sido escrito sobre o futuro da medicina pelas descobertas da biologia molecular. A cada passo, pode se dizer que com o conhecimento restrito que se tem, a terapia gênica é possível em princípio, porém os problema práticos exigiriam um exercito de brilhantes cientistas para supera-los. Na minha opinião não existe nenhuma motivação que leve ao financiamento do governo para pesquisas nesse campo.

8 Final da década de 80-1º protocolo aprovado pelo NIH para teste de terapia gênica em humano: objetivo de demonstrar transferência gênica eficiente. Transferência de genes do sistema imune para um paciente em estágio avançado de neoplasia maligna Primeira doença aprovada para terapia gênica em humanos. Terapia somática (LINFÓCITOS): deficiência em adenosina deaminase: imunodeficiência combinada objetivo clínico-científico primeira terapia gênica direcionada à um órgão interno hipercolesterolemia familiar; primeira terapia gênica utilizando vetores não virais diretamente em tumores fundação da primeira sociedade de terapia gênica (American Society of Gene Therapy) 1º Janeiro º Journal: Human Gene Therapy 1999 Primeira morte devido a terapia gênica: Jesse Gelsinger (18 anos) deficiência na ornitina transcarbamilase.

9 2000 Primeira cura completa pela terapia gênica somática (stem cells): tratamento da imunodeficiência combinada severa X-linked (Bubble boy syndrome); 3 desenvolveram leucemia e 1 morreu (2003) Primeiro produto para terapia gênica aprovado para venda em qualquer lugar do mundo, licenciado na China: vetor de adenovírus contendo gene p Mais de 3000 pacientes vêm sendo tratados por terapia gênica pelo mundo e 619 novos protocolos de clinical trail foram submetidos ao NIH/FDA Primeiro clinical trial para retinose pigmentar aprovado nos EUA Primeiro clinical trial para distrofia muscular.

10 Procedimentos técnicos necessários à terapia gênica em humanos (FDA): isolamento do gene e suas seqüências reguladoras determinar quais são as células afetadas dispor de um mecanismo eficiente (vetores) para inserir o gene nas células especificadas. dispor de tempo para análise. que todos os procedimentos não apresentem efeitos colaterais indesejáveis.

11 Os riscos da terapia gênica: Resposta imune a proteína produzida pelo gene inserido causando inflamação. Mutação insercional. O gene saudável introduzido pode promover a síntese de muita proteína, antes defeituosa, levando a outros problemas. Outros genes podem ser acidentalmente entregue as células. Os vetores pode atingir outras células não afetadas pelo defeito genético, e então provocar algum problema. o vetor viral pode se tornar infectivo/ contagioso.

12 Engenharia genética Transferência (em pacientes com mutação não funcional ou deleção de um gene ) Correção (reverter mutação específica em um gene alvo) Amplificação (aumentar a expressão do gene alvo) Indução de morte (introdução de gene killer ) Silenciamento (inibição da expressão de um gene)

13 Formas de aplicação do vetor na Terapia Gênica Ex vivo: # autólogo/ # seleciona somente célula com novo gene/ # - resp. imune In vivo: # mais direto # atinge diversas células # promotores específicos # direcionamento vetor

14 Vetores para Transferência Gênica

15 Sistemas de entrega Virais: Não virais: Retroviruses Herpes simplex virus Adenovírus Adenovírus associados Métodos físicos Métodos químicos

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17 Vetores não virais Mais recentes na terapia gênica Não imunogênicos Uso repetido Sem mutação insercional Transdução in vivo limitada Principais barreiras: 1. Entrada na célula 2. Degradação citoplasmática 3. Transporte até o núcleo 4. Entrada no núcleo

18 Mecanismo de entrega dos vetores não virais Métodos físicos: Injeção intracelular ou microinjeção Injeção intramuscular Pequena proporção de células Produção de trangênicos Vacinação para várias doenças infecciosas: gripe (1993), malária, tuberculose, hepatite B, HIV, ebola etc. Expressão de 3 meses

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20 Gene Guns 1980 DNA Alta pressão de hélio - Intradérmica Vacinação Expressão 1 mês Mais dispendiosa Eletroporação (1982 mamíferos): célula não incorporam DNA naturalmente Não é usado em humanos

21 Mecanismo de entrega dos vetores não virais Métodos químicos Complexar e condensar o DNA Fosfato de cálcio

22 Complexação e condensação do DNA Polímeros ou lipídeos catiônicos ou a mistura de polímeros com lipídeos endocitados

23 Vetores por excelência; Principais barreiras dos vetores não virais: Sistemas biomoleculares específicos de transferência, recombinação 1. Entrada e expressão na célula gênica; 2. Degradação citoplasmática Vêm evoluindo 3. há Transporte milhões até de o anos núcleo na natureza em associação com bactérias, plantas e animais; 4. Entrada no núcleo

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25 Vetores Doenças hereditárias Doença Gene relacionado Tecido alvo Vetor Enfisema pulmonar a-1-antitripsina Trato respiratório Lipossomas Fibrose cística CFTR Trato respiratório Adenovírus Vírus Adenoassociado Lipossomas (SCID) Adenosina desaminase Linfócitos Células progenitoras hematopoiéticas Retrovírus

26 Doenças adquiridas Doença Gene relacionado Tecido alvo Vetor AIDS Ribozimas RNAm Anticorpos Linfócitos Retrovírus Câncer Genes supressores de tumores HTK-ganciclovir Pulmões, Fígado Cérebro Retrovírus, Adenovírus Retrovírus Parkinson Dopamina (tirosina hidroxilase) Tecido nervoso Vírus da herpes

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28 Geração de Vetores Retrovirais para Terapia Gênica

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31 Novos vetores retrovirais? MLV x Lentivírus Integra em células em proliferação Amplamente testados em trials clínicos Mutagênese insercional Não necessita proliferação Pouco testados em trials clínicos Mutagênese insercional?

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34 Vetores lentivirais derivados do HIV-1 HIV-1 U3RU5 LTR Y GAG POL VPR VIF VPU TAT ENV RRE NEF U3RU5 LTR REV RU5 Y GA RRE PROM TRANSGENE RU5 SD SA Vetor de transferência

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37 Transfecção para geração de vetores virais Envelope (VSV, RD114) Células 293T Rev Transferência (EF1a-PPT-GFP / EF1a-PPT-CD20 ) Empacotador Vetor Viral

38 Procedimentos Caros Estrutura complexa Produção dos vetores Validação dos produtos Verificação da inserção do gene Gene funcional Número de cópias/célula RCR

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44 SCID

45 SEVERE COMBINED IMMUNODEFICIENCY Severe Combine Immunodeficiency Disease (SCID) is a disorder characterized by a marked deficiency of both B-lymphocyte and T- lymphocyte function. Patients get all kinds of infections Lots of very different genetic defects Half of cases are X-linked In humans with XSCID T cell are defective but B cells are normal. One form of the autosomal recessive disease is due to a deficiency of Adenosine Deaminase. Bone marrow transplantation is very effective but the chances of a successful transplant depend in part on the degree of infection and/or failure to thrive present at the time of transplantation.

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47 SCID can result from defects in the IL-2 receptor subfamily: (A) defective expression of the common chain, or (B) defective receptor signaling due to a missing tyrosine kinase T- B+ phenotype 40-50% of SCID cases Rare

48 T- B- SCID Adenosine Deaminase Deficiency (ADA) ADA is an enzyme in the purine salvage pathway pathway is important for T& B-cell development & differentiation T- B- phenotype Accounts for about 20% of all SCID cases Autosomal recessive Treatment Bone marrow transplant Continuous enzyme supplement Gene Therapy Purine nucleoside phosphorylase deficiency and recombinase deficiencies (RAG-1 and -2) also cause SCID of the T-B- phenotype

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50 X-linked agammaglobulinemia (XLA)

51 Hyper-IgM Syndrome Patients make normal (or even increased) amounts of IgM T cell But can t make IgG, IgA, or IgE! defective CD-40L expression X-linked in most cases Patients also have a defect in cellmediated immunity Patients have recurrent bacterial infections and infections with intracellular pathogens (Pneumocystis jiroveci) B cell

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53 Immunodeficiency Syndromes

54 Immunodeficiency Syndromes

55 Immunodeficiency Syndromes

56 SCID SCID: Imunodeficiê ncia combinada severa bubble boy disease Doença genética recessiva Mutação no gene para a adenosina deaminase (ADA) Morte de precursores hematopoiéticos: falência do sistema imunológico

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58 Imunodeficiências: Vetores retrovirais Transdução estável do transgene

59 Results from First Human Gene Therapy Clinical Trial Two years after receiving their last infusions of genetically altered cells to boost their weakened immune systems, the first patients ever to undergo gene therapy are still healthy and benefiting from the treatment. According to a historic research paper published today in Science, the two girls still have white blood cells bearing copies of the replacement ADA gene. Patient 1, whose health improved significantly following gene therapy, has maintained a normal white blood cell count as well as measurable levels of the ADA enzyme, which was almost nonexistent prior to the treatment. Both girls also have developed stronger immune systems, showing improved immune reactions in a battery of tests conducted over the course of the four-year study.

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61 Sustained Correction of X-Linked Severe Combined Immunodeficiency by ex Vivo Gene Therapy Hacein-Bey-Abina, Salima; Le Deist, Francoise; Carlier, Frederique; Bouneaud, Cecile; Hue, Christophe; De Villartay, Jean-Pierre; Thrasher, Adrian J.; Wulffraat, Nicolas; Sorensen, Ricardo; Dupuis-Girod, Sophie; Fischer, Alain; Cavazzana-Calvo, Marina. CD34+ bone marrow cells from five boys with X-linked severe combined immunodeficiency were transduced ex vivo with the use of a defective retroviral vector. Integration and expression of the (gamma)c transgene and development of lymphocyte subgroups and their functions were sequentially analyzed over a period of up to 2.5 years after gene transfer.

62 Resultados do protocolo de Terapia Gênica para X-SCID Alain Fischer, Necker Hospital, Paris 3,5 anos após a Terapia Gênica 14 das 15 crianças com X-SCID tratadas: Viviam normalmente em casa sem necessidade do ambiente estéril ( bolha ) ; Possuiam contagens normais de células T nos compartimentos CD4 e CD8; Responderam a várias imunizações infantis, incluindo difteria, tétano e pólio produzindo células T e anticorpos específicos contra os patógenos. A produção de anticorpos apresentava níveis que permitiam evitar as infusões periódicas de imunoglobulinas.

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66 Mutagênese insercional causada por vetores retrovirais MLV LMO2 Ativação cis Ativação cis Interferência com elementos de controle da expressão gênica Alteração do produto gênico

67 Causa das leucemia Translocações envolvendo LMO2: leucemia T c: vantagem seletiva aos clones corrigidos Ambiente linfopênico: Expansão exaustiva dos clones transduzidos? Indução de expansão clonal? LMO2: hotspot para integração dos MLV, especialmente pela expressão na linhagem T Cada patologia e protocolo de terapia gênica tem sua particularidade

68 Risco: - Mutagênese insercional Prevenção: - Refinamento dos protocolos de transdução (número de cópias próvirus/célula), menos estímulo e tempo de cultura - Menor número de células transduzidas Risco: - Terapia ineficaz por baixo número de progenitores? RISCO / BENEFíCiO: TERAPIA GÊNICA x TMO APARENTADO

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71 Phagocyte Dysfuncions Leukocyte Adhesion Deficiencies -leukocyte interaction with vascular endothelium is disrupted Diminished intracellular killing of organisms, resulting from defective respiratory burst Diminished intracellular killing of organisms, resulting from defective lysosomes

72 Defects in phagocytic cells Prevents adhesion and migration Respiratory burst defect, chronic T H 1 stimulation Respiratory burst defect Respiratory burst defect Vesicle fusion defect

73 Atividade antimicrobiana

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75 Expansão clonal de células Corrigidas com inserções próximas a genes promotores de proliferação Contagem celular normal: células Modificadas sujeitas à regulação fisiológica O percentual de células com o transgene nos compartimentos T e B manteve-se baixo

76 Terapia gênica Imunodeficiências: Correção funcional de genes alcançada Desafios: Aumentar o número de patologias tratadas Melhorar os protocolos terapêuticos para minimizar os riscos novos vetores melhor regulação gênica melhores transduções sistema de segurança (gene suicida?)

77 Terapia Gênica: Riscos dos protocolos in vivo Jesse Gelsinger Tratamento com vetor adenoviral: - Falência múltipla de órgãos - Toxicidade hepática devido à carga de vetores virais administrada - Tropismo do vetor viral pelo fígado - Possível recombinação do vetor utilizado

78 Distúrbio metabólico de origem genética deficiência da ornitina descarboxilase não metabolização da amônia 1/ fatal após 72hs de vida JG forma parcial do distúrbio, controlado por medicamentos Convidado a participar do clinical trial phase I adenovírus/kg artéria hepática. Falecimento 4 dias após injeção. University of Pennsylvania and Genova (Dr.James Wilson) 691 eventos adversos pré-clínicos não publicados Adenovírus resposta imune Washingtonpost: Teen Dies Undergoing Gene Therapy By Rick Weiss and Deborah Nelson Washington Post Staff Writers Wednesday, September 29, 1999; Page A1 Jesse Gelsinger

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84 Gene therapy for ß-thal Gene transfer of a regulated ß-globin gene in HSCs would reduce the imbalance between a- and ß-globin chains in erythroid cells Transplantation of autologous, genetically corrected HSCs would represent an alternative therapy for thalassemic patients lacking a suitable bone marrow donor

85 Gene therapy for ß-thal

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87 Beta Thalassemias Result from Point Mutations on genes Severity depends on where the hit(s) lie b 0 -no b-globin synthesis; b + reduced synthesis Disease results in an overproduction of a- globin chains, which precipitate in the cells and cause splenic sequestration of RBCs Erythropoiesis increases, sometimes becomes extramedullary

88 TERAPIA GENICA DELLA ß-TALASSEMIA Gene therapy for ß-thalassemia 21_11.jpg ß-globin vector Purification of CD34 + cells Patient Infusion of genetically-corrected cells Transduction

89 The success of gene therapy is based on: efficient gene transfer into target cells adequate level of transgene expression persistence of gene expression regulation of gene expression tolerance to transgene product safety

90 ß-globin locus LCR

91 Lentiviral vectors (1996) HIV-1 DNA 5 LTR Y GAG PRO POL VIF R U ENV TAT RRE NEF 3 LTR REV (A)n Proviral DNA U3 R U5 PBS RRE PPT U3 R U5 Genomic RNA Y RRE SD SA SA CAP R U5 U3 R PBS PPT ORFs Frame 1 Frame 2 Frame 3 gag tat vpu vpr pro pol env vif rev nef U3 R U5 5 LTR SD GA RRE SA PROMOTER TRANSGENE R U5 3 LTR

92 Lentiviral vectors in GT: the French trial

93 Science, 2007 Terapia Celular/Terapia Gênica

94 Terapia Celular/Terapia Gênica Uso de células autólogas Não há rejeição imunológica Indução das ips com os mesmos 4 genes, mas c-myc desligado depois para prevenir tumores. Science, 2007

95 Reversão do fenótipo

96 Possibilidades Infinitas Qualquer doença com uma única mutação genética pode ser tratada Regeneração tecidual Testes de toxicidade in vitro Testes de ips para terapia estão em andamento

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98 Zinc Finger Nucleases Inserção sítio dirigida

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102 Imunoterapia O papel dos linfócitos T Reconhecer o tumor.. poupar tecidos saudáveis

103 Transplante de precursores hematopoiéticos Enxerto: Precursores hematopoiéticos + Linfócitos (T)

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105 Doença do Enxerto Contra o Hospedeiro (DECH) x Enxerto Contra Leucemia (ECL)

106 Doença do Enxerto Contra o Hospedeiro

107 Os linfócitos T estão intimamente ligados ao efeito antitumoral e à Doença do Enxerto Contra o Hospedeiro Eliminar os linfócitos T do enxerto evita a DECH, mas impede o efeito ECL

108 Enxerto contra Leucemia (ECL) Appelbaum, 2001

109 Enxerto contra Leucemia (ECL) Appelbaum, 2001

110 Enxerto contra Leucemia (ECL) Appelbaum, 2001

111 Enxerto contra Leucemia (ECL) Appelbaum, 2001

112 Gene suicida para o tratamento da DECH aguda Cell culture BMT Recipient Activation of T cells Select transgene Positive T cells For Infusion GVHD Collect donor PBMC Gene transfer Drug treatment for transgene-positive T cell elimination

113 Sistema de gene suicida HSV-TC HSV TC HSV TC Cinases Celulares Bonini et al, Science 1997

114 Limitações Proteína imunogênica Timidina Cinase Seleção de mutantes não funcionais da proteína TC Ganciclovir - uso no pós transplante

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117 Terapia Gênica para tumores com defeitos em p53

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120 Terapia gênica e Câncer Explorando o sistema imunológico

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123 Imunoterapia

124 Transferência adotiva de células T

125 Transferência adotiva de células T

126 Transferência adotiva de células T

127 Evasão Tumoral

128 Reconhecimento de Tumores Antígenos Tumorais

129 Tumor Infiltrating Lymphocytes 129

130 Terapia Gênica na Imunoterapia?

131 Anticorpos Monoclonais Recurrent colorectal cancer labeled with a monoclonal antibody conjugated to a radioisotope. Tumor as red spots located in the pelvic region, while blood vessels are outlined by circulating antibody (green).

132 Redirecionamento de linfócitos para a eliminação de tumores

133 Receptor quimérico de antígeno (CAR) Reconhecimento independente de MHC Alta afinidade pelo antígeno Dispensa seleção de clones reativos do paciente

134 Ativação da Célula T

135 A estimulação de células T requer múltiplos sinais

136 CD19 Biagi et al, 2005

137 Kershaw et al, 2005

138 Resposta anti-cd20 NIH3T3 CD20 CD3z NK92

139 Brentjens et al, 2007

140 D+143 Blood, Julho 2010

141 Neuroblastoma em pacientes pediátricos CAR anti GD2 Pule et al, Nature Medicine 2008

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