DESENVOLVIMENTO DE NANORRADIOFÁRMACO À BASE DE BEVACIZUMABE MARCADO COM TECNÉCIO-99m PARA DIAGNÓSTICO PRECOCE DO TUMOR ESTROMAL GASTROINTESTINAL

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1 Programa de Pós-Graduação Mestrado em Radioproteção e Dosimetria Instituto de Radioproteção e Dosimetria Comissão Nacional de Energia Nuclear THAÍS LIGIÉRO BRAGA DESENVOLVIMENTO DE NANORRADIOFÁRMACO À BASE DE BEVACIZUMABE MARCADO COM TECNÉCIO-99m PARA DIAGNÓSTICO PRECOCE DO TUMOR ESTROMAL GASTROINTESTINAL Rio de Janeiro RJ 2015

2 THAÍS LIGIÉRO BRAGA DESENVOLVIMENTO DE NANORRADIOFÁRMACO À BASE DE BEVACIZUMABE MARCADO COM TECNÉCIO-99m PARA DIAGNÓSTICO PRECOCE DO TUMOR ESTROMAL GASTROINTESTINAL Dissertação aprovada para obtenção do Grau de Mestre pelo Programa de Pós-Graduação em Radioproteção e Dosimetria do Instituto de Radioproteção e Dosimetria da Comissão Nacional de Energia Nuclear na área de Biofísica das Radiações. Orientadora: Dra. Maria Angélica Vergara Wasserman IRD/CNEN Co-orientador: Dr. Ralph Santos Oliveira Rio de Janeiro Brasil 2015

3 T B813d Braga, Thaís Ligiéro Desenvolvimento de nanorradiofármacos à base de Bevacizumabe marcado com Tecnécio-99m para diagnóstico precoce do tumor estromal gastrointestinal / Thaís Ligiéro Braga Rio de Janeiro: IRD, XVI, 88 f., 29,7cm: il., tab. Orientadora: Dra. Maria Angélica Vergara Wasserman Co-orientador: Dr. Ralph Santos-Oliveira Dissertação (Mestrado) Instituto de Radioproteção e Dosimetria, Rio de Janeiro, Referências bibliográficas: f Medicina Nuclear, 2. Radiofármacos, 3. Bevacizumabe, 4.GIST, 5.Nanopartículas, 6.Biodistribuição I. Título

4

5 Dedico este trabalho ao meu filho, Bernardo Vicente Ligiéro Braga Souto e ao meu marido, Felipe Vicente Rodrigues Souto, que formam a minha família e que compreenderam minha ausência para a realização deste trabalho. i

6 AGRADECIMENTOS Primeiramente a Deus, pela oportunidade única de ir além do que eu imaginava ser capaz, me fortalecer para o contato com quem precisava do meu conhecimento. Ao meu marido Felipe Vicente Rodrigues Souto, que sempre me incentivou a enfrentar novos desafios, sem cobrar da minha ausência e muitas vezes ficou com o meu filho para eu poder estudar. Ao meu filho Bernardo Vicente Ligiéro Braga Souto que do jeitinho dele, compreendeu a minha ausência e é a minha grande inspiração para a realização desse trabalho. Aos meus pais, Teresa Cristina Soares Ligiéro Braga e Ronaldo Cancela Braga, pelo sentimento e expressão de orgulho em mais uma etapa conquistada. Agradeço também a eles pela ajuda com o Bernardo Vicente. Aos meus familiares pelo apoio, afeto e reconhecimento. Aos avós do meu marido, Candida e Antonio Vicente, à tia Elsa, à minha sogra Vera Lúcia e o meu cunhado Severino, que me ajudaram principalmente tomando conta da minha jóia rara, Bernardo Vicente. À minha tia Letícia Boechat primeiramente pelo exemplo profissional, pelo incentivo e espírito inovador, apontando os caminhos a seguir, e a serem melhorados durante toda a minha carreira acadêmica e profissional. Aos meus orientadores Drª. Maria Angélica Vergara Wasserman e Dr. Ralph Santos-Oliveira, pela paciência, principalmente na correção do trabalho, pela presença nos momentos de dúvidas, me auxiliando e dividindo comigo a alegria de construir um conhecimento. A Marta de Souza Albernaz, que desde início foi a minha grande incentivadora na área de Radiofarmácia e que não mediu esforços para me ajudar no desenvolvimento do trabalho. Mostrou-me que é possível quando se tem dedicação e amor à profissão Aos amigos do curso de pós-graduação do IRD, pela constante disponibilidade em compartilhar seus conhecimentos comigo, convivendo intensamente esses dois anos de curso, de onde nasceu nossa amizade. E a todos os amigos que mesmo de longe me apoiaram. Aos amigos do Laboratório de Nanorradiofármacos e Novos Radiofármacos, pela ajuda durante o caminho. Em especial, às alunas de Iniciação Científica Suyene e Sarah e ao mestrando Fagner pela ajuda nos experimentos com os animais. ii

7 À CAPES-CNPQ, pelo suporte financeiro da bolsa de mestrado durante a realização do curso de pós-graduação. À FAPERJ, pela verba para a compra de equipamentos e insumos para a realização do projeto de pesquisa. Por fim agradeço imensamente a todos que me apoiaram neste trabalho, acreditaram na minha capacidade e me incentivaram a seguir em frente. iii

8 Os dias prósperos não vêm por acaso; nascem de muita fadiga e persistência (Henry Ford) iv

9 RESUMO O desenvolvimento de novos radiofármacos é uma atividade essencial ao aperfeiçoamento da medicina nuclear, e fundamental para o diagnóstico precoce e eficaz de doenças oncológicas. Dentre as diversas possibilidades em pesquisa atualmente no mundo, os radiofármacos a base de quimioterápicos podem ser os mais eficazes na detecção de tumores, particularmente o Tumor Estromal Gastrointestinal (GIST, do inglês Gastrointestinal Stromal Tumor), o Carcinoma Metastático de Células Renais e os tumores neuroendócrinos pancreáticos. Contudo, dificuldades no direcionamento, assim como na adesão do radiofármaco no local desejado, são, atualmente, os principais problemas na detecção precoce e tratamento de alguns desses tumores. Os avanços no ramo da nanotecnologia, em particular nos últimos anos, apontaram importante contribuição na superação desses obstáculos, em especial, na transposição de barreiras moleculares, assim como a funcionalização das nanopartículas, melhorando assim o direcionamento, pelo uso de nucleotídeos de superfície, e o aumento da aderência, o que facilita a disponibilização do fármaco e consequentemente, aumenta as chances de diagnose precoce e tratamento mais eficaz. Esse trabalho teve como objetivo a produção, caracterização e avaliação de citotoxicidade, assim como teste in vivo de biodistribuição de nanopartículas de Bevacizumabe marcadas com o radionuclídeo Tecnécio-99m para a detecção de tumores do tipo GIST. O Bevacizumabe foi encapsulado na forma de nanopartículas pelo método de dupla emulsificação utilizando os polímeros ácido poli-acético e álcool polivinílico (PLA/PVA) na concentração de 2% do anticorpo monoclonal. A caracterização das nanopartículas foi realizada pela técnica de microscopia eletrônica de varredura (MEV). A avaliação da citotoxicidade foi feita pelo ensaio de XTT com várias linhagens de células de tumores sólidos. A marcação com Tecnécio-99m foi realizada pelo método direto, determinado o seu rendimento pela cromatografia em papel, utilizando a fase estacionária papel de Whatmam nº 1 e para a fase móvel a acetona. No estudo de biodistribuição foram utilizados ratos Wistar sadios, que foram sacrificados 2 horas após a administração do nanorradiofármaco e dissecados para contagem dos órgãos no contador gama. O MEV evidenciou que as nanopartículas apresentam forma esférica, com dispersão de tamanho entre 180 a 200 nm. O efeito citotóxico das nanopartículas foi confirmado pela diminuição da viabilidade das linhagens de células tumorais MDA-MB 231, A549 e MCF-7 que expressam VEGF, a partir de 500 µg/ml de nanopartículas de PLA/PVA/BEVACIZUMABE. A marcação v

10 das nanopartículas teve um rendimento maior do que 99%. No estudo de biodistribuição com ratos Wistar sadios, foi observada melhoria na biodistribuição deste fármaco com diminuição do efeito de primeira passagem, deixando-o mais circulante no sangue, melhoria na depuração e diminuição no baço e fígado, com menor comprometimento do sistema imune. Estes resultados sugerem maior segurança e especificidade deste nanorradiofármaco comparado ao fármaco original. Palavras-chaves: Medicina Nuclear, Radiofármacos, Bevacizumabe, GIST, Nanopartículas, Biodistribuição. vi

11 ABSTRACT The development of new radiopharmaceuticals is an essential activity to improve nuclear medicine, and essential for the early and effective diagnosis of oncological diseases. Among the various possibilities current research in the world, the radiopharmaceuticals to chemotherapeutic base may be the most effective in detecting tumors, particularly Gastrointestinal Stromal Tumor (GIST), the Metastatic Renal Cell Carcinoma and neuroendocrine pancreatic tumors. However, difficulties in directing, as well as adhesion of the radiopharmaceutical in the desired location, are currently the main problems in the early detection and treatment of some of these tumors. Advances in the field of nanotechnology, particularly in recent years, indicate significant contribution to overcoming these obstacles, particularly in the implementation of molecular barriers as well as the functionalization of the nanoparticles, thereby improving targeting by the use of surface nucleotides, and the increased adhesion, which facilitates the release of the drug and therefore increases the chances of early diagnosis and more effective treatment. This study aimed to the production, characterization and evaluation of cytotoxicity, as well as in vivo biodistribution test Bevacizumab nanoparticles labeled with Technetium-99m radionuclide for detection of type GIST tumors. Bevacizumab was encapsulated in the form of nanoparticles by the emulsification method using double poly-acetic acid and polyvinyl alcohol polymers (PLA / PVA) at a concentration of 2% of the monoclonal antibody. The characterization of the nanoparticles was performed by the technique of scanning electron microscopy (SEM). The cytotoxicity assessment was performed by XTT assay with various cell lines of solid tumor cells. The labeling with technetium-99m was done by the direct method, and its yield determined by paper chromatography using paper Whatmam 1 as the stationary phase and acetone as mobile phase. In the biodistribution study, we used healthy Wistar rats killed 2 hours after administration. Organs were dissected for counting in the gamma counter. The SEM showed that the nanoparticles have spherical shape, with size dispersion of 180 to 200 nm. The cytotoxic effect of the nanoparticles was confirmed by the decrease of the viability of tumor cell lines MDA, MB-231, MCF- 7 and A549 cells that express VEGF, from 500 mg / ml PLA / PVA / bevacizumab nanoparticles. Nanoparticles labelling had yield a higher than 99%. In the study of biodistribution with healthy Wistar rats it was observed an improvement in the biodistribution of the drug with decreased first-pass effect, making it more available in vii

12 the blood, improved debugging and decrease in spleen and liver, with less involvement of the immune system. These results suggest greater safety and specificity of this nanoradiopharmaceutical compared to the parent drug. Keywords: Nuclear Medicine, Radiopharmaceuticals, Bevacizumab, GIST, Nanoparticles, Biodistribution. viii

13 LISTA DE FIGURAS Figura 1: Estrutura do anticorpo (LABIMUNO, 2009) Figura 2: Estrutura do anticorpo monoclonal Bevacizumabe. Modelo adaptado de Steinbrook (2006) Figura 3: Diagrama com as mudanças no tecido no equilíbrio entre os agentes pró-angiogênico e antiangiogênico, determinando uma resposta angiogênica fisiológica (embriogênese e cicatrização de feridas) ou patológica (psoríase ou neoplasia). Modelo adaptado de Polverini (2002) Figura 4: Esquema que mostra a formação de novos vasos sanguíneos (angiogênese), responsáveis pela nutrição do tumor e pela consequente metástase. Modelo adaptado de Siemann (2002) Figura 5: Representação esquemática do efeito de permeabilidade e retenção aumentada das nanopartículas medicinais em tumores. Os vasos normais estão delimitados por células endoteliais, prevenindo o escape de nanopartículas da corrente sanguínea, enquanto os tecidos tumorais sem células endoteliais integras exibem o escape de substâncias e hiperpermeabilidade permitindo acumulação preferencial no espaço intersticial tumoral. Modelo adaptado de Nie e colaboradores (2007) Figura 6: Representação esquemática de nanocápsulas e nanoesferas poliméricas: a) fármaco dissolvido no núcleo oleoso das nanocápsulas; b) fármaco adsorvido à parede polimérica das nanocápsulas; c) fármaco retido na matriz polimérica das nanoesferas; d) fármaco adsorvido ou disperso molecularmente na matriz polimérica das nanoesferas (SCHAFFAZICK et al., 2003) Figura 7: Preparação da Emulsão Água/Óleo (a/o) com 2% de Bevacizumabe ix

14 LISTA DE FIGURAS Figura 8: Preparação da Emulsão Água/Óleo/Água (a/o/a) com 2% de Bevacizumabe Figura 9: Evaporação do Solvente Orgânico da Emulsão Água/Óleo/Água (a/o/a) com 2% de Bevacizumabe Figura 10: Retirada do Excesso de resíduos das nanopartículas de PLA/PVA/BEVACIZUMABE Figura 11: Administração de 200 µl da amostra de nanopartículas de PLA/PVA/BEVACIZUMABE-99mTc por via intraocular no rato do tipo Wistar anestesiado Figura 12: Imagens da Nanopartícula de PLA/PVA/BEVACIZUMABE nos aumentos de vezes (A), vezes (B) e vezes (C) no MEV Figura 13: Viabilidade celular (Barras de respostas - %) frente a exposição de células A549, MCF-7, MDA-MB231, HepG2 e HUVEC-ST a diferentes concentrações de Nanopartículas de PLA/PVA/BEVACIZUMABE (µg/ml). (*) P < 0,05. Os valores são a média ± desvio padrão de três experimentos independentes Figura 14: Rato dissecado após sacrifício em câmara de gás de Dióxido de Carbono para retirada dos órgãos Figura 15: Biodistribuição das nanopartículas de PLA/PVA/BEVACIZUMABE- 99m Tc após 2 h da administração intraocular em relação à dose injetada em cada órgão e no sangue Figura 16: Biodistribuição das nanopartículas de PLA/PVA/BEVACIZUMABE- 99m Tc após 2 h da administração intraocular em relação à dose injetada em cada grama de tecido dos órgãos avaliados e no sangue x

15 LISTA DE TABELAS Tabela 1: Tabela 2: Risco de comportamento agressivo no GIST segundo Miettinen e Lasota (2001)... 8 Contagem dos pedaços da fita no contador gama com as respectivas porcentagens em cada pedaço xi

16 LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS ANVISA Agência Nacional de Vigilância Sanitária a/o Água/Óleo a/o/a Água/Óleo/Água CD Cluster of Differentiation Cluster de Diferenciação CDC Citólise Dependente de Complemento CDR Complementarity Determining Regions Região Determinante de Complementaridade CGA Campos de Grande Aumento CPM Contagem Por Minuto DMEM Dulbecco modified Eagle's Minimal Essential Medium - Meio essencial de Eagle Modificado por Dulbecco DNA Desoxyribunucleic Acid Ácido Desoxirribonucléico EMEA European Agency for the Evaluation of Medicinal Products Agência Europeia de Avaliação dos Medicamentos EPR Enhanced Permeability and Retention Efeito Permeabilidade e Retenção Aumentadas Fab Fragment antigen binding Fragmentos ligadores de antígeno FBS Fetal Bovine Serum Soro Fetal Bovino Fc Fração cristalizável FDA Food and Drug Administration Administração de Alimentos e Medicamentos GIST Gastrointestinal Stromal Tumor Tumor Estromal Gastrointestinal HAMA Human Anti-Mouse Antibody Anticorpos Humanos Antimurinos xii

17 LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS HER2 Human Epidermal growth factor Receptor 2 Receptor do Fator de Crescimento Epidérmico Humano 2 IARC International Agency for Research on Cancer Agência Internacional para Pesquisa em Câncer Ig Imunoglobulina IgG Imunoglobulina G ISO International Organization for Standardization Organização Internacional para Padronização MBq Megabecquerel MEV Microscopia Eletrônica de Varredura µci Microcurie 99 Mo/ 99m Tc Molibdênio-99 / Tecnécio-99 metaestável OMS Organização Mundial de Saúde OPTI-MEM Meio MEM (Minimum Essential Medium Meio Essencial Mínimo) contendo tampão HEPES (N-2 Hidroxietil piperazine N - 2 ácidosulfônico etano, ph 7,4)) PBS Phosphate Buffered Saline Tampão Fosfato Salino PDGFR-α Platelet Derived Growth Factor Receptor PET PLA PLA/PVA/BEVACIZUMABE PLA/PVA/BEVACIZUMABE- 99m Tc Receptor do Fator de Crescimento Derivado de Plaquetas alfa Positron Emission Tomography Tomografia por Emissão de Pósitrons Polylactic Acid Ácido Poli-Lático Nanopartículas de PLA, PVA e 2% de Bevacizumabe Nanopartículas de PLA, PVA e 2% de Bevacizumabe marcadas com Tecnécio-99m xiii

18 LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS PlGF Placental Growth Factor Fator de Crescimento Placentário PMS Metossulfato Phenazine Fenazina Metassulfato PVA Polyvinyl Alcohol Álcool Poli-vinílico rpm Rotações por minuto VEGF Vascular Endothelial Growth Factor Fator de Crescimento Endotelial Vascular VEGFR Vascular Endothelial Gowth Factor Receptor Receptor de Fator de Crescimento Endotelial Vascular WHO World Health Organization Organização Mundial de Saúde XTT 2,3-bis(2-metiloxi-4-nitro-5-sulfofenil)- 2H-tetrazólio-5-carboxanilida xiv

19 SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO Objetivo Objetivo Geral Obejetivos Específicos FUNDAMENTOS TEÓRICOS Câncer Tumor Estromal Gastrointestinal (GIST) Terapia-Alvo Anticorpo monoclonal Estrutura do anticorpo monoclonal Tipos de anticorpos monoclonais Nomenclatura Resistência aos anticorpos monoclonais Efeitos tóxicos dos anticorpos monoclonais Bevacizumabe Anticorpos marcados Radiofármacos Nanorradiofármacos Tipos de nanopartículas Métodos de preparo de nanopartículas MATERIAIS E MÉTODOS Materiais Equipamentos Métodos Obtenção das nanopartículas Caracterização morfológica e dimensional das nanopartículas Avaliação da citotoxicidade das nanopartículas Linhagem de células Ensaio de XTT Marcação das nanopartículas com Tecnécio-99m ( 99m Tc) xv

20 Processo de marcação das nanopartículas pelo método direto com o Tecnécio-99m ( 99m Tc) Controle de qualidade do processo de marcação das nanopartículas com o Tecnécio-99m ( 99m Tc) Estudo de biodistribuição RESULTADOS E DISCUSSÕES Obtenção das Nanopartículas Caracterização morfológica e dimensional das Nanopartículas Avaliação da Citotoxicidade das Nanopartículas Ensaio de XTT Marcação das nanopartículas com Tecnécio-99m ( 99m Tc) Controle de qualidade do processo de marcação das nanopartículas com o Tecnécio-99m ( 99m Tc) Estudo de biodistribuição CONCLUSÕES Sugestões para trabalhos futuros REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ANEXO A: Carta de aprovação do Comitê de Ética no Uso de Animais (CEUA-UEZO) ANEXO B: Monoclonal Antibodies: Application in Radiopharmacy xvi

21 1 INTRODUÇÃO Atualmente, o câncer está entre as principais causas de morte no mundo, sendo um evidente problema de saúde pública mundial (WHO, 2014, BRASIL, 2011). Em 2012, os novos casos de câncer por ano eram cerca de 14 milhões, um número que deve subir para 22 milhões nas próximas duas décadas. No mesmo período, as mortes por câncer estão previstas para aumentar de uma estimativa de 8,2 milhões por ano para 13 milhões por ano (WHO, 2014). No Brasil, os casos de câncer também vêm crescendo e chamando cada vez mais a atenção das autoridades. Dessa forma, pesquisas que visem o desenvolvimento de novos métodos de prevenção, diagnóstico e tratamento são prioritárias de modo a diminuir a mortalidade e aumentar a sobrevida dos pacientes oncológicos (BRASIL, 2014). Os tumores estromais gastrointestinais (GIST Gastrointestinal Stromal Tumor) são neoplasias raras, porém representam a maioria dos tumores mesenquimais do trato digestivo. Originam-se da expressão da proteína c-kit e das células intersticiais de Cajal, conhecida como o marca-passo intestinal do plexo mioentérico, responsável pela motilidade gastrointestinal (FLETCHER et al., 2002, ALMEIDA et al., 2010). Este tumor deve ser sempre considerado como maligno na ocasião do seu diagnóstico, pois entre 10 e 30% dos casos já se apresentam como doença avançada com metástase à distância ou doença irressecável (YOKOYAMA et al., 2007). Além disso, mais de 40% dos pacientes submetidos à cirurgia potencialmente curativa irão desenvolver recidiva ou doença metastática e consequentemente terão sobrevida reduzida (LINHARES & VALADÃO, 2006). A última década foi de grande avanço no manejo do GIST, no esclarecimento dos mecanismos moleculares relacionados à patogênese da doença, e na utilização da terapia molecular (VIANNA, 2011). Dessa forma, diagnóstico precoce, tratamento correto e acompanhamento rigoroso são fundamentais. Nessa direção o desenvolvimento de novos radiofármacos, acoplados a anticorpos monoclonais, se torna uma boa alternativa. Os anticorpos monoclonais com alta especificidade para antígenos associados a tumores tiveram um grande desenvolvimento com a tecnologia do hibridoma (KOHLER & MILSTEIN, 1975). A característica de poder carregar radionuclídeos especificamente para células ou órgãos possibilitou a produção de radiofármacos altamente específicos e foi o começo de uma nova era na radiofarmácia. 1

22 A vantagem do anticorpo monoclonal está na sua homogeneidade e especificidade para os antígenos imunizantes. Seu papel em oncologia depende da premissa de diferir tecidos cancerosos de tecidos normais de modo que possa ser explorado para imagem e terapia (DIAS, 2005, SANTOS et al., 2006, LIN & IAGARU, 2010). A Radioimunoterapia iniciou os estudos para Linfoma Não-Hodgkin, sendo aprovado em 2002 pelo FDA (Food and Drug Administration - Administração de Alimentos e Medicamentos) o 90 Y-ibritumab, o primeiro radiofármacos para aplicação terapêutica utilizando um anticorpo monoclonal murínico (WITZIG et al., 2002). A angiogênese, formação de novos vasos sanguíneos é um processo criticamente importante para o crescimento, invasão e desenvolvimento de tumores malignos e suas metástases. Nesse processo, o Fator de Crescimento Endotelial Vascular (VEGF - Vascular Endothelial Gowth Factor) tem sua expressão aumentada na presença de diversos tipos de câncer e possivelmente pode ser associado à progressão do tumor (FANGUSARO et al., 2013). No que se refere ao anticorpo monoclonal recombinante humanizado, Bevacizumabe, existe o consenso na literatura que o mesmo se liga seletivamente ao VEGF, inibindo a sua atividade, assim restringindo o crescimento tumoral ao limitar o desenvolvimento de novos vasos sanguíneos (LIGIERO et al., 2013). Estudos já demonstraram que o Bevacizumabe, melhorou significativamente o tempo de sobrevida de pacientes com tumores diagnosticados precocemente, bem como em estágios avançados da doença em indivíduos com câncer colorretal (HURWITZ et al., 2004). Assim, o Bevacizumabe pode ser útil para o diagnóstico precoce do GIST, visto que a angiogênese é um importante fenômeno para o crescimento e progressão desse tumor. Os radiofármacos são alvo de grande interesse de pesquisadores do mundo todo que almejam o desenvolvimento de novas tecnologias e melhores resultados para exames de imagem para o câncer, diagnóstico molecular e terapia direcionada (BANERJEE et al., 2001, OLIVEIRA et al., 2006). As novas tecnologias englobam o desenvolvimento de micro e nano partículas, com o objetivo de melhorar a biodisponibilidade do radiofármaco, permitir maior eficiência no direcionamento do fármaco nas diversas formas farmacêuticas e facilitar a incorporação do fármaco na formulação (PEREIRA, 2006, PATRÍCIO et al., 2013). A caracterização físico-química das nanopartículas é tecnicamente complexa de ser realizada em função de sua natureza coloidal e da variedade de constituintes que compõem as formulações. No entanto, a determinação destes parâmetros é de extrema importância, pois avalia a estabilidade das preparações e permite determinar o perfil de 2

23 distribuição das nanoestruturas, bem como sua interação com células do sistema fagocitário mononuclear após administração intravenosa (PEREIRA, 2006, PATRÍCIO, 2012). O radionuclídeo Tecnécio 99 metaestável ( 99m Tc) possui várias características como baixo custo, alta disponibilidade, tempo de meia-vida curto e emissão de radiação de baixa energia, que o torna o radioisótopo mais utilizado na marcação de radiofármacos (BANERJEE et al., 2001, OLIVEIRA et al., 2006, PERREIRA, 2006,). O estudo da biodistribuição do nanorradiofármaco é uma importante ferramenta para estabelecer os principais focos onde o radiotraçador é mais captado. Como a distribuição in vivo do radiofármaco é determinada pelas características fisiológicas dos tecidos, ela pode fornecer importantes informações sobre vários tecidos de forma não invasiva (BOERMAN et al. 2000, SARCINELLI, 2014). Neste contexto, a pesquisa e desenvolvimento de novas tecnologias relacionadas ao desenvolvimento de novas formulações contendo radiofármacos como Bevacizumabe marcado com 99m Tc são de grande importância para o futuro dos pacientes com câncer e para a sociedade. 3

24 1.1 Objetivo Objetivo Geral Desenvolvimento de nanopartículas de Bevacizumabe marcadas com Tecnécio- 99m (Tecnécio 99 metaestável) para diagnóstico do GIST Objetivos Específicos Produzir de nanopartículas de Bevacizumabe; Caracterizar as nanopartículas de PLA/PVA/BEVACIZUMABE quanto ao tamanho; Avaliar a citotoxicidade das nanopartículas de PLA/PVA/BEVACIZUMABE; Incorporar o radionuclídeo Tecnécio-99m nas nanopartículas de PLA/PVA/BEVACIZUMABE; Avaliar o perfil de biodistribuição das nanopartículas de PLA/PVA/BEVACIZUMABE marcadas com Tecnécio-99m. 4

25 2 FUNDAMENTOS TEÓRICOS 2.1 Câncer Conhecido há muitos séculos, o câncer foi rapidamente considerado como doença dos países desenvolvidos e com grandes recursos financeiros. Há aproximadamente quatro décadas, a situação vem mudando, e a maior parte do ônus global do câncer pode ser observada em países em desenvolvimento, principalmente aqueles com poucos e médios recursos (BRASIL, 2011). De acordo com estimativas mundiais do projeto Globocan 2012 (FERLAY et al., 2013), da Agência Internacional para Pesquisa em Câncer (IARC, termo em inglês, International Agency for Research on Cancer), da Organização Mundial da Saúde (OMS), houve 14,1 milhões de casos novos de câncer e um total de 8,2 milhões de mortes por câncer, em todo o mundo, em O termo câncer é utilizado genericamente para representar um conjunto de mais de 100 doenças, incluindo tumores malignos de diferentes localizações. O nome é dado a um conjunto de doenças que têm em comum o crescimento desordenado de células que invadem os tecidos e órgãos, podendo espalhar-se (metástase) para outras regiões do corpo (BRASIL, 2011). O câncer é causado por fatores internos (mutações inerentes, hormônios, condições imunológicas) e fatores externos (tabaco, radiação, organismos infecciosos). O tratamento pode ser realizado por cirurgia, quimioterapia, radioterapia, hormônios, imunoterapia e o uso de radiofármacos (GARCIA et al., 2007). Segundo relatório da Agência Internacional para pesquisa em Câncer (IARC / OMS World Cancer Report, 2008), o impacto global do câncer mais que dobrou em 30 anos. O contínuo crescimento populacional, bem como seu envelhecimento, afetou de forma significativa o impacto do câncer no mundo. Esse impacto recaiu principalmente sobre os países de médio e baixo desenvolvimento (BRASIL, 2009, WHO, 2009). Assim, nas últimas décadas, o câncer ganhou uma dimensão maior, convertendo-se em um evidente problema de saúde pública mundial (BRASIL, 2011). Em 2030, a carga global será de 21,4 milhões de casos novos de câncer e 13,2 milhões de mortes por câncer, em consequência do crescimento e do envelhecimento da população, bem como 5

26 da redução na mortalidade infantil e nas mortes por doenças infecciosas em países em desenvolvimento (BRASIL, 2014). O problema do câncer no Brasil ganha relevância pelo perfil epidemiológico que essa doença vem apresentando, e, com isso, o tema conquista espaço nas agendas políticas e técnicas de todas as esferas de governo. O conhecimento sobre a situação dessa doença permite estabelecer prioridades e alocar recursos de forma direcionada para a modificação positiva desse cenário na população brasileira (BRASIL, 2014). Desde 2003, o câncer no Brasil é uma importante causa de morbidade e mortalidade, sendo as neoplasias malignas consideradas como a segunda causa de morte da população, representando quase 17% dos óbitos de causa conhecida, notificados em 2007 pelo Sistema de Informações sobre Mortalidade (NUNES, 1996, BRASIL, 2009). No Brasil, a estimativa para o ano de 2014, que será válida também para o ano de 2015, aponta para a ocorrência de aproximadamente 576 mil casos novos de câncer, incluindo os casos de pele não melanoma, reforçando a magnitude do problema do câncer no país. O câncer de pele do tipo não melanoma (182 mil casos novos) será o mais incidente na população brasileira, seguido pelos tumores de próstata (69 mil), mama feminina (57 mil), cólon e reto (33 mil), pulmão (27 mil), estômago (20 mil) e colo do útero (15 mil) (BRASIL, 2014). A prevenção baseia-se na redução ou eliminação dos fatores de risco; o diagnóstico precoce busca a detecção de mudanças pré-câncer ou estágios iniciais quando o câncer pode ser tratado mais efetivamente; e o tratamento efetivo baseia-se na escolha da terapia mais eficiente para o tipo de câncer (GARCIA et al., 2007). Diversos tipos de câncer têm uma alta chance de cura se detectados precocemente e tratados adequadamente (WHO, 2014). Portanto, dentre as opções disponíveis os radiofármacos acoplados a anticorpos monoclonais são os mais efetivos e modernos. 2.2 Tumor Estromal Gastrointestinal (GIST) Nas últimas décadas, poucos tumores sólidos tiveram um desenvolvimento tão expressivo como os tumores estromais gastrointestinais (GIST). Tal desenvolvimento ocorreu não somente na caracterização patológica e molecular, mas também no desenvolvimento de moléculas para o tratamento, como alvo molecular. Trata-se de um marco para uma doença até há pouco tempo considerada refratária a qualquer 6

27 tratamento sistêmico. Os resultados dramáticos observados como o Imatinibe para tratamento de GIST avançado são um exemplo de tratamento com alvo molecular em tumores sólidos (GUIMARÃES, 2008, VIANNA, 2011). O GIST é um tumor raro. Acredita-se que compreende menos de 3% de todos os tumores malignos do trato gastrointestinal, mas por outro lado é o tumor mesenquimal mais frequente do trato gastrointestinal, representando cerca de 80% dos tumores mesenquimais (OLIVEIRA et al., 2011). Recentemente foi divulgada a incidência mundial de 1,5 casos / cem mil pessoas por ano (CASALI et al., 2009). No Brasil, o Ministério da Saúde, estima que existam 1800 novos casos de GIST a cada ano (MUGAYAR et al., 2008). Ocorrem, predominantemente, entre a 5ª e a 7ª década de vida, com média de idade no diagnóstico de 60 anos, sendo raramente encontrado antes dos 40 anos, e com semelhante distribuição entre os sexos, embora alguns estudos apontem uma discreta predominância masculina (BUCHER et al., 2004, MIETTINEM et al., 2006, MACEDO et al., 2007, OLIVEIRA et al., 2011) A localização mais frequente dos GIST é no estômago (60 a 70%), no intestino delgado (20 a 30%) e, em menor proporção, no esôfago, cólon e reto (menos de 10%). Os GIST também podem se originar em áreas abdominais extra-intestinais, como omento, mesentério e retroperitônio (DeMATTERO et al., 2000, MIETTINEN & LASOTA, 2001, LINHARES & VALADÃO, 2006). Além disso, a localização do GIST também influencia no seu comportamento biológico. Baseado nisso, Miettinen e colaboradores (2002) acrescentaram esta variável na categoria de risco. O GIST então foi classificado em relação ao risco de comportamento agressivo baseado no tamanho tumoral, índice mitótico e localização (MIETTININEN & LASOTA, 2001, RUBIN et al., 2007) (Tabela 1). 7

28 Tabela 01: Risco de comportamento agressivo no GIST segundo Mittninen e Lasota (2006). Escala de Risco de comportamento no GIST Parâmetros do tumor Caracterização do risco de metástases Tamanho Contagem (cm) Mitótica Estômago Duodeno Jejuno/Íleo Reto Muito Baixo Baixo Baixo Baixo > 2 5 (1,9%) (4,3%) (8,3%) (8,5%) 5 por 50 Baixo Moderado Alto Alto CGA > 5 10 (3, 6%) (24%) (34%) (57%) > 10 Moderado (12%) Alto (52%) Alto (34%) Alto (57%) Dados Dados Alto 0 2 Insuficientes Insuficientes (54%) Moderado > 2 5 > 5 por 50 CGA (16%) Alto > 5 10 (55%) Alto > 10 (86%) CGA: Campos de Grande Aumento. Alto (73%) Alto (85%) Alto (90%) Alto (50%) Alto (86%) Alto (86%) Alto (52%) Alto (71%) Alto (71%) O diagnóstico de GIST baseia-se na avaliação histológica. A maioria dos casos pode ser classificada em três categorias: GIST de célula fusiforme (cerca de 70%), que são compostos por células eosinofílicas organizadas em feixes curtos, GIST de célula redonda ou epitelóide (< 30%) e GIST mistos (< 10%) (LINHARES & VALADÃO, 2006, RUBIN et al., 2007, GUIMARÃES, 2008). A análise imunohistoquímica é essencial para o diagnóstico patológico correto de GIST. O antígeno CD 117 pode ser detectado por técnicas imunohistoquímicas como um marcador da presença da proteína KIT em 95% dos casos de GIST. Outros marcadores como CD 34 (positivo em 70%), α-actina de músculo liso (positivo em 40%), S-100 (positivo em 5%) e desmina (positivo em 2%), podem ser úteis no diagnóstico (FLETCHER et al., 2002, D AMATO et al., 2005, VAN DER ZWAN & DeMATTEO, 2005, YEH et al., 2012). O GIST como doença genética hereditária é pouco frequente do tipo autossômica dominante. Na maioria das famílias afetadas, há a presença da mutação no KIT na linhagem germinativa. Várias outras mutações nos exons 8, 11, 13 e 17 do KIT 8

29 e exon 12 do PDGFR-α foram identificadas nos GIST familiares (KANG et al., 2007, RUBIN et al., 2007). As técnicas de imagens comumente utilizadas são tomografia computadorizada, ressonância magnética e PET Scan (Positron Emission Tomography Tomografia por Emissão de Pósitrons). Tais exames são usados para estadiamento e planejamento cirúrgico. Quando do diagnóstico, os GIST tendem a ser grandes, com padrão de crescimento exofítico entre as alças intestinais. Podem ter a aparência heterogênea quando há hemorragia, necrose ou degeneração (GUIMARÃES, 2008, OLIVEIRA et al., 2011, CHRISTOPHER et al., 2012). A sintomatologia do GIST está relacionada com o tamanho, a localização e o grau de agressividade da neoplasia (MIETTINEN et al., 2005, NILSSON et al., 2005, JUDSON & DEMETRI, 2007). De maneira similar a outros sarcomas, os GIST tendem a deslocar ou comprimir órgãos adjacentes sem apresentar invasão direta destas estruturas, portanto podem adquirir grandes volumes antes de se tornarem sintomáticos (FERREIRA, 2007). Sabe-se que na maioria dos casos, cerca de 70%, os pacientes são sintomáticos, em 15% assintomáticos e em 10% os achados são incidentais (MIETTINEN et al., 2005, NILSSON et al., 2005). As metástases, principalmente hepática, podem ocorrer entre 15 a 47% dos casos. Os sintomas mais comuns são: astenia, relacionada a anemia, saciedade precoce, flatulência, sangramento gastrointestinal, dor abdominal, massa palpável e em tumores maiores, oclusão intestinal (JUDSON & DEMETRI, 2007, RUBIN et al., 2007). O tratamento-padrão para GIST localizado é cirúrgico, com ressecção completa do tumor, devendo-se evitar a ruptura deste durante o ato operatório (com risco de extravasamento de células) e com o intuito de margens negativas. É unanimidade entre os autores que o tratamento operatório é a melhor opção terapêutica quando se tem por objetivo a cura do doente, preconizando a ressecção do tumor e órgão adjacentes quando acometidos (LINHARES & VALADÃO, 2006, YOKOYAMA et al., 2007). Frente a todo este cenário do GIST, principalmente em relação aos relatos de presença de metástase em 87% dos casos de GIST, devido à disseminação dos tumores estromais pela invasão de órgão adjacentes e por via hematológica (YOKOYAMA et al., 2007), justifica as pesquisas no campo de diagnóstico precoce. Além disso, sabe-se que o diagnóstico precoce está diretamente ligado à sobrevivência e cura de um paciente com câncer. No entanto, a sensibilidade dos métodos de diagnósticos tradicionais é muito baixa para a detecção da doença em estágios muito iniciais (GIANINI, 2007, CHOI et al., 2010). Logo, torna-se de extrema importância o desenvolvimento de uma 9

30 tecnologia específica, sensível e confiável que permita a realização do diagnóstico precoce e preciso. Atualmente diversos estudos estão sendo desenvolvido no sentido de utilizar a nanotecnologia e biomarcadores tumorais para diminuir o limite de detecção da doença (CHOI et al., 2010) 2.3 Terapia-Alvo Uma nova abordagem em oncologia tem sido o desenvolvimento do uso de agentes direcionados contra determinados alvos expressos, preferencialmente, nas células tumorais, com potencial direcionamento de atividade citotóxica às células alteradas e proteção daquelas que não expressam o alvo (GUIMARÃES, 2008). Assim, de uma maneira direta, consiste em um alvo molecular específico, que atinge um processo biologicamente significativo e fundamental na proliferação das células tumorais (SLEDGE, 2005). Incluem-se nesta classe de agentes de terapia-alvo os anticorpos monoclonais, as nanomoléculas e as vacinas. Os anticorpos monoclonais, como terapia alvo, têm alta especificidade com poucos efeitos colaterais e é o foco de muitas pesquisas nas doenças que necessitam de tratamento clínico ou cirúrgico agressivo. Os anticorpos monoclonais podem ser aplicados intactos ou acoplados a outra molécula, por exemplo, um átomo fortemente radioativo, como o 131 I (Iodo 131), este com o objetivo de destruir uma célula alvo (SANTOS et al., 2006). 2.4 Anticorpo monoclonal O desenvolvimento da tecnologia do hibridoma por Kohler e Milstein (1975), revolucionou o campo dos anticorpos e aumentou radicalmente a pureza e a especificidade dos anticorpos utilizados na clínica e para testes diagnósticos no laboratório (KATZUNG, 2005). No início dos estudos de Kohler e Milstein, os anticorpos monoclonais apresentavam eficácia limitada, em parte por significativa imunogenicidade (BADGER et al., 1987, KHAZAELI et al., 1994, KATZUNG, 2005). 10

31 Isto se devia ao fato que, inicialmente os anticorpos tinham origem murina e estes estimulam o sistema imune a desenvolver anticorpos contra os agentes terapêuticos em 30% dos pacientes (HAMA - Human Anti-Mouse Antibody Anticorpos Humanos Antimurinos). A partir da década de 1980 com a tecnologia de recombinação de DNA (Desoxyribunucleic Acid Ácido Desoxirribonucléico) houve a diminuição da antigenicidade dos anticorpos murinos, possibilitando administrar múltiplas dosagens em humanos (LEE et al., 1998, GUIMARÃES, 2008). Os anticorpos monoclonais têm a capacidade de ligarem-se especificamente e com grande afinidade às células tumorais primárias e metastáticas e criar um efeito antitumoral pela Citólise Dependente de Complemento (CDC). Além disso, pode também aumentar a citotoxicidade mediada por células ou decorrente da ligação do anticorpo a toxinas celulares ou radionuclídeos (anticorpos conjugados) (CARTER, 2001, GOLDENBERG, 2002, STERN & HERMANN, 2005). Os recentes avanços dos genes das imunoglobulinas (Ig) levaram ao desenvolvimento de uma variedade de anticorpos monoclonais humanizados e quiméricos, dirigidos como alvos terapêuticos (KATZUNG, 2005). Atualmente tem-se aprovado pelas agências regulatórias cerca de 48 anticorpos monoclonais, sendo 34 destes aprovados pelo FDA (Food and Drug Administration - Administração de Alimentos e Medicamentos) (EUA) e pelo EMEA (European Medicines Agency - Agência Europeia de Avaliação dos Medicamentos) (Europa) (REICHERT, 2015). A maioria desses está aprovada para o uso em neoplasias hematológicas e vem crescendo o número e as indicações de anticorpos, para o tratamento de neoplasias sólidas. Embora possam ser utilizados como agentes únicos, os anticorpos monoclonais produzem resultados melhores quando associados à quimioterapia, com sinergismo que independe do fármaco usado. São efetivos tanto no tratamento da doença avançada (metastática) quanto na adjuvância, e sua ação depende da intensidade de expressão do antígeno (GUIMARÃES, 2008) Estrutura do anticorpo monoclonal O sistema imunológico identifica e neutraliza objetos estranhos ao corpo, tais como bactérias e vírus, pela ação dos anticorpos que são glicoproteínas grandes. Estas moléculas são chamadas de Imunoglobulinas (Ig) compostas por duas cadeias pesadas e 11

32 duas cadeias leves unidas por pontes de dissulfeto. Nos seres humanos existem dois tipos de cadeias leves (κ e λ) e cinco tipos de cadeias pesadas de Ig (α, δ, ε, γ, e μ). As Ig são agrupadas em cinco classes, de acordo com a estrutura das suas cadeias pesadas: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM. Dentre estas, a IgG (Imunoglobulina G) representa a classe predominante, compreendendo aproximadamente 80% das imunoglobulinas no soro humano, de modo que todos os anticorpos terapêuticos aprovados até o momento são IgG (WANG et al., 2008, FEKETE et al., 2013). Os anticorpos monoclonais pertencem à classe IgG. As cadeias pesadas formam uma estrutura em forma de Y, com as duas cadeias leves posicionando-se em paralelo à porção aberta das cadeias pesadas. As extremidades dos conjuntos cadeia leve-cadeia pesada formam o sítio de ligação do antígeno, sendo a região de reconhecimento primário do antígeno chamada de região de determinação de complementaridade (CDR Complementarity Determining Regions Região Determinante de Complementaridade) (CARTER, 2001, REICHERT, 2001, GOLDENBERG, 2002, MILENIC, 2002, REICHERT, 2002, ROSS et al., 2003, STERN & HERMANN, 2005). Assim os únicos elementos murinos dos anticorpos monoclonais humanizados constituem nas regiões de determinação da complementaridade (CDR) (KATZUNG, 2005) (Figura 1). Figura 1: Estrutura do anticorpo (LABIMUNO, 2009). 12

33 2.4.2 Tipos de anticorpos monoclonais Os anticorpos quiméricos resultam da combinação, por meio da fusão transgênica dos genes de imunoglobulina, com os domínios constantes da molécula de IgG humana com as porções variáveis de murina. Essa junção reduz, porém não elimina a produção de anticorpos humanos antimurinos após administrações múltiplas do anticorpo quimérico ocasionando ineficácia do produto (KUUS-REICHEL et al., 1994, PIMM, 1994). Anticorpos parcialmente humanizados, onde alguns CDR são substituídos por tecnologia recombinante, podem perder completamente a resposta de anticorpos humanos antimurinos, porém algumas vezes também com perda da afinidade do anticorpo murino e perda de eficácia (WATKING & OUWEHAND, 2000, ISAACS, 2001). Os anticorpos humanizados também podem ser deimunizados pela substituição dos epítopos imunogênicos murinos por sequências de aminoácidos pela tecnologia transgênica, resultando em um domínio variável deimunizado, com redução da imunogenicidade e possibilidade de tratamentos múltiplos e por longo tempo (REFF et al., 2002, GUIMARÃES, 2008) Nomenclatura A origem e a finalidade do anticorpo monoclonal são identificadas pelo seu nome. Assim o sufixo mabe é utilizado para a identificação de anticorpos monoclonais e seus fragmentos. A fonte animal a partir do qual o anticorpo foi produzido é reconhecida pelos infixos colocados previamente ao mabe, conforme descrito: -u = humano; -o = camundongo; -a = rato; -zu = humanizado; -e = hamster; -i = primata; -xi = quimérico; -axo = rato/camundongo; -xizu = combinação de humanizado e quimérico. Além disso, pode-se identificar a doença ou alvo do anticorpo, por exemplo, -vir = viral; -bac = bacteriano; -lim ou li = imunomodulador; -les = lesões infecciosas; -cir = cardiovascular e tu =tumor. Nos casos com conjugação com toxinas, -tox, pode ser adicionado ao nome do anticorpo e quando conjugado com substâncias radioativas, o 13

34 símbolo do elemento conjugado e o número do isótopo são acrescentados ao nome do anticorpo, como nos exemplos: tecnécio Tc-99m biciromabe. Portanto, o Rituximabe, por exemplo, significa anticorpo monoclonal (Rituximabe) quimérico (Rituximabe) direcionado ao tratamento de tumores (Rituximabe) (LIMA, 2004, GOODMAN & GILMAN, 2010) Resistência aos anticorpos monoclonais Existe o consenso na literatura especializada que a eficácia terapêutica dos anticorpos monoclonais pode ser diminuída por diversos fatores: i) baixa penetração do anticorpo, principalmente em grandes volumes tumorais ou em órgãos específicos, como cérebro; ii) distribuição não homogênea nos sítios-alvo por alterações na permeabilidade vascular; iii) reatividade cruzada ou ligação do anticorpo a tecidos normais; iv) formação de anticorpos humanos contra os anticorpos utilizados e, v) metabolismo aumentado dos anticorpos injetados, determinando uma interferência significativa nos resultados do tratamento (STERN & HERMANN, 2005, LIGIERO et al., 2013) Efeitos tóxicos dos anticorpos monoclonais Os anticorpos monoclonais possuem poucos efeitos tóxicos, quando comparados aos agentes quimioterápicos. Contudo, ainda que menores esses não podem ser negligenciados. Normalmente, a toxicidade ocorre pela reatividade cruzada com tecidos normais, isto é, uma reação imune (MARQUES, 2005, GUIMARÃES, 2008). 14

35 2.5 Bevacizumabe O Bevacizumabe é um anticorpo monoclonal humanizado recombinante IgG1 (Figura 2) que se liga e neutraliza seletivamente a atividade biológica do fator de crescimento endotelial vascular (VEGF Vascular Endothelial Growth Factor) e inibe a sua interação com os receptores VEGFR 1 e VEGFR 2 (Vascular Endothelial Gowth Factor Receptor Receptor de Fator de Crescimento Endotelial Vascular) (GUIMARÃES, 2008, GOODMAN & GILMAN, 2010). Fc: Fração cristalizável; Fab: Fragment antigen binding Fragmentos ligadores de antígeno. Figura 2: Estrutura do anticorpo monoclonal Bevacizumabe. Modelo adaptado de Steinbrook (2006). O VEGF é um fator de crescimento angiogênico, que regula a proliferação e permeabilidade vasculares, bem como inibe a apoptose de novos vasos sanguíneos. Assim a neutralização da atividade biológica do VEGF reduz a vascularização de tumores, inibindo o crescimento tumoral. A expressão do VEGF encontra-se aumentada em vários tipos de tumores, como mama, ovário, pulmão de células não pequenas e colorretal, correlacionando-se a sua expressão com o processo de neovascularização nos tumores. No câncer colorretal, a densidade de microvasos está associada à progressão de 15

36 adenomas a carcionomas, assim como sua relação ao potencial metastático e, consequente mau prognóstico (GOODMAN & GILMAN, 2010, GOMES et al., 2012). O Bevacizumabe foi o primeiro agente aprovado contra tumor de angiogênese em fevereiro 2004 pelo FDA, seguido pela EMEA e Anvisa (Agência Nacional de Vigilância Sanitária) em 2005 para tratamento de carcinoma metastático de cólon e/ou reto, assim como câncer de pulmão de células não pequenas (HARRIS, 2004, FDA, 2011, GOMES et al., 2012). Além disso, tem sido utilizado de forma off-label (sem aprovação formal pelos órgãos de Vigilância Sanitária) em doenças oculares decorrentes da angiogênese excessiva, tais como a Retinopatia Diabética Proliferativa e a Degeneração Macular Relacionada à Idade, sendo uma prática comum dentro dos consultórios de oftalmologia em diversos países, inclusive o Brasil (GOMES et al., 2012). A angiogênese é um processo fundamental para a formação de novos vasos sanguíneos a partir de capilares pré-existentes (CHAIN et al., 2004). É regulada por um complexo sistema de controle com fatores pró- angiogênicos e antiangiogênicos. Em adultos ela é estritamente controlada por um processo fisiológico denominado balanço angiogênico, isto é, um equilíbrio entre sinais estimulativos e inibitórios do crescimento dos vasos sanguíneos (Figura 3) (POLVERINI, 1995, MAAS et al., 2001, POLVERINI, 2002). 16

37 Figura 3: Diagrama com as mudanças no tecido no equilíbrio entre os agentes pró-angiogênico e antiangiogênico, determinando uma resposta angiogênica fisiológica (embriogênese e cicatrização de feridas) ou patológica (psoríase ou neoplasia). Modelo adaptado de Polverini (2002). Em circunstâncias normais, a formação de novos vasos sanguíneos ocorre a partir do desenvolvimento embrionário, durante processos de cicatrização, no sistema reprodutivo feminino, durante a ovulação e formação da placenta entre outros (POLVERINI, 1995, MAAS et al., 2001, POLVERINI, 2002). O crescimento de tumores sólidos depende da sua capacidade de adquirir, dentre outras coisas, suprimento sanguíneo adequado (FIDLER & ELLIS, 2004, NERI & BICKNELL, 2005). A difusão do oxigênio pelos capilares pode acontecer numa distância de 150 a 200 µm. Se as células neoplásicas estão mais distantes e não alcançam estes vasos, perecem (FIDLER & ELLIS, 2004). Assim, a angiogênese é essencial para o crescimento tumoral e para a ocorrência de metástases (WU et al., 2005). Sua extensão é determinada pelo balanço entre moléculas reguladoras positivas e negativas, liberadas por células vizinhas e pelas próprias células tumorais no ambiente tecidual neoplásico, podendo afetar a composição genética das células do hospedeiro dentro da extensão tumoral (PEREIRA et al., 2008). 17

38 Em humanos, foram identificados 6 membros do VEGF: VEGF-A, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D, VEGF-E e P1GF (Placental Growth Factor Fator de Crescimento Placentário), tendo o VEGF-A um papel mais ativo no processo angiogênico. Observase que a maior parte dos tumores sólidos gerados na mama, pulmões, cólon e reto, dentre outros órgãos, expressam altos níveis de VEFG-A em comparação com os tecidos normais (DE FREITAS et al., 2009). De acordo com Hananah e Folkman (1996), o alto nível de VEGF-A está relacionado ao estresse hipóxico e a ativação de oncogenes durante o crescimento do tumor. Para um crescimento em torno de 1 a 2 mm de diâmetro, o tumor necessita de um suplemento de sangue independente, que é adquirido pela expressão de fatores de crescimento (incluindo os VEGF) que induzem a angiogênese. Este processo continua mesmo com o câncer em seu estágio avançado. Com isso, ocorre a neovascularização direcionada para o tumor sólido, com subsequente crescimento e metástase (Figura 4) (DE FREITAS et al., 2009). Figura 4. Esquema que mostra a formação de novos vasos sanguíneos (angiogênese), responsáveis pela nutrição do tumor e pela consequente metástase. Modelo adaptado de Siemann (2002). Assim, a neutralização do VEGF-A por anticorpos monoclonais se torna um alvo terapêutico para o diagnóstico e tratamento do câncer. 18

39 O Bevacizumabe utilizado em esquema monoterapêutico em oncologia tem ação limitada, mas possui atividade sinérgica à quimioterapia em alguns tumores (GORDON et al., 2001, HURWITZ et al., 2004). A associação de Bevacizumabe e quimioterápicos tradicionais, tais como 5-Fluorouracil, Oxaliplatina e Irinotecano isolados ou em associação para neoplasias de cólon metastático se mostrou benéfica tanto em termos de resposta quanto relativo ao tempo para progressão da doença, confirmando assim o uso do Bevacizumabe no tratamento de primeira linha de câncer colorretal metastático (BERRY et al., 2007). Outro estudo (ECOG E3200) comparou o acréscimo do Bevacizumabe com o regime FOLFOX4 (Oxaliplatina, 5-Fluorouracil e Ácido Fólico), FOLFOX4 e Bevacizumabe sozinhos, concluindo que a adição do Bevacizumabe ao regime quimioterápico com Oxaliplatina, 5-Fluorouracil e Ácido Fólico dos pacientes previamente tratados com câncer colorretal metastático era mais eficaz (GIANTONIO et al., 2007). Outro fator relevante é a constatação que o uso de Bevacizumabe em neoplasia de cólon metastático pode proporcionar maior taxa de ressecção de metástases com intensão curativa, sem aumento significativo nas taxas de complicações com ferida operatória e sangramentos (ELLIS et al., 2005). A eficácia do Bevacizumabe levou sua aprovação para tratamento de primeira e segunda linha de câncer colorretal metastático combinado com 5-Fluorouracil (FDA, 2011). Em neoplasias de pulmão de células não pequenas o estudo de fase III randomizado comparou o tratamento convencional (Paclitaxel e Carboplatina 444 pacientes) com o mesmo tratamento acrescido de Bevacizumabe (434 pacientes). Os resultados comprovaram que o uso de Bevacizumabe associado a quimioterapia apresentava aumento na taxa de resposta (35% com Bevacizumabe contra 15% sem Bevacizumabe), sobrevida livre de progressão (6,2 meses com Bevacizumabe contra 4,5 meses sem Bevacizumabe) e sobrevida global (12,3 meses com Bevacizumabe contra 10,3 sem Bevacizumabe) (SANDLER et al., 2006), ocasionando sua aprovação para tratamento de primeira linha de câncer de pulmão de células não pequenas combinado com Carboplatina e Paclitaxel (FDA, 2011). No câncer de mama metastático HER2-negativo (Human Epidermal growth factor Receptor 2 Receptor do Fator de Crescimento Epidérmico Humano 2), estudo de fase III randomizado, aberto, comparou a eficácia e a segurança do esquema quimioterápico com Paclitaxel puro e Paclitaxel combinado com Bevacizumabe. Neste 19

40 estudo foram incluídos 722 pacientes, a combinação de Paclitaxel e Bevacizumabe prolongou significativamente a sobrevida livre de progressão (11,8 meses) em comparação ao Paclitaxel sozinho (5,9 meses) e aumento da taxa de resposta objetiva de 36,9% contra 21,2% (MILLER et al., 2007). A associação à Capecitabina, aumentou a taxa de resposta em relação a quimioterapia isolada de 9% para 20%, sem repercussão na sobrevida livre de progressão nos pacientes com câncer de mama metastático previamente tratadas com Antraciclinas ou Taxanos (MILLER et al., 2005). Esse resultado levou a sua aprovação para o tratamento do câncer de mama metastático HER2-negativo combinado com Paclitaxel e que não receberam tratamento quimioterápico anterior e não sendo indicado nos casos de progressão de doença após quimioterapia com Antraciclinas e Taxanos (FDA, 2011). A farmacocinética do Bevacizumabe varia de acordo com o sexo, o peso corporal e a carga tumoral. A depuração do Bevacizumabe é mais alta em pacientes com carga tumoral maior e baixa albumina, porém a sua relação com o desfecho clínico não foi explorada. O Bevacizumabe tem meia-vida estimada de 20 dias (com faixa de 11 a 50 dias, sendo tipicamente 18 dias para mulheres e 20 dias para homens) e tempo previsto para alcançar o estado de equilíbrio dinâmico de 100 dias quando administrado em doses terapêuticas (ANVISA, 2014). A expectativa inicial no uso dos agentes antiangiogênicos é a de que seriam praticamente isentos de reações adversas, fato que não se observou nos estudos clínicos (GUIMARÃES, 2008). Dentre os efeitos mais comuns pode-se citar: hipertensão grave, proteinúria, insuficiência cardíaca congestiva, hemorragia e perfuração gastrointestinal (GOODMAN & GILMAN, 2010, ANVISA, 2014). 2.6 Anticorpos marcados Após 30 anos de pesquisa e desenvolvimento, a terapia com anticorpos monoclonais começa a ser tornar uma realidade. O uso é mais difundido no campo da oncologia, onde metade dos agentes aprovados para uso clínico de rotina é empregado e um grande número de moléculas encontra-se atualmente em ensaios clínicos (SCOTT et al., 2007). 20

41 Um dos passos mais importantes na avaliação clínica de um anticorpo terapêutico potencial é determinar a especificidade in vivo, a biodistribuição do anticorpo (frequentemente radiomarcado) em pacientes para avaliar a relação entre a absorção de anticorpos no tumor e tecidos normais (SCOTT et al., 2003, HERBERTSON et al., 2009, LIGIERO et al.,2013). O anticorpo monoclonal radiomarcado (radioimunoconjugado) tem além do objetivo primário de avaliar a biodistribuição, o objetivo de direcionar partículas radioativas para células tumorais. O iodo 131 ( 131 I) é um radioisótopo comumente empregado; a emissão γ (gama) do 131 I pode ser utilizada para imagem e a (beta) para terapia, porém a liberação de 131 I e 131 I-tirosina livres no sangue representa um risco potencial à saúde, em especial para os cuidadores (GOODMAN & GILMAN, 2010). O ítrio 90 ( 90 Y) representa uma alternativa no caso de tumores com diâmetros maiores. Apresenta também meia-vida curta e permanece conjugado mesmo após endocitose, proporcionando um perfil mais seguro para uso ambiental. Entretanto, as desvantagens consistem na incapacidade de ser utilizado para obtenção de imagem, disponibilidade limitada e custo (GOODMAN & GILMAN, 2010). Os primeiros radioimunoconjugados foram desenvolvidos utilizando anticorpos monoclonais contra CD20, conjugado com 131 I ( 131 I-tositumomabe) e 90 Y ( 90 Y- ibritumomabe tiuxetana) (GOODMAN & GILMAN, 2010). 2.7 Radiofármacos Os radiofármacos são moléculas ligadas a elementos radioativos (radioisótopos ou radionuclídeos) emissores de radiação, utilizados na medicina para terapia e para exames de diagnóstico por imagem em Medicina Nuclear. Os radiofármacos são compostos por dois componentes: carreador (partículas) e radionuclídeo, sendo sua aplicação (diagnóstico ou terapêutico) diretamente relacionada ao radioisótopo utilizado (LIU, 2004). Em 2009, a ANVISA (2009) lançou a primeira resolução (RDC Nº 63/2009) sobre radiofármacos, promulgando os mesmos como: 21

42 Radiofármacos são preparações farmacêuticas com finalidade diagnóstica ou terapêutica que, quando prontas para o uso, contêm um ou mais radionuclídeos Diversos radiofármacos, vem sendo utilizados tanto para o diagnóstico como terapia. No Brasil, há, aproximadamente 40 desses compostos sendo utilizados em Medicina Nuclear, gerando um volume de exames em torno de 3 milhões procedimentos/ano no Brasil (SANTOS-OLIVEIRA, 2010). Os radiofármacos à base de Tecnécio-99m e mais recentemente, a base de Rênio-186 tornaram-se, nos últimos anos, importantes ferramentas para o diagnóstico e terapia de diversas doenças ou disfunções de órgãos e sistemas que compõem o corpo humano (DEWANJEE, 1990, MENDES, 2012). As características do radionuclídeo escolhido serão responsáveis pela aplicação e indicação do radiofármaco. Para aplicações em diagnóstico em Medicina Nuclear utilizam-se radiofármacos que apresentam na sua constituição radioisótopos emissores de radiação gama (γ) ou emissores de pósitrons (β + ) (OLIVEIRA et al., 2006). Assim, após a administração, o radiofármaco penetra nos tecidos (devido ao carreador) e por meio de equipamentos de detecção e imagem pode-se realizar a medida da radiação. Este procedimento permite avaliar a biodistribuição do radiofármaco e localizar os focos onde o mesmo foi mais captado (BOERMAN et al., 2000). O radiofármaco ideal é aquele que atinge o tecido tumoral sem que a radiação atinja o tecido normal (HAMOUDEH et al., 2008). Além disso, um radiofármaco deve ser capaz de permanecer no organismo por um período de tempo curto o bastante para evitar a exposição prolongada do paciente à radiação, mas suficientemente longo para permitir a aquisição e processamento de imagens, assim como desenvolver sua ação terapêutica (quando aplicável). Isso será determinado pela meia-vida efetiva do radiofármaco, que, por sua vez, depende do decaimento físico do radionuclídeo e do tempo de meia-vida biológico do carreador acoplado ao radioisótopo (OLIVEIRA et al., 2006). Sabe-se que a efetividade de um radiofármaco geralmente é determinada pela seletividade pelo tecido doente em relação aos tecidos sadios. De um modo geral, os tumores possuem diferenças no fluxo sanguíneo, no ph, no metabolismo, de modo que os radiofármacos podem fazer uso dessas particularidades para se concentrar seletivamente nos tecidos malignos (SARCINELLI, 2014). 22

43 O radionuclídeo Tecnécio 99 metaestável ( 99m Tc) destaca-se por ser utilizado em 90% dos procedimentos diagnósticos na Medicina Nuclear (SANTOS-OLIVEIRA, 2010). Seu uso extensivo é atribuído às suas características físico-químicas ideais como: meia-vida física de 6,01 h; decaimento por emissão de radiação gama pura, com fótons de 140 kev; praticidade de obtenção a partir do sistema gerador de 99 Mo/ 99m Tc (Molibdênio-99 / Tecnécio-99 metaestável); possibilidade do metal atingir vários estados de oxidação e de coordenação dando origem a diferentes radiofármacos; reconstrução simples por conjuntos reativos liofilizados Kits ; baixo índice de reações adversas (SAHA, 2010). Assim, o 99m Tc é o radionuclídeo apropriado tanto no sentido de permitir a aquisição eficiente da imagem quanto de garantir a segurança do paciente, e o tempo de meia-vida adequado, sendo suficientemente longo para permitir a síntese do radiofármaco, seu controle de qualidade e a aquisição da imagem e curto o suficiente para minimizar a dose ao paciente (MEASE & LAMBERT, 2001, HAMOUDEH et al., 2008). O 99m Tc é eluído em uma solução salina como pertecnetato de sódio (Na 99m TcO 4 ), no qual o estado de oxidação do tecnécio é +7. A redução do 99m Tc +7 é necessária, pois nessa forma ele não se liga a outras moléculas, logo agentes redutores (cloreto estanoso, citrato estanoso, ácido clorídrico concentrado, ditionito de sódio) são necessários (BANERJEE et al., 2005). Assim, o estado de oxidação dependerá do agente de redução e de condições reacionais, assim como do ph e da temperatura (MEASE & LAMBERT, 2001, HAMOUDEH et al., 2008). 2.8 Nanorradiofármacos De modo a melhorar o desempenho dos radiofármacos, em especial quanto à sua penetrabilidade e direcionamento específico, pesquisas em nanotecnologia se tornaram um campo de vasto potencial que vem desenvolvendo micro e nano partículas, com o objetivo de melhorar os resultados da radioterapia e a qualidade do diagnóstico (SANTOS-OLIVEIRA, 2011). O advento do desenvolvimento de radiofármacos em escala nanométrica, chamados nanorradiofármacos, propicia um novo paradigma tanto para a Medicina Nuclear quanto para a Radioproteção e Dosimetria e desponta como alternativa viável 23

44 ao tratamento e diagnóstico de tumores (GARNETT & KALLINTERI, 2006, TING et al., 2010). O desenvolvimento de micro e nano carreadores é de extrema utilidade para controle da distribuição do radiofármaco nos tecidos e células tumorais. Assim, o desenvolvimento de radiofármacos de liberação controlada no alvo correto, garante maior eficiência e diminui os efeitos colaterais e tóxicos. Existem diversos tipos de sistemas de nanopartículas. As nanopartículas de última geração possuem ligantes de superfície de reconhecimento específicos, como anticorpos (monoclonais), ácido fólico e aptâmeros, permitindo o aumento do reconhecimento do tecido tumoral (HAMOUDEH et al., 2008). No campo da oncologia diversos estudos tem sido realizados na incorporação de agentes anticâncer em sistemas nanoestruturados devido à melhora do controle do perfil de distribuição do fármaco nos tecidos e células. Isso se baseia no fato de que esses sistemas promovem uma liberação controlada do fármaco associada a uma distribuição mais seletiva (alvo-específica) de modo a superar as limitações encontradas nos tratamentos convencionais (CHO et al., 2008). Além disso, o uso da nanotecnologia permite a proteção dos radiofármacos de condições desfavoráveis, do microambiente tumoral (ph, oxidação entre outros) e da ação de enzimas, mantendo-os íntegros e impedindo sua degradação prematura, além de aumentar sua biodisponibilidade, seu tempo de retenção e sua captação celular (CHO et al., 2008). Pode-se destacar, ainda, o fato de que as nanopartículas protegem o fármaco contra o reconhecimento por mecanismos de resistência a fármacos, como a resistência mediada pela glicoproteína P, o que culmina em uma maior concentração do fármaco no interior das células cancerosas (CHO et al., 2008). Assim, o uso de sistemas nanoestruturados tem demonstrado melhorar as propriedades farmacológicas, terapêuticas e toxicológicas dos agentes utilizados no tratamento e diagnóstico do câncer (HAMOUDEH et al., 2008, KUMARI et al., 2010, TING et al., 2010). Segundo KIM e colaboradores (2009), as estratégias de sistemas de direcionamento a um alvo são basicamente duas: 1) sinalização passiva, que age em consonância com o efeito de permeabilidade e retenção aumentadas (EPR - Enhanced Permeability and Retention ) e 2) sinalização ativa, que emprega vetores ou ligantes direcionais. O direcionamento passivo é conseguido por meio da incorporação do agente terapêutico em uma macromolécula ou nanopartículas que atinge o órgão alvo de forma 24

45 passiva. Fármacos encapsulados em nanopartículas ou acoplados a macromoléculas podem passivamente chegar aos tumores através do efeito EPR (BLAU et al., 2006, SINGH & LILLARD, 2009). Como resultado do aumento da permeabilidade vascular, partículas poliméricas, micelas ou lipossomas com tamanhos característicos na faixa de 10 a 500 nm e carregados com fármacos anticancerígenos podem levar tais fármacos ao interior dos tecidos afetados (CHO et al., 2008). Em alguns casos, esse efeito pode aumentar a concentração do fármaco encapsulado nos tumores sólidos em 70 vezes (LIECHTY & PEPPAS, 2012). A eficiência desses sistemas é tão maior quanto maior for a capacidade da partícula de prolongar os períodos de circulação sanguínea (CHO et al., 2008). Os nanocarreadores não conseguem penetrar a vasculatura de tecidos saudáveis, cujas fenestrações do endotélio são de aproximadamente 2 a 4 nm. Entretanto, os tecidos tumorais possuem uma deficiência nos vasos linfáticos funcionais e demonstram um aumento de permeabilidade, regulado, parcialmente, pela secreção anormal de i) fator de crescimento do endotélio vascular; ii) bradicinina; iii) óxido nítrico; iv) prostaglandinas; v) metaloproteinases possuem fenestrações maiores (300 a 780 nm) permitindo, assim, a entrada dos nanorradiofármacos na região tumoral (KOO et al., 2005, ALEXIS et al., 2008, CHO et al., 2008, DAVIS et al., 2008). De modo resumido, o que se percebe é que nanopartículas com tamanho médio de 200 nm conseguem entrar nas fenestrações mais largas dos neovasos dos tumores sólidos, mas não conseguem entrar nas fenestrações estreitas dos endotélios dos tecidos normais. O resultado disso é maior acúmulo das nanopartículas com fármaco no tumor com pouca ou nenhuma nanopartícula nos tecidos normais (OLIVEIRA et al., 2012) (Figura 5). 25

46 Figura 5: Representação esquemática do efeito de permeabilidade e retenção aumentada das nanopartículas medicinais em tumores. Os vasos normais estão delimitados por células endoteliais, prevenindo o escape de nanopartículas da corrente sanguínea, enquanto os tecidos tumorais sem células endoteliais íntegras exibem o escape de substâncias e hiperpermeabilidade permitindo acumulação preferencial no espaço intersticial tumoral. Modelo adaptado de Nie e colaboladores (2007). As nanopartículas podem ser administradas por qualquer via devido ao seu tamanho nanométrico, permitindo ainda que sejam injetadas na circulação sanguínea sem riscos à saúde, uma vez que seu tamanho é menor que o diâmetro dos menores capilares (SOPPIMATH et al., 2001, HANS & LOWMAN, 2002). 26

47 2.8.1 Tipos de nanopartículas A estrutura de um nanocarreador, de forma geral, é composta por uma matriz polimérica, uma molécula que reconheça seletivamente e se ligue a receptores nas células alvo e um agente terapêutico ou de diagnóstico. Diversos tipos de carreadores podem ser utilizados dependendo das características desejadas, dentre os quais se destacam as nanopartículas poliméricas (HAMOUDEH et al., 2008). Estas se apresentam como sistemas de distribuição capazes de promover um melhor controle da liberação do fármaco e uma distribuição direcionada no órgão-alvo, alcançando, assim, altas taxas de captação intracelular (MORA-HUERTAS et al., 2010). Sistemas de liberação nanoestruturados poliméricos agem como compartimentos transportadores de substâncias ativas e, apresentam vantagens quando comparados a outros sistemas em particular quanto à estabilidade física, química e biológica, entre outras (MOREIRA, 2013). As nanopartículas poliméricas são sistemas coloidais poliméricos com tamanho entre 10 e 1000 nm, onde o fármaco pode se encontrar dissolvido, recoberto, encapsulado ou disperso. Elas são classificadas em duas categorias, as nanoesferas e as nanocápsulas (Figura 6) (DÉS RIEUX et al., 2006). Figura 6: Representação esquemática de nanocápsulas e nanoesferas poliméricas: a) fármaco dissolvido no núcleo oleoso das nanocápsulas; b) fármaco adsorvido à parede polimérica das nanocápsulas; c) fármaco retido na matriz polimérica das nanoesferas; d) fármaco adsorvido ou disperso molecularmente na matriz polimérica das nanoesferas (SCHAFFAZICK et al., 2003). 27

48 As nanocápsulas constituem os chamados sistemas do tipo reservatório, em que é possível identificar um núcleo oleoso, podendo o fármaco estar dissolvido neste núcleo e/ou adsorvido em um invólucro polimérico, que o isola do meio externo (SILVERSTEIN et al., 1994, SCHAFFAZICK et al., 2003, LIU, 2004). As nanoesferas, que não apresentam óleo em sua composição, são formadas por uma matriz polimérica, onde o fármaco se encontra homogeneamente disperso ou solubilizado. Dessa forma, obtém-se um sistema monolítico, no qual não é possível identificar um núcleo diferenciado (SILVERSTEIN et al., 1994, SCHAFFAZICK et al., 2003, LIU, 2004) Métodos de preparo de nanopartículas Na literatura tem-se descrito diversos métodos para o desenvolvimento de nanopartículas poliméricas, os quais devem ser escolhidos de acordo com as características físico-químicas do ativo e do polímero, de modo a obter um aprisionamento eficiente do fármaco (REIS et al., 2006). Os métodos de preparação de nanopartículas poliméricas, de uma forma geral, são classificados em métodos baseados na polimerização in situ de monômeros dispersos (cianocrilato de alquila) ou na precipitação de polímeros pré-formados (nanoprecipitação), tais como o poli ácido lático (PLA) (SILVERSTEIN et al., 1994). O método da dupla emulsão apresenta-se bastante adequado para a nanoencapsulação de fármacos de caráter hidrofílico. O método consiste na preparação de uma emulsão primária água/óleo (a/o), através da sonicação de um pequeno volume de água contendo o fármaco e um solvente orgânico contendo o polímero. Esta emulsão consiste na fase interna da segunda emulsão, também preparada por sonicação, cuja fase externa é uma solução aquosa do tensoativo. A preparação das formulações de nanopartículas por este método requer a presença de um agente emulsificante para estabilizar a fase dispersa em uma emulsão múltipla. Forma-se, assim, uma emulsão água/óleo/água (a/o/a). Finalmente o solvente é removido por evaporação (SCHAFFAZICK et al., 2003, REIS et al., 2006, KUMARI et al., 2010, PATRICIO et al., 2014). Este método exige uma homogeneização de alta energia (sonicador de ponta ou ultraturrax ) sendo que o tamanho da partícula pode ser controlado pela velocidade e tempo de agitação ou sonicação (REIS et al., 2006, BUDHIAN et al., 2007). 28

49 Conforme as características físico-químicas do fármaco, é possível a escolha do método de preparo que levará a uma associação eficiente e estabilidade satisfatória. O método escolhido deve minimizar a perda de fármaco e garantir sua atividade farmacológica. Além disso, passos pós-preparação, como a avaliação da estabilidade, devem ser sempre investigados (MORAES et al., 2009). 29

50 3 MATERIAIS E MÉTODOS 3.1 Materiais Para realização deste trabalho foram utilizados os materiais descritos a seguir: Poli(ácido lático) (PLA) adquirido da Sigma Aldrich, utilizado na forma de pó, com peso molecular de kda e viscosidade 0,15-0,25; Poli(álcool vinílico) (PVA) adquirido da Sigma Aldrich, utilizado na forma de pó, como grau de hidrólise de aproximadamente 85%; Avastin (Bevacizumabe) comercializado pela Roche, na forma de pó liofilizado injetável, Lote: B6026B02, Validade: 03/2015; Diclorometano adquirido da VETEC, grau de pureza P.A.; Sal de tetrazólio XTT (2,3-bis(2-metiloxi-4-nitro-5-sulfofenil)-2Htetrazólio-5-carboxanilida) adquirido da Sigma Aldrich ; Linhagem celulares fornecidas pelo Departamento de Biofísica Molecular da Universidade de Lodz, Polônia), obitidas a partir da American Type Culture Collection (Rockville, MD, EUA); Linhagem de tumores sólidos: A549 (linha celular de câncer de pulmão de células não pequenas); MCF-7 (células de câncer de mama com expressão de receptores de estrogênio); MDA-MB-231 (células de câncer de mama sem expressão de receptores de estrogênio); HepG2 (linha de células de hepatocarcinoma) Linhagem de células normais: HUVEC-ST (células do endotélio vascular); 30

51 Meio de cultura DMEM (Dulbecco modified Eagle's Minimal Essential Medium - Meio essencial de Eagle Modificado por Dulbecco) fornecidas pelo Departamento de Biofísica Molecular da Universidade de Lodz, Polônia; Meio de cultura OPTI-MEM (meio MEM (Minimum Essential Medium Meio Essesncial Mínimo) contendo tampão HEPES (N-2 Hidroxietil piperazine N - 2 ácidosulfônico etano, ph 7,4)) fornecidas pelo Departamento de Biofísica Molecular da Universidade de Lodz, Polônia; FBS (Fetal Bovine Serum Soro Fetal Bovino) fornecidas pelo Departamento de Biofísica Molecular da Universidade de Lodz, Polônia; Penicilina fornecida pelo Departamento de Biofísica Molecular da Universidade de Lodz, Polônia; Estertomicina fornecida pelo Departamento de Biofísica Molecular da Universidade de Lodz, Polônia; Doxorrubicina fornecida pelo Departamento de Biofísica Molecular da Universidade de Lodz, Polônia; PBS (Phosphate Buffered Saline Tampão Fosfato Salino) fornecido pelo Departamento de Biofísica Molecular da Universidade de Lodz, Polônia; PMS (Metossulfato Phenazine Fenazina Metassulfato) adquirido da Sigma Aldrich, fornecidas pelo Departamento de Biofísica Molecular da Universidade de Lodz, Polônia; SnCl 2 (Cloreto Estanoso) adquirido da Sigma Aldrich ; 99m Tc (Tecnécio 99 metaestável) IPEN/CNEN, fornecido pela Universidade Estadual do Rio de Janeiro (UERJ); Acetona adquirido da Merck, grau de pureza P.A.; Papel de Whatmam nº 1; Ratos Wistar adquiridos do Biotério da Universidade Estadual da Zona 31

52 Oeste (UEZO); Cetamina 10 g / 100 ml, comercializado pela Syntec, Lote: 005/14, Validade: 06/2016; Xilazina 2 g / 100 ml, comercializado pela Syntec, Lote: 003/14, Validade: 04/ Equipamentos No desenvolvimento deste trabalho foram utilizados os seguintes equipamentos: Balança Ay220, Shimadzu; Ultrassonicador (Ultrassonic processor) GEX600, Sigma, St Loius, MO; Rotaevaporador a vácuo Fisatann MFP - 3D-BIO TM ; Ultracentrífuga Beckman, TL-100 ultracentrifugue UMG; Microscópio Eletrônico de Varredura 6490LV, Joel scanning Electron Microscope, JSM; Espectofotômetro de Placa (leitor de placas de microtitulação - Awareness Technology Inc., EUA), fornecida pelo Departamento de Biofísica Molecular da Universidade de Lodz, Polônia; Centrifuga, fornecida pelo Departamento de Biofísica Molecular da Universidade de Lodz, Polônia; Programa estatístico: STATISTICA (StatSoft, Tulsa, OK, EUA), fornecida pelo Departamento de Biofísica Molecular da Universidade de Lodz, Polônia; Calibrador de dose CRC 25R, Capintec; Contador gama Perkin Elmer modelo Wizard

53 3.3 Métodos Obtenção das nanopartículas O método utilizado para a preparação das nanopartículas foi o de dupla emulsificação seguido pela evaporação do solvente, segundo o protocolo descrito por Patricio e colaboradores (2014). Este método pode ser dividido em 4 etapas. 1ª Etapa: Preparação da Emulsão Água/Óleo (a/o): Em 2 ml de diclorometano (CH 2 Cl 2 ) foram dissolvidos 50 mg de ácido poliláctico (PLA). Esta solução foi vertida sobre 200 µl de uma solução aquosa a 2% Bevacizumabe (Avastin ) e 0,1% de álcool poli-vinílico (PVA). Em seguida foi realizado ultrassonicação a 55 W (2 ciclos de 30 segundos com intervalos de 10 segundos de parada) (Ultrassonic processor - GEX600). No final desse processo obtevese uma emulsão a/o (Figura 7). Figura 7: Preparação da Emulsão Água/Óleo (a/o) com 2% de Bevacizumabe. 33

54 2ª Etapa: Preparação da Emulsão Água/Óleo/Água (a/o/a): Em seguida, 4 ml de uma solução aquosa de 0,7% de PVA, foi gotejada sobre a primeira emulsão obtida. Ao término do gotejamento foi realizado a ultrassonicação a 55 W (2 ciclos de 30 segundos com intervalos de 10 segundos de parada), obtendo-se por fim, uma emulsão a/o/a (Figura 8). Figura 8: Preparação da Emulsão Água/Óleo/Água (a/o/a) com 2% de Bevacizumabe. 3ª Etapa: Evaporação do Solvente Orgânico: A emulsão final foi evaporada no rotaevaporador (Fisatann - MFP - 3D-BIO TM ) sob vácuo à temperatura ambiente (aproximadamente 30ºC) durante 20 minutos a 60 rpm para eliminação do excesso de diclorometano (Figura 9). 34

55 Figura 9: Evaporação do Solvente Orgânico da Emulsão Água/Óleo/Água (a/o/a) com 2% de Bevacizumabe. 4ª Etapa: Retirada do Excesso de resíduos: O conteúdo final foi então centrifugado (Beckman TL-100 ultracentrifuge) a x g, 2000 rpm, a 25ºC por 10 minutos. Ao término da ultracentrifugação as nanopartículas foram resuspensas em água purificada e re-centrifugadas mais duas vezes, obtendo-se no fim, nanopartículas a 2% de Bevacizumabe (PLA/PVA/BEVACIZUMABE) (Figura 10). 35

56 Figura 10: Retirada do Excesso de resíduos das nanopartículas de PLA/PVA/BEVACIZUMABE Caracterização morfológica e dimensional das nanopartículas O método de escolha para a caracterização das nanopartículas, Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV), é a técnica de caracterização microestrutural mais versátil, podendo ser realizada em uma escala de dimensões variando de alguns milímetros a frações manométricas (RATNER et al., 2004, DEDAVID et al., 2007). As amostras foram tratadas, recobertas com camada de ouro para observação a 30 kv no MEV (6490LV, JSM). Obteve-se as micrografias com aumento de , e vezes, fornecendo informações sobre a morfologia da superfície e tamanho das nanopartículas. 36

57 3.3.3 Avaliação da citotoxicidade das nanopartículas A fim de avaliar se as nanopartículas produzidas possuem a capacidade de gerar toxicidade às células cancerosas, foi determinado o potencial citotóxico das nanopartículas de PLA/PVA/BEVACIZUMABE pelo método de XTT Linhagem de Células No trabalho foram utilizados células normais do endotélio vascular (HUVEC- ST) e quatro tipos de linhagem de células de tumores sólidos: A549 (células de câncer de pulmão de células não pequenas); MCF-7 (células de câncer de mama com expressão de receptores de estrogênio); MDA-MB-231 (células de câncer de mama sem expressão de receptores de estrogênio); HepG2 (células de hepatocarcinoma). Disponibilizadas pelo Prof. G. Bartosz do Departamento de Biofísica Molecular da Universidade de Lodz, Polônia), obitidas a partir da American Type Culture Collection (Rockville, MD, EUA). As células A549, MCF-7, MDA-MB-231 e HepG2, foram cultivadas com uma monocamada com DMEM (Dulbecco modified Eagle's Minimal Essential Medium - Meio essencial de Eagle Modificado por Dulbecco), enquanto que as células HUVEC- ST foram cultivadas com suplemento de meio OPTI-MEM (meio MEM (Minimum Essential Medium Meio Essencial Mínimo) contendo tampão HEPES (N-2 Hidroxietil piperazine N - 2 ácidosulfônico etano, ph 7,4)) com 10% e 3,5% de FBS (Fetal Bovine Serum Soro Fetal Bovino), respectivamente. Ambos os tipos de meios foram complementados com Penicilina (10 U / ml) e Estreptomicina (50 µg / ml). As células normais e cancerosas foram cultivadas em condições normais: 37 C, 100% de umidade, sendo a atmosfera de 5% de CO 2 e 95% de ar normal. A cada 24 h, o número de células viáveis foi avaliado pelo método de exclusão de azul de tripano. Além disso, as células foram monitorizadas quanto à contaminação por Micoplasma. 37

58 Ensaio de XTT O método XTT (2,3-bis(2-metiloxi-4-nitro-5-sulfofenil)-2H-tetrazólio-5- carboxanilida) mede a atividade mitocondrial, por meio da redução intracelular do sal, formando um composto denominado formazan, que pode ser quantificado pela alteração de cor (laranja para azul). Além disso, é um método simples que utiliza poucos reagentes (SILVA et al., 2008). O sal de XTT foi preparado como uma solução saturada de NaCl (1 mg / ml em PBS (Phosphate Buffered Saline Tampão Fosfato Salino), esterilizado por filtração e guardado a - 20 C. O medidor de elétrons para a reação, PMS (Metossulfato Phenazine - Fenazina metassulfato), foi preparado (50 mm em PBS) e armazenado a - 20 C. Antes de cada ensaio, alíquotas de XTT e PMS foram descongeladas e diluídas em PBS, esterilizada por filtração, para concentrações finais de 0,5 mg / ml e 50 mm, respectivamente. Tem-se uma relação linear entre o número de células e a redução do XTT. As células foram semeadas em número de 10 4 (células A549, MCF-7, MDA- MB231, e HepG2) ou 2,5 x 10 3 (HUVEC-ST) em cada poço com 0,1 ml de meio de cultura. Em poços separados foram adicionados 0,05 ml de Doxorrubicina em diferentes concentrações para controle positivo, incubados junto com as células. Após 72 h de incubação, as células foram centrifugadas (230 g durante 10 minutos a 4ºC), e o meio foi removido. Neste momento, 0,05 ml de XTT a uma concentração final de 0,3 mg / ml em meio foram adicionados a cada poço e as microplacas foram incubadas numa incubadora de CO 2 durante 4 h. A redução de XTT foi medida a 492 nm utilizando um leitor de placas de microtitulação (Awareness Technology Inc., EUA). A percentagem de células viáveis foi calculada por comparação da redução de XTT em células tratadas com Doxorrubicina (células de controle) com as células não tratadas. As nanopartículas de PLA/PVA/BEVACIZUMABE foram testadas em 3 experimentos independentes e o potencial citotóxico foi avaliado segundo uma escala de intensidade de cor. Os resultados obtidos foram expressos como médias ± desvio padrão. A avaliação da normalidade da distribuição das variáveis estudadas foi realizada por um teste de Shapiro-Wilk e homogeneidade de variância foi avaliada com o teste de Levene. A fim de indicar diferenças estatisticamente significativas entre as variáveis 38

59 estudadas, foi realizada uma análise de variância multivariada (ANOVA) e teste de Tukey foi utilizado como análise para comparações múltiplas. Todos os cálculos estatísticos foram realizados pelo programa STATISTICA (StatSoft, Tulsa, OK, EUA), com um valor de p < 0,05 para ser considerado significativo Marcação das nanopartículas com Tecnécio-99m ( 99m Tc) Processo de marcação das nanopartículas pelo método mireto com o Tecnécio-99m ( 99m Tc) O método de escolha para a marcação das nanopartículas de PLA/PVA/BEVACIZUMABE foi o método direto, utilizando o Cloreto Estanoso (SnCl 2 ), como agente redutor, na concentração de 30 µg/ml. Para tal, foi realizada a incubação, por 10 minutos, de 150 µl das nanopartículas de PLA/PVA/BEVACIZUMABE em um tubo de ensaio com 150 µl da solução do agente redutor. Em seguida foi acrescentado 100 µci de pertecnetato de sódio (Na 99m TcO 4 ) e incubação por mais 10 minutos para finalizar o processo de marcação (SA et al., 2012, ALBERNAZ et al., 2014) Controle de qualidade do processo de marcação das nanopartículas com o Tecnécio-99m ( 99m Tc) Como forma de verificar a qualidade da marcação, foi realizada Cromatografia em Papel, utilizando como fase estacionária o papel Whatmam nº 1 (papel em tiras de 14 cm de comprimento por 1 cm de largura) e fase móvel a acetona. Após o processo da cromatografia, as tiras foram cortadas ao meio para separar o topo da origem e foi realizada a leitura das mesmas no contador gama (Perkin Elmer modelo Wizard 2470). 39

60 Por fim, foi calculada a porcentagem de atividade em cada uma das partes das fitas para avaliar o processo de marcação (ALMEIDA et al., 2012, PATRICIO et al., 2013) Estudo de biodistribuição A avaliação da biodistribuição das nanopartículas PLA/PVA/BEVACIZUMABE- 99m Tc, foi realizada em quatro ratos do tipo Wistar, saudáveis, com peso variando entre 250 a 300 g, anestesiados com uma solução a 10% de Cetamina e 2% Xilazina em 50 µl administrada por via intramuscular (coxa). Os nanorradiofármacos (3,7 MBq / 0,2 ml) foram administrados por via intraocular (PINTO et al., 2014) (Figura 11). Após duas horas, os ratos foram eutanasiados em câmara de gás de dióxido de carbono e dissecados para a retirada dos órgãos, de acordo com protocolo aprovado pelo comitê de ética de estudo em animais (ANEXO A). Figura 11: Administração de 200 µl da amostra de nanopartículas de PLA/PVA/BEVACIZUMABE- 99m Tc por via intraocular no rato do tipo Wistar anestesiado. 40

61 A atividade de cada órgão e no sangue foram determinadas pelo contador gama (Perkin Elmer modelo Wizard 2470), com um cristal de NaI(Tl) em condições eletrônicas ótimas para a leitura do radioisótopo 99m Tc. Os resultados foram expressos em dose por órgão (%ID / órgão) e dose por grama de tecido (%ID / g) (SA et al., 2012). Os órgãos avaliados foram: cérebro, pulmão direito, pulmão esquerdo, estômago, baço, intestino delgado, intestino grosso, coração, rim direito, rim esquerdo e fígado. 41

62 4 RESULTADOS E DISCUSSÃO 4.1 Obtenção das nanopartículas As nanopartículas de PLA/PVA/BEVACIZUMABE foram obtidas de modo eficaz pelo método de dupla emulsificação seguido da evaporação do solvente, com o diâmetro de nm e formato esférico. 4.2 Caracterização morfológica e dimensional das nanopartículas Na análise de biodistribuição de fármacos, as características morfológicas, tais como tamanho, forma, estrutura e integridade, são fundamentais por estarem diretamente relacionadas com sua eficácia in vivo e in vitro, logo devem ser avaliadas (SITTERBERG et al., 2010). As imagens topográficas de MEV das nanopartículas de PLA/PVA/BEVACIZUMABE mostraram alta homogeneidade de forma esférica e distribuição estreita de tamanho médio na faixa de 180 a 200 nm (Figura 12). 42

63 (A) (B) (C) Figura 12: Imagens da Nanopartícula de PLA/PVA/BEVACIZUMABE nos aumentos de vezes (A), vezes (B) e vezes (C) no MEV. Essas imagens confirmam que a técnica empregada no estudo para formação de nanopartículas de dupla emulsificação foi eficiente, visto que obteve-se partículas na faixa do nanômetro ( ) de forma esférica. O tamanho adquirido ( nm) é propício à ocorrência do efeito EPR nas células tumorais, em específico nos tumores sólidos, como é o caso do GIST (ALEXIS et al., 2008, CHO et al., 2008, MIRAKABAD et al., 2014). Assim, as nanopartículas, com tamanho de até 200 nm, conseguem entrar nas fenestrações mais largas dos neovasos dos tumores sólidos, mas não conseguem entrar nas fenestrações estreitas dos endotélios dos tecidos normais. Logo, espera-se um acúmulo das nanopartículas no tumor com pouco ou nenhum acúmulo nos tecidos normais. 43

64 4.3 Avaliação da citotoxicidade das nanopartículas A avaliação da toxicidade dos fármacos in vitro é um dos testes, exigidos pelo Guia para condução de estudos não-clínicos de segurança necessários ao desenvolvimento de medicamentos (ANVISA, 2010), para compostos que aspiram ser futuramente, medicamentos comercializados. Outra norma que também exige os testes de citotoxicidade é a ISO (International Organization for Standardization - Organização Internacional para Padronização) (2009), que diz que o ensaio de citotoxicidade in vitro é a etapa primária e imprescindível na caracterização de biocompatibilidade de qualquer biomaterial a ser utilizado como produto para a saúde, ou parte deste; não apenas como critério de exclusão, mas para que seja estabelecido um maior nível de segurança referente à resposta biológica in vivo (ROGERO et al., 2003, ISSO , 2009, FRESHNEY, 2010) Ensaio de XTT A sobrevivência das células normais e cancerosas foi determinada após tratamento com nanopartículas de PLA/PVA/BEVACIZUMABE, utilizando o método colorimétrico com XTT. Na figura 13 tem-se a comparação das várias linhagens celulares expostas a diferentes concentrações das nanopartículas de PLA/PVA/BEVACIZUMABE. Os experimentos foram realizados em triplicata e os resultados estão apresentados como percentual de células viáveis (média ± desvio padrão). 44

65 Viabilidade Celular (%) Concentração das Nanopartículas de PLA/PVA/BEVACIZUMABE (µg/ml) Figura 13: Viabilidade celular (Barras de respostas - %) frente a exposição de células A549, MCF-7, MDA-MB231, HepG2 e HUVEC-ST a diferentes concentrações de Nanopartículas de PLA/PVA/BEVACIZUMABE (µg/ml). (*) P < 0,05. Os valores são a média ± desvio padrão de três experimentos independentes. Analisando os resultados obtidos, observa-se que as nanopartículas de PLA/PVA/BEVACIZUMABE exibiram o efeito citotóxico sobre as células tumorais em algumas das linhagens testadas MDA-MB 231, A549 e MCF-7. No entanto, o efeito foi discreto nas células das linhagens HUVEC-ST e HepG2, tendo um efeito neutro sobre estas células. Até a concentração de 500 mg/ml de nanopartículas de PLA/PVA/BEVACIZUMABE, o efeito citotóxico não foi significativo, pois observa-se poucas alterações na viabilidade celular das linhagens celulares. No entanto, a partir da concentração de 500 µg/ml há uma queda na sobrevivência celular para 80%. Em se tratando do ensaio quantitativo de XTT, os resultados obtidos para as amostras de nanopartículas de PLA/PVA/BEVACIZUMABE reforçam o caráter tóxico das nanopartículas analisadas. Estes dados corroboram com as exigências dos estudos não-clínicos para novos medicamentos de acordo com as agências reguladoras. Assim, viu-se que as nanopartículas têm poder tóxico sobre as células cancerosas e isso corrobora seu uso. 45

66 4.4 Marcação das nanopartículas com o Tecnécio-99m ( 99m Tc) Controle de qualidade do processo de marcação das nanopartículas com o Tecnécio-99m ( 99m Tc) Os resultados do controle de qualidade do processo de marcação das nanopartículas com o 99m Tc estão expressos na Tabela 2: Tabela 2: Contagem dos pedaços da fita no Contador gama com as respectivas porcentagens em cada pedaço. Nanopartículas de PLA/PVA/BEVACIZUMABE 1ª Fita Pedaços da Fita CPM 99m Tc Porcentagem (%) Origem ,30 Topo 19648,05 0,47 Total ,59 100,00 2ª Fita Pedaços da Fita CPM 99m Tc Porcentagem (%) Origem ,58 Topo 15545,58 0,42 Total ,58 100,00 3ª Fita Pedaços da Fita CPM 99m Tc Porcentagem (%) Origem ,65 Topo 11613,48 0,35 Total ,48 100,00 CPM: Contagem Por Minuto De acordo com os dados da Tabela 2, pode-se concluir que na origem ficaram as nanopartículas de PLA/PVA/BEVACIZUMABE marcada com 99m Tc e no Topo o Tecnécio livre ( 99m TcO - 4 ), tendo um rendimento de marcação de 99,51%. Este resultado está de acordo com a literatura, que diz que a quantidade de amostra deve ser suficiente para ligar a pelo menos 90% do 99m Tc esteja ligado ao fármaco, obtendo-se assim uma 46

67 imagem com poucos artefatos (SAHA, 2010, GUIMARÃES et al., 2011, ALMEIDA et al., 2012). 4.5 Estudo de biodistribuição O estudo de biodistribuição das nanopartículas de PLA/PVA/BEVACIZUMABE- 99m Tc foi realizado pelo método clássico de dissecação animal e extração dos diversos órgãos para posterior contagem (Figura 14). Assim, determina-se a porcentagem de acúmulo em órgão e tecidos com relação à atividade injetada, gerando gráficos de biodistribuição dos compostos marcados para diferentes órgãos (MELERO, 2008, SA et al., 2012). Os resultados estão apresentados nas Figuras 15 e 16, expressos em dose por órgão (%ID / órgão) e dose por grama de tecido (%ID / g), respectivamente. 47

68 Figura 14: Rato dissecado após sacrifício em câmara de gás de Dióxido de Carbono para retirada dos órgãos. Figura 15: Biodistribuição das nanopartículas de PLA/PVA/BEVACIZUMABE- 99m Tc após 2 h da administração intraocular em relação à dose injetada em cada órgão e no sangue. 48

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