UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARÁ INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS FACULDADE DE BIOMEDICINA LAINE CELESTINO PINTO

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1 UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARÁ INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS FACULDADE DE BIOMEDICINA LAINE CELESTINO PINTO ANÁLISE DE MUTAÇÕES DE ALTA RESISTÊNCIA AO TRATAMENTO COM MESILATO DE IMATINIBE EM PACIENTES PORTADORES DE LEUCEMIA MIELÓIDE CRÔNICA COM RESPOSTA SUBÓTIMA. BELÉM 2010

2 LAINE CELESTINO PINTO ANÁLISE DE MUTAÇÕES DE ALTA RESISTÊNCIA AO TRATAMENTO COM MESILATO DE IMATINIBE EM PACIENTES PORTADORES DE LEUCEMIA MIELÓIDE CRÔNICA COM RESPOSTA SUBÓTIMA. Trabalho de Conclusão de Curso apresentado à Faculdade de Biomedicina da Universidade Federal do Pará, como requisito parcial para a obtenção do grau de Bacharel em Biomedicina. Orientador: Prof. Dr. José Alexandre Rodrigues de Lemos. BELÉM 2010

3 LAINE CELESTINO PINTO ANÁLISE DE MUTAÇÕES DE ALTA RESISTÊNCIA AO TRATAMENTO COM MESILATO DE IMATINIBE EM PACIENTES PORTADORES DE LEUCEMIA MIELÓIDE CRÔNICA COM RESPOSTA SUBÓTIMA. Belém (PA), 13 de dezembro de Trabalho de Conclusão de Curso apresentado à Faculdade de Biomedicina da Universidade Federal do Pará, como requisito parcial para a obtenção do grau de Bacharel em Biomedicina, aprovado com o conceito. BANCA EXAMINADORA: Prof. Dr. José Alexandre Rodrigues de Lemos (ICB/UFPA) - Orientador Msc. Ana Cristina Simões Beltrão (HOL/FSCMPA) Prof. MSc. Aldemir Branco Filho (UFPA, Campus de Breves) MSc. Caroline de Fátima Aquino Moreira (ICB/UFPA) - Suplente

4 i Em todas as atividades humanas existem esforços e resultados, e a intensidade do esforço é a medida do resultado. O acaso não existe. Dons, potencialidades, bens materiais, intelectuais e espirituais são frutos de esforço; são pensamentos concluídos, alvos atingidos, visões realizadas. (James Allen)

5 ii AGRADECIMENTOS Agradeço primeiramente a Deus, por estar sempre presente em minha vida e tornar tudo possível, dando-me força e saúde para a conclusão de mais uma etapa importante. Agradeço aos meus pais Angela e Gilmar, pela educação que me deram, pela grande dedicação, apoio nas horas mais difíceis e amor incondicional. Graças a eles, eu sempre tive exemplo, força e incentivo para partir em busca do meu crescimento pessoal e profissional. Ao meu irmão Airlan, que mesmo distante, sempre me apoiou ao longo dessa caminhada da graduação. Ao meu namorado Junior Barra, pelo apoio, respeito e companheirismo, por se fazer sempre presente na minha vida e acima de tudo por seu amor. Ao meu orientador, Prof. Dr. Jose Alexandre Lemos, pela oportunidade, orientação e por ter acreditado no meu trabalho. Ao grupo do Laboratório de Biologia Molecular do HEMOPA (GEBIM), funcionários e estagiários, pelos momentos de descontração e pela ajuda. À Msc. Carol Moreira por toda a paciência na hora de ensinar as técnicas, pelos conselhos e idéias, pelo apoio, por estar sempre disposta a ajudar e pela amizade. Muito obrigada por tudo. Aos meus amigos da Biomedicina 2007, em especial, ao grupo PEBBA (Paty, Ellen, Bruno, Breno, Alexandre), Ivy Tsuya e Yasmin Farias pela amizade e por todos os momentos de descontração, viagens, baladas, tornando esses quatro anos inesquecíveis. As minhas amigas, Leila Sawada e Karla Marques, que me aturaram ao longo desses anos. Obrigada pela amizade, apoio e incentivo. Tenho certeza que mesmo o tempo e a distância não separam as verdadeiras amizades. Aos amigos que fiz no Laboratório de Biologia Molecular da UFPA (LABIOMOL), onde comecei a iniciação científica e reafirmei a vontade de fazer pesquisa. Agradeço pela ajuda, apoio e amizade.

6 iii Agradeço a todos os meus amigos, desde a pré-escola até a Universidade, alguns que já perdi contato, pelo carinho e companheirismo. Agradeço aos órgãos de fomento a pesquisa e empresas, que proporcionaram o subsídio financeiro para que a pesquisa fosse realizada. Aos pacientes e familiares que aceitaram participar do projeto de pesquisa e tornaram possível a realização deste trabalho. Por fim, a todos aqueles amigos, colegas e familiares, que contribuíram direta ou indiretamente para realização deste trabalho, dando-me força, incentivo e principalmente acreditando em mim.

7 iv SUMÁRIO LISTA DE FIGURAS E TABELAS... vi LISTA DE ABREVIATURAS... viii RESUMO... x 1. INTRODUÇÃO DEFINIÇÃO EPIDEMIOLOGIA ETIOLOGIA O CROMOSSOMO PHIILADELPHIA ASPECTOS MOLECULARES ASPECTOS CLÍNICOS DIAGNÓSTICO TRATAMENTO E MONITORAMENTO Mesilato de Imatinibe MECANISMOS DE RESISTÊNCIA Outros Inibidores de Tirosina Quinase MUTAÇÕES NO BCR/ABL JUSTIFICATIVA OBJETIVO MATERIAL E MÉTODOS PACIENTES E COLETA DAS AMOSTRAS... 22

8 v 4.2 CRITÉRIO DE FALHA NO TRATAMENTO EXTRAÇÃO DE RNA TRANSCRIÇÃO REVERSA ANÁLISE DAS MUTAÇÕES DE RESISTÊNCIA ASSAYS BY DESIGN A REAÇÃO EM CADEIA DA POLIMERASE (PCR) ALELO ESPECÍFICA EM TEMPO REAL RESULTADOS DISCUSSÃO CONCLUSÕES REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ANEXO I ANEXO II... 47

9 vi LISTA DE FIGURAS E TABELAS Páginas Figura 1 (1) Cariótipo 46XY, t(9,22) (q34;q11) de um paciente com LMC Ph (+); (2) Cromossomo derivado 9 (seta); (3) O cromossomo Ph (seta) um cromossomo 22 encurtado como conseqüência da translocação (DEININGER & DRUKER, 2003)... 4 Figura 2 A translocação t(9;22) (q34;q11) na LMC. O ponto de quebra do gene ABL é localizado na região 5 do éxon a2 na maioria dos casos. Diferentes pontos de quebra foram identificados no gene BCR, tamanhos variados de fragmentos BCR são fusionados com o gene ABL, resultando em diferentes mrna (e1a2, b2a2, b3a2 e e19a2) que são traduzidos em diferentes proteínas (p190, p210 e p230) com pesos moleculares e funções diferentes (FARDEL et al., 1999)... 5 Figura 3 Representação esquemática do mecanismo de ação do imatinibe no domínio tirosina quinase do BCR-ABL. À esquerda, a ligação do ATP ao sítio da proteína tirosina quinase e a fosforilação do substrato, causando a proliferação das células mielóides características da LMC. Á direita, a ligação do imatinibe bloqueando o acesso do ATP e inibindo a fosforilação do substrato (adaptado de MAURO & DRUKER, 2001) Figura 4 À esquerda, esquema demonstrando os principais pontos de mutação e suas frequências (%) no domínio quinase do BCR-ABL. À direita, a estrutura cristalizada ilustrando a ligação do BCR-ABL ao imatinibe (TAUCHI & OHYASHIKI, 2004) Figura 5 Gráfico do PCR em tempo real referente ao SNP T315I(LMC 3)... 30

10 vii Figura 6 Gráfico do PCR em tempo real referente ao SNP Y253H (LMC 3) Figura 7 Gráfico do PCR em tempo real referente ao SNP E255V (LMC 3) Tabela 1 Critérios para a resposta hematológica, citogenética e molecular (BACCARANI et al., 2009) Tabela 2 Sensibilidade das mutações do domínio tirosina quinase do BCR-ABL e a resposta de acordo com os inibidores de tirosina quinase (adaptado de BACCARANI, 2008; HUGUES & BRANFORD, 2009) Tabela 3 Critérios baseados no European LeukemiaNet (ELN) para resposta subótima e falha de resposta em 3, 6, 12 e 18 meses (HUGUES & BRANFORD, 2009) Tabela 4 Reagentes utilizados na síntese de cdna Tabela 5 Pontos de mutação do domínio tirosina quinase do BCR-ABL utilizados no estudo (adaptado de HOUCHAUSS et al., 2002; BACCARANI, 2008) Tabela 6 Reagentes utilizados na PCR alelo específica em tempo real Tabela 7 Perfil de mutações dos pacientes portadores de LMC... 28

11 viii LISTA DE ABREVIATURAS ABL ATP BCR FISH IFNα IC50 IRIS HLA Proto-oncogene de Abelson Adenosina trifosfato Gene breakpoint cluster region Hibridização in situ por fluorescência Interferon alfa 50% da concentração inibitória máxima International Randomized Interferon versus STI571 Antígenos leucocitários humanos MDR1 Multidrug Resistance 1 M-bcr m-bcr mrna LMC Major breakpoint cluster region Minor breakpoint cluster region RNA mensageiro Leucemia Mielóide Crônica OCT1 organic cátion transporter 1 OMS Ph PKC Q-PCR RC RCC RCM Organização Mundial de Saúde Cromossomo Philadelphia Proteína quinase C Reação em Cadeia da Polimerase em tempo real quantitativa Resposta citogenética Resposta citogenética completa Resposta citogenética maior

12 ix RH RHC RHM RM RMM RT-PCR SNP µ-bcr Resposta hematológica Resposta hematológica completa Resposta hematológica maior Resposta molecular Resposta molecular maior Reação em Cadeia da Polimerase usando a enzima Transcriptase Reversa Polimorfismo de nucleotídeo único Micro breakpoint cluster region

13 x RESUMO A Leucemia Mielóide Crônica (LMC) é caracterizada por uma desordem clonal das células tronco hematopoéticas, sendo o evento molecular mais comum a translocação entre os cromossomos 9 e 22 que resulta na junção dos genes BCR e ABL, formando o gene quimérico BCR/ABL. A LMC representa o primeiro câncer humano em que uma terapia molecular produz uma eficiente resposta clínica. Vários grupos de pesquisa identificaram pela primeira vez, pelo menos 13 principais mutações em células leucêmicas de pacientes que desenvolveram resistência ao imatinibe. As mutações no domínio quinase podem prejudicar ou reduzir o efeito do imatinibe e de outros inibidores de tirosina quinase na proteína quimérica BCR/ABL, sendo possível modificar a estratégia clínica em pacientes resistentes ao tratamento que apresentem as mutações. O objetivo deste trabalho foi identificar as mutações presentes em pacientes com LMC que apresentem resposta subótima ao tratamento com mesilato de imatinibe. A investigação de mutações foi baseada em um único polimorfismo (SNP), no qual foram selecionados de acordo com a frequência na literatura: T315I, Y253H, E255V. A presença de mutações do domínio quinase BCR/ABL constitui uma importante ferramenta para o manejo dos pacientes LMC resistentes ao imatinibe, na escolha das terapias de segunda e terceira geração. Nosso estudo revelou que 58 (100%) dos pacientes apresentaram o alelo selvagem para as mutações pesquisadas, sugerindo a não adesão ao tratamento com imatinibe. A não adesão pode ser influenciada pelo sistema de saúde, doença e tratamento e por vários fatores econômicos e sociais. O conhecimento da doença e do tratamento, o grau de escolaridade poderia estar associado ao melhor comportamento de adesão ao tratamento. Estudos indicam que o diagnóstico tardio associado à demora na implantação do tratamento também podem influenciar na resposta subótima. Além disso, existem outros mecanismos que podem ser responsáveis pela resistência ao imatinibe como a ativação da família Src e a ocorrência de evoluções clonais citogenéticas, que precisam ser esclarecidos. Palavras-chave: Leucemia Mielóide Crônica. Mesilato de imatinibe. Mutações.

14 1 1. INTRODUÇÃO 1.1 DEFINIÇÃO A Leucemia Mielóide Crônica (LMC) é uma doença mieloproliferativa que se origina a partir de uma célula hematopoética primordial anormal, resultando em proliferação clonal de células da linhagem granulocítica (REDAELLI et al, 2004; SAWYERS et al, 1999; FADERL et al,1999). Caracteristicamente a LMC apresenta uma marcante hiperplasia na medula óssea e granulocitose no sangue periférico. A doença também é marcada por leucocitose com desvio à esquerda, neutrofilia, basofilia, esplenomegalia, curso clínico trifásico e ainda pela presença do cromossomo Philadelphia (Ph) resultante da translocação recíproca e equilibrada entre os braços longos dos cromossomos (9q34) e (22q11) (TEFFERI et al., 2005). 1.2 EPIDEMIOLOGIA A incidência da LMC é de um a dois casos para cada 100 mil habitantes/ano e representa aproximadamente 15% de todas as leucemias. A mediana de idade ao diagnóstico é de 55 a 60 anos e menos de 10% dos casos ocorrem em pacientes com menos de 20 anos (TEFFERI et al., 2005). Casuísticas nacionais mostram que a mediana de idade do diagnóstico é, no mínimo, dez anos mais baixa que a encontrada na literatura internacional. No estudo da Santa Casa de São Paulo, em pacientes com LMC resistentes ou refratários ao interferon alfa (IFNα), a mediana de idade ao diagnóstico foi de 40 anos (BORTOLHEIRO, 2007). O sexo masculino apresenta uma discreta predominância no desenvolvimento da doença em relação ao sexo feminino: 2:1 e ao que parece não há predisposições geográficas ou étnicas (FRAZER et al., 2007). Em 2005, nos Estados Unidos, estimou-se a ocorrência de 4600 novos casos com 850 mortes. Comparando-se com os dados de 2009, onde o número

15 2 estimado de novos casos foi de 5050 com 470 mortes, observa-se que a sobrevida dos pacientes tem aumentado o que pode ser reflexo dos avanços no tratamento da doença (JEMAL et al., 2005, JEMAL et al., 2009). Segundo Redaelli e colaboradores (2004), a taxa de mortalidade aumenta de acordo com a idade, na população com a faixa etária entre 0 a 14 anos, a taxa de mortalidade é menor que 0,1 por habitantes, na população de 40 anos, a taxa eleva-se para 1,0 por habitantes, na população de 80 anos, a taxa de mortalidade atingiu o valor de 8,0 por habitantes. No Rio Grande do Sul, em um estudo retrospectivo, Fassina (2003) estimou uma incidência de 0,6 casos em habitantes por ano com uma média de idade de 42 anos ao diagnóstico, e uma maior freqüência no sexo masculino, semelhante à descrita na literatura. 1.3 ETIOLOGIA Exposição a altas doses de radiação ionizante pode ser considerada fator de risco. Este fator explica ao aumento na freqüência de pacientes acometidos de LMC, oito anos após as explosões atômicas nas cidades de Hiroshima e Nagasaki. Em Nagasaki, cerca de 30% das leucemias em um período de latência de 3 a 13 anos após a bomba, eram LMC. O risco de desenvolvimento de leucemia nos indivíduos mais próximos ao epicentro da bomba atômica foi significativamente maior. A incidência de LMC também aumentou em pacientes que receberam tratamento com irradiação (HEYSSEL et al., 1960; MOLONEY, 1987). O mecanismo pelo qual o cromossomo Ph é inicialmente formado e o período de tempo até o surgimento dos sinais da doença é desconhecido. Parece não haver predisposição genética ao desenvolvimento da LMC, pois a incidência em filhos de pais leucêmicos ou entre gêmeos monozigóticos não é significantemente diferente da população geral, sugerindo que a LMC seja uma desordem adquirida através de mutações somáticas ocorridas ao longo da vida (CORTES et al., 1996). Uma hipótese para o surgimento da t(9,22) é a proximidade física das regiões cromossomais envolvidas. A distância física entre os genes BCR do cromossomo 22 e ABL do cromossomo 9, principais genes envolvidos na LMC, é curta o que facilitaria a translocação recíproca e a fusão gênica do BCR-ABL responsável pelo caráter maligno da doença (NEVES et al., 1999). Entretanto, a presença de transcritos BCR-ABL em células hematopoéticas não

16 3 é suficiente para causar a leucemia, visto que são detectados raramente no sangue de pessoas saudáveis (BOSE et al., 1998). 1.4 O CROMOSSOMO PHILADELPHIA Em 1845, foram publicadas as primeiras descrições clínicas da LMC combinando detalhes microscópicos precários com as características clínicas observadas em pacientes que, após a morte apresentavam acentuada hepatoesplenomegalia associada com sangue purulento. O médico John Hugues Bennett descreveu a LMC como sendo causada por uma infecção, enquanto o médico Rudolf Virchow relatou a doença como não sendo provocada por infecção, gerando uma controvérsia sobre o descobrimento da doença (GEARY, 2000). O grande avanço no conhecimento da patogênese foi em 1960 quando Nowell e Hungerford, pesquisadores da Philadelphia, descreveram a presença de um pequeno cromossomo acrocêntrico, em culturas de sangue de sete pacientes com LMC. Este achado foi descrito posteriormente por outros pesquisadores, que em consenso, o nomearam cromossomo Ph, em homenagem aos dois pesquisadores. Pensava-se que o cromossomo Ph era um cromossomo 21, porém com a introdução das técnicas de bandeamento cromossômico, este foi identificado como o cromossomo 22, com uma parcial deleção de seu braço longo (Figura 1) (GEARY, 2000). O cromossomo Ph foi o primeiro exemplo de arranjo cromossômico relacionada intimamente com uma neoplasia humana (SANDBERG et al.,1986). Este marcador pode ser encontrado em metáfases de células da medula óssea em aproximadamente 90% dos pacientes diagnosticados com LMC, porém outros 10% dos pacientes com mesmos sintomas clínicos não apresentam tal marcador, sendo denominados, respectivamente Ph (+) e Ph (-) (CLARCKSON et al.,2003). Cerca de um terço dos pacientes Ph (-) são diagnosticados com LMC pela presença do gene BCR-ABL detectado pela técnica de nested RT-PCR (Reação em cadeia da polimerase usando a enzima transcriptase reversa) que é usada para amplificação de uma seqüência interna de um fragmento previamente amplificado, com o objetivo de melhorar a especificidade e a eficiência da reação. Esses pacientes são classificados como Ph (-) BCR- ABL (+) (FADERL et al., 1999). Os pacientes Ph (-) BCR-ABL (-) tem apresentação clínica e hematológica consistente de LMC, embora o critério diagnóstico seja discutido. Tais

17 4 pacientes possuem um mau prognóstico, pois o curso clínico da doença é severo (ONIDA et al., 2002). Figura 1. (1) Cariótipo 46XY, t(9,22) (q34;q11) de um paciente com LMC Ph (+); (2) Cromossomo derivado 9 (seta); (3) O cromossomo Ph (seta) um cromossomo 22 encurtado como conseqüência da translocação (DEININGER & DRUKER, 2003). 1.5 ASPECTOS MOLECULARES Em 1973, foi demonstrado que o cromossomo Ph derivava de uma translocação recíproca, envolvendo os braços longos do cromossomo 9 (9q34) e do cromossomo 22 (22q11) (ROWLEY et al.,1973). O produto gênico desta translocação é uma oncoproteína de massa molecular igual a 210 KDa (p210) designada como BCR-ABL, que possui uma atividade tirosina quinase potencializada e desregulada. Esta atividade desencadeia o potencial leucemogênico da p210 resultando na diferenciação e proliferação das células

18 5 malignas responsável por modificações genéticas adicionais que encaminham a doença para a fase aguda (LUGO et al., 1990; MELO et al., 2003; DEININGER et al., 2000). O gene BCR normal possui três regiões de quebra denominadas: major breakpoint cluster region (M-bcr), minor breakpoint cluster region (m-bcr) e micro breakpoint cluster region (µ-bcr), como podemos observar na Figura 2. Os pontos de quebra do BCR formam três tipos diferentes de proteínas de fusão BCR-ABL: p190, p210 ou p230, responsáveis pelo desenvolvimento, respectivamente, da Leucemia Linfocítica Aguda, da LMC e da Leucemia Neutrofílica Crônica (SAWYERS et al.,1999). Figura 2. A translocação t(9;22) (q34;q11) na LMC. O ponto de quebra do gene ABL é localizado na região 5 do éxon a2 na maioria dos casos. Diferentes pontos de quebra foram identificados no gene BCR, tamanhos variados de fragmentos BCR são fusionados com o gene ABL, resultando em diferentes mrna (e1a2, b2a2, b3a2 e e19a2) que são traduzidos em diferentes proteínas (p190, p210 e p230) com pesos moleculares e funções diferentes. (FARDEL et al., 1999).

19 6 O gene BCR codifica uma proteína de 160 KDa que é constitutivamente expressa em vários tipos celulares sendo mais intensamente expressa em células hematopoiéticas (RANDOLPH, 2005). Embora sua função fisiológica não esteja bem definida, sua estrutura sugere que esteja envolvida na transdução de sinal (MARU & WITTE, 1991). Já o gene ABL é o homólogo humano do oncogene ABL do vírus Abelson da leucemia murina (A-MuLV), normalmente codifica uma proteína de 145 KDa, denominada de p145, que possui atividade tirosina quinase e está envolvida com a regulação do crescimento celular, a indução de apoptose e reparo ao DNA (LUGO et al., 1990; MELO et al., 2003; DEININGER et al., 2000). Na LMC, o ponto de quebra do gene Abl pode ocorrer entre os éxons 1b e 1a ou entre 1a e a2, porém o splicing do RNA mensageiro primário (mrna) faz com que seja sempre o éxon a2 a se ligar a um dos três pontos de quebra do BCR, formando um fragmento ABL de tamanho constante (Figura 2) (FADERL et al., 1999; DEININGER et al., 2000). Na maioria dos pacientes com LMC, o ponto de quebra do gene BCR ocorre no M-bcr. Geralmente, a quebra do M-bcr ocorre dentro dos íntrons localizados entre os éxons b2 e b3 ou b3 e b4, que devido ao splicing alternativo juntam-se ao éxon a2 do ABL, formando os chamados transcritos e13a2 (formalmente b2a2) e e14a2 (formalmente b3a2) (FADERL et al., 1999; DEININGER et al., 2000). Os principais mecanismos de ação oncogênica da proteína BCR-ABL são: a superexpressão do proto-oncogene RAS que leva a um estímulo mitótico anormal e uma desregulada proliferação celular; redução da adesão celular à matriz estromal da medula óssea que permite células progenitoras hematopoéticas permanecer em longa fase proliferativa antes de sofrer diferenciação e uma resposta diminuída a apoptose através da ação sobre as vias ligadas ao proto-ongogene RAS e a STAT5, permitindo uma maior sobrevida da célula maligna (DEININGER et al., 2000). 1.6 ASPECTOS CLÍNICOS A LMC se caracteriza por três fases distintas: fase crônica, fase acelerada, e crise blástica. A fase crônica dura vários anos e é caracterizada por um aumento de precursores mielóides e células maduras na medula óssea, sangue periférico e células extra-medulares. A fase acelerada dura de quatro a seis meses e é caracterizado por agravamento da doença e

20 7 aumento das células progenitoras em relação às células diferenciadas. A fase conhecida como crise blástica dura poucos meses e se caracteriza por rápida expansão das células blásticas mielóides ou linfóides diferenciadas (CALABRETTA et al, 2004). Aproximadamente 85% dos pacientes com LMC são diagnosticados na fase crônica e até 40% destes são assintomáticos. Os achados clínicos incluem fadiga, fraqueza, perda do apetite, febre, perda de peso, sudorese noturna, aumento do baço e/ou fígado, infecções freqüentes, sangramento, púrpuras. As alterações laboratoriais mais freqüentes são diminuição ou aumento na contagem de plaquetas, aumento na contagem de leucócitos (REDAELLI et al, 2004). A fase crônica é definida pelo estudo International Randomized Interferon versus STI571 (IRIS) na qual a contagem no sangue periférico e na medula óssea corresponde a menos que 15% de blastos, menos que 20% de basófilos e menos que 30% de blastos + promielócitos com o cromossomo Ph (O BRIEN et al., 2003). Esta é uma fase de fácil controle terapêutico, com uma sobrevida média de três a seis anos em terapia convencional (FADERL et al., 1999). A fase acelerada da LMC caracteriza-se por progressiva resistência à terapêutica, aumento da esplenomegalia, da basofilia e do número de células blásticas, trombocitose ou trombocitopenia, mielofibrose e evolução clonal citogenética. Nesta fase os pacientes podem estar assintomáticos ou apresentar febre, sudorese noturna, perda de peso e dores ósseas (PASQUINI, 2001). A fase acelerada tem sido definida por diferentes grupos médicos. O critério do M.D. Anderson Câncer Center define a fase blástica quando se observa contagem dos blastos maior e igual a 15%, percentagem de promielócitos maior que 30%, percentagem de basófilos maior que 20%, contagem de plaquetas menor que e evolução clonal positiva (REDAELLI et al, 2004). Segundo os critérios do International Bone Marrow Transplant Registry (IBMTR) a fase acelerada deve ser diagnosticada quando a percentagem de blastos é superior igual ou maior que 10%, percentagem de promielócitos igual ou maior que 20%, basófilos igual ou maior que 20%, contagem de plaquetas com diminuição persistente, evolução clonal positiva, contagem de leucócitos de difícil controle ou duplicando em menos de cinco dias, anemia refratária, esplenomegalia progressiva, presença de cloromas e mieolofibrose (REDAELLI et al, 2004). Os critérios da Organização Mundial de Saúde (OMS) são: percentagem de blastos de 10% a 19% e de basófilos igual ou maior que 20%, contagem de plaquetas

21 8 refratária e inferior ou superior a , evolução clonagem positiva, proliferação de megacariócitos e fibrose (REDAELLI et al, 2004). A fase blástica é caracterizada por um número de células blásticas superior a 30% na medula óssea ou sangue periférico. Estas células imaturas são mieloblastos em 50% dos casos, linfoblastos em 25% e no restante são células indiferenciadas ou bifenotípicas. Nesta fase é comum a presença de febre, sudorese noturna, anorexia, perda de peso e dores ósseas. A esplenomegalia aumenta e a infiltração extramedular pode estar presente, particularmente nos linfonodos, pele, ossos, e sistema nervoso central (PASQUINI, 2001). A crise blástica como manifestação inicial da LMC é incomum e deve-se procurar diferenciá-la das leucemias mielóides e linfóides agudas, pois as estratégias terapêuticas são diferentes para cada uma delas (PASQUINI, 2001). 1.7 DIAGNÓSTICO Cerca de 50% dos casos são assintomáticos, sendo diagnosticados ao acaso através de exames de rotina (FADERL et al., 1999). Os exames laboratoriais realizados em caso de suspeita clínica são hemograma completo, aspiração e biopsia da medula óssea e outros testes complementares. O hemograma mostra leucocitose acima de /mm³ (25 x 10 9 /L) freqüentemente excedendo /mm³ (100 x 10 9 /L) com aproximadamente 20% de formas mielóides imaturas, porém menos de 15% de blastos no sangue periférico e medula óssea (CORTES et al., 1996; HILL et al., 1999). É característico o aumento de eosinófilos e basófilos e pode ocorrer trombocitose. A medula óssea é hipercelular com hiperplasia granular e megacariocítica. Os níveis de ácido úrico e lactato desidrogenase estão geralmente aumentados, refletindo um aumento da lise de células malignas e a fosfatase alcalina leucocitária fica próxima de zero (CORTES et al., 1996; HILL et al., 1999). Os pacientes onde o hemograma, a contagem de plaquetas, o mielograma, outros testes laboratoriais e os achados físicos sugerem uma desordem mieloproliferativa crônica é realizado a confirmação pelo cariótipo da medula óssea que demonstra a presença do cromossomo Ph em células em metáfase (SINCLAIR et al., 2000). Se a coleta de medula óssea não for possível ou a análise cariotípica for prejudicada, a hibridização in situ por fluorescência (FISH) em amostra de sangue periférico

22 9 pode ser alternativa. A confirmação do diagnóstico também pode ser feita pela detecção dos transcritos b2a2 ou b3a2 do gene BCR-ABL através da técnica qualitativa de Reação em Cadeia da Polimerase usando a enzima Transcriptase Reversa (RT-PCR) que pode ser realizada em amostra de sangue periférico (SINCLAIR et al., 2000). 1.8 TRATAMENTO E MONITORAMENTO A primeira terapia efetiva no tratamento da LMC foi o arsênico e foi administrado em Em 1912 foi introduzido benzeno associado à radioterapia e em 1953 o bussulfan, um agente alquilante, foi introduzido dando início à era moderna da quimioterapia no tratamento da LMC. O uso do bussulfan com 6-tioguanina resultou em melhora da sobrevida e tornou o tratamento padrão durante 35 anos, até a introdução do IFNα (REDAELLI et al, 2004). O IFNα além de aumentar a sobrevida induziu ao desaparecimento do cromossomo Ph e reduziu a progressão para crise blástica. A partir de 1986, o transplante de medula óssea tornou o tratamento padrão para pacientes com LMC (RANDOLPH, 2005). Apenas o transplante de medula óssea ou de célula mãe demonstrou ser capaz de erradicar o cromossomo Ph (REDAELLI et al, 2004). Entretanto, o uso do transplante é limitado à disponibilidade de doadores e a alta toxicidade do procedimento nos pacientes idosos. Avanços tais como maior precisão na tipagem molecular dos antígenos leucocitários humanos (HLA) dos doadores, regimes menos tóxicos estão melhorando os resultados e ampliando a indicação dos transplantes (RADICH et al, 2004). Evidências clínicas indicam que os pacientes com LMC submetidos ao tratamento com mesilato de imatinibe podem ser monitorados com o objetivo de avaliar a resposta, eficácia da terapia e possíveis recaídas. Existem três tipos diferentes de respostas na LMC: (1) Resposta Hematológica (RH), (2) Resposta citogenética (RC), (3) Resposta molecular (RM) (Tabela 1). A Resposta Hematológica Completa (RHC) é definida por uma normalização da contagem de células no sangue e do tamanho do baço e pode ser avaliada a cada três meses (O BRIEN et al., 2009). O monitoramento citogenético é determinado pelo aumento do número de células em metáfase Ph (+) detectado através de aspiração da medula óssea por técnicas citogenéticas (O BRIEN et al., 2009). A Resposta Citogenética Maior (RCM) é atingida quando metáfases

23 10 Ph (+) são presentes 0-35% de células. Em contraste, a ausência de células em metáfase Ph (+) leva a Resposta Citogenética Completa (RCC) (BACCARANI et al., 2009). A técnica de FISH que analisa um grande número de células (mais que 200) pode ser usada ao em vez da citogenética convencional para quantificar células Ph (+). No entanto, um significante número de resultados falso positivos limita o uso do FISH e recomenda a correlação com a avaliação convencional (BACCARANI et al., 2009). As recentes recomendações da European LeukemiaNet (ELN) uma organização de médicos, cientistas e pacientes com interesse em melhorar o tratamento e o conhecimento da leucemia na Europa sugerem a realização de testes citogenéticos nos primeiros 3 a 6 meses e após 6 meses a RCC ser atingida (BACCARANI et al., 2009). Tabela 1. Critérios para a resposta hematológica, citogenética e molecular (BACCARANI et al., 2009). Resposta Critério Hematológica completa (RHC) - Completa normalização da contagem no sangue periférico. - Células brancas < L 1 - Plaquetas < L 1 - Sem células imaturas - Sem esplenomegalia Parcial - Semelhante a RHC, exceto a persistência de células imaturas - Plaquetas < 50% da contagem pré-tratamento, porém > L 1 - Esplenomegalia < 50% pré-tratamento, mas persistente Citogenética completa (RCC) - Sem metáfases Ph (+) Maior (RCM) % metáfases Ph (+) (completa + parcial) Parcial % metáfases Ph (+) Menor % metáfases Ph (+) Molecular completa (RMC) - mrna do BCR-ABL não é detectável por RT-PCR Maior (RMM) - 3-log redução do mrna do BCR-ABL

24 11 A resposta molecular é determinada por uma diminuição na quantidade de mrna do BCR-ABL. A Resposta Molecular Completa (RMC) é atingida quando o mrna do gene quimérico BCR-ABL não é detectável por meio da técnica de PCR em tempo real. A Resposta Molecular Maior (RMM) é definida pela redução de 3 logs no nível de BCR-ABL quando comparadas com a média do nível de pré-tratamento (O BRIEN et al., 2009). Hugues e colaboradores (2003) introduziram essas definições durante o monitoramento da resposta ao imatinibe no estudo IRIS, em pacientes com LMC previamente não tratados. Para normalizar os resultados obtidos em três laboratórios geograficamente dispersos foram mensuradas reduções nos transcritos BCR-ABL, os investigadores definiram o conceito de redução de 10 logs como o padrão para pacientes não tratados. Consequentemente foi deduzido que os pacientes tratados com imatinibe apresentaram menos que 3 logs de redução no nível dos transcritos com o risco de progressão doença nos subseqüente 12 meses (HUGHES et al., 2003). Para tal, a metodologia de PCR em tempo real é provavelmente mais sensível podendo detectar uma célula leucêmica em mais de células normais. Outras técnicas também são utilizadas como a PCR quantitativa em tempo real (Q-PCR) que mensura a atual percentagem de transcritos e mostra a significante correlação entre os resultados obtidos no sangue periférico e na medula óssea (HUGHES et al., 2006). Os estudos moleculares apresentam vantagens como: boa correlação entre os níveis de resposta na medula óssea e no sangue periférico e a detecção da doença residual mínima. As limitações incluem a incidência substancial de testes falsos negativos devido à degradação do RNA, e baixa sensibilidade a uma dada sonda, o coeficiente de variabilidade que pode ser maior que 0,5 log e a pobre reprodutibilidade dos resultados (KANTARJIAN et al., 2008) Mesilato de imatinibe No fim dos anos 80, cientistas da Ciba Geigy (atualmente Novartis), sob a direção de N. Lydon e A. Matter iniciaram vários projetos para a identificação de compostos capazes de inibir a atividade de proteínas quinases. Em um desses projetos que tinha como alvo a proteína quinase C (PKC) foi identificado um composto derivado de 2-fenilaminopirimidina. Este composto apresentava baixa potência e especialidade, inibindo tanto serina/treonina

25 12 quanto tirosina quinases, porém a partir deste ponto uma série de compostos derivados foi sintetizada (DEININGER et al., 2005). A atividade da molécula 2-fenilaminopirimidina foi otimizada através de modificações em sua estrutura química, aumentando a atividade de inibição à tirosina quinases. A partir disso surge o mesilato de imatinibe que foi identificado como um composto promissor para o uso clínico (BUCHDUNGER et al., 2001). Em 2001, baseado em estudos clínicos randomizados de fase I e II, o U.S Food and Drug Administration aprovou o seu uso e em 2003 o aprovou como terapia de primeira linha para LMC em fase crônica (SAWYERS et al., 2002). A LMC representa o primeiro câncer humano em que uma terapia molecular produz uma eficiente resposta clínica (HOLTZ et al., 2002). O mesilato de imatinibe, anteriormente conhecido como STI571 (Signal Transduction Inhibitor 571) e comercialmente como Glivec é uma droga que foi designada a inibir, seletivamente, certas proteínas tirosina quinase envolvidas no processo de oncogênese (GUILHOT, 2004). A droga atua ocupando o sítio quinase na proteína BCR-ABL e bloqueia o acesso do ATP, mantendo-a em uma conformação inativa (Figura 3), inibindo a capacidade da proteína BCR-ABL fosforilar resíduos de tirosina na proteína substrato, resultando na modulação de vário genes envolvidos no controle do ciclo celular, na adesão celular à matriz estromal da medula óssea e na apoptose (SAVAGE & ANTMAN, 2002). Originalmente achava-se que o imatinibe era um inibidor competitivo do sítio de ligação do ATP na proteína oncogênica BCR/ABL. Entretanto, estudos posteriores demonstraram que o imatinibe se liga e estabiliza a quinase do BCR/ABL em sua forma inativa ao invés de competir com o ATP pela ligação ao sítio (SCHINDLER et al., 2000). Em pacientes recém-diagnosticados em fase crônica, o tratamento com mesilato de imatinibe em primeira linha resulta numa alta taxa de RH de 98%, RCC de 87% e de sobrevida global de 89% em 60 meses. A taxa de progressão anual é cerca de 4% no total, incluindo perda de RH e RC, sendo que 2% dos pacientes evoluem para fase acelerada ou crise blástica. As taxas de progressão caem com o tempo, mas, de um modo geral, podemos dizer que, apesar dos excelentes resultados, cerca de 15% vão apresentar alguma forma de resistência ao tratamento (DRUKER et al., 2006).

26 13 Figura 3. Representação esquemática do mecanismo de ação do imatinibe no domínio tirosina quinase do BCR-ABL. À esquerda, a ligação do ATP ao sítio da proteína tirosina quinase e a fosforilação do substrato, causando a proliferação das células mielóides características da LMC. Á direita, a ligação do imatinibe bloqueando o acesso do ATP e inibindo a fosforilação do substrato (adaptado de MAURO & DRUKER, 2001). 1.9 MECANISMOS DE RESISTÊNCIA A resistência ao imatinibe pode ser definida de acordo como momento em que ocorre. A resistência primária ocorre quando a droga é ineficaz desde o início do tratamento e pode ser definida como uma falha do paciente em atingir a resposta hematológica ou citogenética significativa, enquanto a resistência secundária é o resssurgimento progressivo do clone leucêmico após uma resposta inicial à droga. A resistência também pode ser definida nos critérios clínicos e laboratoriais para avaliação da LMC, que incluem RH, RC e RM (HUGHES et al., 2006). Os critérios para definição de falha de tratamento e resposta subótima foram publicados pelo grupo de especialistas do ELN baseado nos resultados do estudo IRIS. Muitos

27 14 dos conceitos provavelmente sofrerão alterações, em face dos resultados obtidos com os novos inibidores (BACCARANI et al., 2006). Os critérios atuais definem como falha de tratamento a ausência de alguma RH aos três meses, ausência de RHC ou qualquer RC aos seis meses, ausência de RCM aos 12 meses e RCC aos 18 meses, além de perda da RH e RCC e mutações com alto grau de insensibilidade ao imatinibe. Nesses casos, deve ser feita alguma intervenção terapêutica, como aumento de dose, mudança para outro inibidor ou encaminhamento para transplante de medula óssea (BACCARANI et al., 2006). Resposta subótima foi definida como falha em atingir RH completa aos três meses de tratamento, ausência de RC parcial aos seis meses e ausência de RCC aos 12 meses, ausência de RM maior aos 18 meses, evolução clonal, perda da RMM e mutações com baixo grau de insensibilidade ao imatinibe. No caso de resposta subótima, o paciente provavelmente não se beneficiaria com imatinibe em longo prazo e poderia ser tentado aumento de dose ou tratamento com outro inibidor (BACCARANI et al., 2006). Em geral, os mecanismos de resistência ao imatinibe podem ser subdivididos em BCR-ABL independente e BCR-ABL dependente. Na primeira categoria as células leucêmicas não dependem mais do BCR-ABL para dirigir sua capacidade proliferativa, elas entram em divisão em conseqüência de mudanças secundárias em seus próprios oncogenes (TAUCHI & OHYASHIKI, 2004). Os mecanismos independentes do BCR-ABL incluem a ligação do mesilato à α1- glicoproteína ácida, o aumento da expressão das bombas de efluxo de drogas e a baixa expressão dos transportadores de influxo de drogas. Os mecanismos dependentes do BCR- ABL são o aumento da expressão da proteína BCR-ABL devido à amplicação gênica e as mutações no domínio tirosina quinase (MELO & CHUAH, 2007). A concentração plasmática do mesilato depende da metabolização da droga pelo sistema do citocromo P450 (CYP3A4 e CYP3A5), e pode ser aumentada ou diminuída por alguns medicamentos (MARIN et al., 2002). A entrada do imatinibe no interior das células é mediada por uma proteína denominada organic cátion transporter 1 (OCT1), cujos níveis variam de paciente para paciente (THOMAS et al., 2004). A atividade de influxo da OCT1 e a capacidade de retenção do imatinibe têm impacto nos níveis séricos e na resposta terapêutica (WHITE et al., 2007). Entre os pacientes que apresentam alta atividade dessa bomba, 85% atingem resposta molecular maior aos 24 meses de imatinibe, enquanto nos pacientes com baixa atividade, essa resposta é de 45%. Os pacientes com baixa atividade são os que mais se

28 15 beneficiam com altas doses de imatinibe. Outra evidência são os resultados com altas doses de imatinibe, que levam a uma maior taxa de RC (KANTARJIAN et al., 2004). Outros mecanismos conhecidos incluem a superprodução da proteína BCR-ABL decorrente de amplificação gênica, aparecimento de cromossomos Ph adicionais ou outras modificações cromossômicas além do cromossomo Ph (evolução clonal) (GORRE et al., 2001; HOCHHAUS et al., 2002). A evolução clonal está associada a um risco maior de transformação para fases avançadas. Já alterações clonais nas células Ph negativas não têm impacto negativo, e o tratamento não deve ser modificado se não houver evidência de mielodisplasia (DEININGER et al., 2005). O aumento de expressão da Multidrug Resistance 1 (MDR1) foi observado em linhagens celulares resistentes a imatinibe e foi parcialmente revertido com verapamil, um inibidor da glicoproteína P. Outros estudos avaliaram o papel da glicoproteína P e mostraram que a expressão da MDR1 confere resistência (MAHON et al., 2003; WIDMER et al., 2003). Há outros mecanismos independentes do BCR-ABL, como expressão da LYN quinase e da família da SRC (DAI et al., 2004) Outros inibidores de tirosina quinase Atualmente, outros inibidores de tirosina quinase, chamados de segunda geração foram sintetizados em resposta aos casos de resistência e intolerância de alguns pacientes ao tratamento com o imatinibe. Os inibidores de segunda geração existentes hoje são comercialmente conhecidos como: Dasatinib (Sprycel da empresa Bristol-Myers Squibb), Nilotinib, Tasigna (empresa Novartis Pharma) (BACCARANI et al., 2008). Os novos inibidores de tirosina quinase foram desenvolvidos baseados na estrutura cristalizada do complexo imatinibe-abl. O nilotinibe é uma droga com atuação similar ao imatinibe, à medida que se liga a conformação inativa da quinase do ABL e bloqueia o substrato do sítio de ligação proximal da alça de ativação, resultando na inibição da atividade catalítica da ATPase. Os estudos cristalográficos indicam que o nilotinibe tem uma alta afinidade pelo domínio quinase do BCR-ABL quando comparada com o imatinibe (WEISBERG et al., 2005; MANLEY et al., 2005; O HARE et al., 2005). O nilotinibe é efetivo contra 32 de 33 pontos de mutações resistentes ao imatinibe, mas não apresenta significante atividade contra a mutação T315I. De fato, esta

29 16 droga mostrou-se efetiva no prolongamento da sobrevida em modelos de camundongos LMC resistentes ao imatinibe. O nilotinibe também inibe a atividade do receptor transmembranar de tirosina quinase (KIT) e do receptor do fator de crescimento derivado de plaquetas (PDGFR), mas não inibe a atividade da família SRC quinase (WEISBERG et al., 2006; GOLAS et al., 2005). O dasatinibe é um inibidor ATP competitivo não baseado na fenilaminopirimidina, sendo responsável por inibir tirosinas quinases do BCR-ABL. A droga foi desenvolvida para inibir a família SRC quinase e inibe tanto a conformação ativa como a inativa do domínio ABL. Estudos in vitro também mostraram a sua eficácia inibindo as variantes do BCR-ABL e mutantes com altos níveis de resistência ao imatinibe, exceto a T315I (KIMURA et al., 2005; SHAH et al., 2004). O dasatinibe também inibe outras vias tirosina quinase incluindo a SRC, LCK (proteína tirosina quinase linfócito específica), YES (Yamaguchi sarcoma homólogo), EPHA2 (ephrin tipo A receptor 2) e PDGFRβ (receptor do fator de crescimento derivado de plaquetas beta), através da autofosforilação de vias adicionais que podem estar envolvidas em mutações de pacientes LMC resistentes e intolerantes ao imatinibe (QUINTAS-CARDAMA et al., 2007; O HARE et al., 2005; KVASNICKA et al., 2004) MUTAÇÕES NO BCR-ABL As mutações podem ser categorizadas em quatro grupos: (1) mutações que impedem diretamente a ligação do imatinibe; (2) mutações que ocorrem no sítio de ligação do ATP; (3) mutações que ocorrem na alça de ativação e (4) mutações que ocorrem no domínio catalítico (Figura 4) (MELO & CHUAH, 2007). As mutações do dominio tirosina quinase do gene BCR-ABL constituem a principal causa de resistência ao tratamento com inibidores seletivos de tirosina quinase. (BACCARANI et al., 2006). Vários grupos de pesquisa identificaram, pela primeira vez, pelo menos 13 principais mutações em células leucêmicas de pacientes que desenvolveram resistência ao imatinibe (GAMBACORTI-PASSERINI et al., 2003; VON BUBNOFF et al., 2002; HOFMANN et al., 2002; BRANFORD et al., 2002; ROCHE-LESTIENNE et al.,2002; CORBIN et al., 2003; BRANFORD et al., 2003).

30 17 Figura 4. À esquerda, esquema demonstrando os principais pontos de mutação e suas frequências (%) no domínio quinase do BCR-ABL. À direita, a estrutura cristalizada ilustrando a ligação do BCR-ABL ao imatinibe (TAUCHI & OHYASHIKI, 2004). Estas mutações no domínio quinase podem prejudicar ou reduzir o efeito do imatinibe e de outros inibidores de tirosina quinase na proteína quimérica BCR-ABL, que é o principal alvo desses inibidores nas células (Ph+) (BACCARANI et al., 2008). Atualmente, se tem são pelo menos 73 mutações que levam a quase 50 substituições de aminoácidos na LMC resistente ao imatinibe. A pesquisa de mutações deve ser realizada nos casos de resposta subótima, de falha no tratamento e aumento dos transcritos BCR-ABL, conforme recomendações da LeukemiaNet. Esta análise pode identificar quais as mutações estão relacionadas à resistência clínica, podendo auxiliar no planejamento do tratamento (BACCARANI et al., 2008). Dependendo da sensibilidade ao determinado inibidor de tirosina quinase, que pode ser avaliado através da concentração inibitória (IC 50), um índice que avalia o quanto a droga é capaz de inibir a linhagem mutante. Quanto maior o IC 50, mais medicamento é necessário para inibir a tirosina quinase e, portanto, mais resistente é a mutação (KHORASHAD et al., 2008; SOVERINI et al., 2007; SHAH et al., 2007).

31 18 Mutações com baixo grau de insensibilidade ao imatinibe (M244V, M351T e F359V) podem responder ao aumento de dose. Mutações com alto grau de insensibilidade (Y253F, E255K/V) necessitam mudança no tratamento (Tabela 2). A mutação T315I é resistente ao imatinibe e aos outros inibidores de segunda e terceira geração, é freqüentemente identificada em pacientes não responsivos ou com perda de resposta aos novos inibidores, devido à seleção de clones resistentes (KHORASHAD et al., 2008; SOVERINI et al., 2007; SHAH et al., 2007). Mutações que ocorrem em sítios de contato com imatinibe eliminam pontes de hidrogênio críticas para a ligação. Outras que ocorrem na alça de fosfato impedem que a quinase assuma uma conformação adequada para a ligação do imatinibe e, por fim, aquelas da alça de ativação estabilizam uma forma ativa, inacessível para o imatinibe. As mutações são mais freqüentes na resistência secundária do que primária (57% versus 30%) e também nas fases avançadas (80% na fase blástica versus 14% na fase crônica) (SOVERINI et al., 2006). Tabela 2. Sensibilidade das mutações do domínio tirosina quinase do BCR-ABL e a resposta de acordo com os inibidores de tirosina quinase (adaptado de BACCARANI, 2008; HUGUES & BRANFORD, 2009). Mutações Imatinib (nm) (Nilotinib nm) (Dasatinib nm) T315I* E255K*/ E255V Y253F/ Y253H* Q252H M244V T315A Outras mutações Ausência de sensibilidade, Sensibilidade intermediária, Sensível

32 19 2. JUSTIFICATIVA A presença de mutações no domínio tirosina quinase do BCR-ABL é um dos principais mecanismos envolvidos na resistência clínica ao imatinibe (GORRE et al, 2001; BRANDFORD et al, 2002; VON BUBNOFF et al, 2002). A detecção destas mutações é um importante parâmetro na definição da causa da resistência, contribuindo para o direcionamento do tratamento. A resistência clínica ao imatinibe é mais comum nos pacientes com fases mais avançadas, e ocorre dentro de três a seis meses após o início do tratamento em mais de 70% dos pacientes (SAWYERS et al., 2002). Após dois anos de tratamento, a resistência ao imatinibe acomete 10% dos pacientes em fase crônica, na qual poucos apresentam recaídas após a resposta citogenética completa, atinge 50% dos pacientes em fase acelerada e 61% em crise blástica que recaem após resposta hematológica inicial (GAMBACORTI-PASSERINI, 2003). Em resposta aos casos de resistência e intolerância ao imatinibe foram sintetizados outros inibidores de tirosina quinase, chamados de segunda geração que têm demonstrado melhor desempenho contra as mutações de resistência do que o imatinibe (BACCARANI et al., 2008). Neste contexto, já se realiza uma medida prática da sensibilidade de uma dada mutação a um inibidor de tirosina quinase, sendo importante no manejo clínico destes pacientes. Atualmente, existe apenas um artigo publicado, por autor brasileiro, sobre detecção de mutações, porém este não as discrimina e não deixa claro quais as mutações mais envolvidas e qual seria o impacto clínico dessas mutações nos pacientes com LMC que estão em uso de Glivec (ALVES, 2009). Em Belém, os pacientes atendidos pelo Hospital Ophir Loyola não recebiam o imatinibe como droga de primeira linha até junho/2008 após a publicação da Portaria Nº 347 pelo Ministério da Saúde, a maior parte deles começam o tratamento com outras drogas tais como Hidroxiuréia ou IFNα para correção primária dos desvios hematológicos. Segundo Scerni e colaboradores (2009) do diagnóstico ao começo do tratamento com imatinibe os pacientes levam uma média de 14 meses, podendo chegar até 90 meses, aumentando estatisticamente o risco desses pacientes desenvolverem algum tipo de resistência ocasionado pela demora na implantação do protocolo de tratamento, como demonstrado pelo estudo. Neste estudo mesmo estudo, observou-se que pacientes em fase crônica que

33 20 receberam o imatinibe no intervalo máximo de um ano do diagnóstico ao inicio do tratamento, tem uma maior probabilidade de manter uma RMM em comparação com outros pacientes cujo intervalo do diagnóstico e inicio do tratamento foi maior que um ano (SCERNI et al. 2009). Em suma, além da importância prognóstica, a detecção de novas mutações do domínio tirosina quinase do BCR-ABL que possam estar relacionadas com o desenvolvimento da resistência à droga pode ser útil no desenvolvimento de novas terapêuticas para os casos resistentes e auxiliar no desenho de terapias com múltiplas drogas que previnam a emergência de clones resistentes.

34 21 3. OBJETIVO Esta proposta tem como objetivo identificar as mutações presentes no domínio quinase da proteína quimérica BCR-ABL responsáveis por causar resistência em pacientes portadores de LMC, que apresentem resposta subótima ao tratamento com imatinibe. Para tal, foram selecionadas três mutações mais freqüentes descritas na literatura: T315I, E255V e Y253H.

35 22 4. MATERIAL E MÉTODOS 4.1 PACIENTES E COLETA DAS AMOSTRAS O estudo incluiu 58 pacientes diagnosticados como portadores de LMC, que são tratados regularmente com 400 a 800 mg de imatinibe no Hospital Ophir Loyola (Belém-PA) e são atendidos na Fundação HEMOPA para monitoramento molecular do BCR-ABL. Todos os pacientes foram previamente tratados com Hidroxiuréia e/ou IFNα de acordo com as recomendações do Ministério de Saúde do Brasil e iniciaram o tratamento com imatinibe após apresentar intolerância e ou falha aos medicamentos. O estudo inclui apenas os pacientes que estão realizando a terapia com imatinibe e estão apresentando resposta subótima ao tratamento. Antes da realização da coleta do material biológico desses pacientes, todos foram previamente informados sobre o objetivo da pesquisa a ser desenvolvida para então concordar com a sua participação na doação do material biológico assinando o termo de consentimento livre e esclarecido, conforme rege a Resolução 196/96, do Conselho Nacional de Saúde, sobre aspectos éticos envolvendo a pesquisa com seres humanos (Anexo I). 4.2 CRITÉRIO DE FALHA NO TRATAMENTO O estudo utilizou como parâmetro os critérios utilizados pela European LeukemiaNet (ELN) descrito na Tabela 3.

36 23 Tabela 3. Critérios baseados no European LeukemiaNet (ELN) para resposta subótima e falha de resposta em 3, 6, 12 e 18 meses (HUGUES & BRANFORD, 2009). Período Falha Resposta subótima 3 meses Sem RH Sem RHC 6 meses Sem RHC Sem RCM e/ou > 10% BCR-ABL (IS) 12 meses Sem RCM e/ou > 10% BCR-ABL (IS) 18 meses Sem RCC e/ou > 1% BCR- Sem RCC e/ou > 1% BCR- ABL (IS) Sem RMM ABL (IS) *RH: Resposta hematológica; RHC: Resposta hematológica completa; RCM: Resposta citogenética completa; RMM: Resposta molecular maior. As amostras foram encaminhadas ao Laboratório de Biologia Celular e Molecular da Fundação HEMOPA, as quais foram retiradas de 5 ml de sangue periférico com sistema a vácuo em tubo com anticoagulante EDTA para obtenção da camada de leucócitos e posterior extração de RNA. 4.3 EXTRAÇÃO DE RNA O RNA foi extraído a partir da camada de leucócitos utilizando o kit comercial TRIzol (Invitrogen) de acordo com instruções do fabricante. O reagente TRIZOL LS é uma solução monofásica de fenol e guadinina isotiocianato que permite o isolamento de RNA total de células em suspensão. O reagente mantém a integridade do RNA, destruindo e dissolvendo os componentes celulares. A adição de clorofórmio seguida da centrifugação separa a solução em uma fase orgânica e uma fase aquosa. O RNA fica restrito à fase aquosa e pode ser

37 24 finalmente precipitado com o uso do álcool isopropílico. A descrição dos procedimentos técnicos consta no Anexo II. 4.4 TRANSCRIÇÃO REVERSA A partir de 10 L de RNA, o cdna foi sintetizado de acordo com o kit High Capacity cdna Reverse Transcriptase (Applied Biosystems) para transformar o RNA extraído e purificado em cdna. A reação utiliza as quantidades de reagentes descritas na Tabela 4. Tabela 4. Reagentes utilizados na síntese de cdna. Reagentes µl Água ultra pura 4,2 Tampão Reverse Transcript (10 X) 2 dntp 0,8 Iniciadores randômicos (10X) 2 Transcriptase reversa 1,0 Amostra 10 A ciclagem utilizada é 25º C durante 10 minutos e 37º C por 120 minutos. 4.5 ANÁLISE DAS MUTAÇÕES DE RESISTÊNCIA A pesquisa de mutações é baseada em um polimorfismo de nucleotídeo único (SNP), através da presença das variantes de resistência que apresentem falha na resposta ao tratamento com imatinibe. Os SNPs foram selecionados de acordo com a literatura como podemos observar na Tabela 5.

38 25 A mutação T315I ocasiona substituição do códon 315 de treonina (ACT) para isoleucina (ATT) e está localizada na região de ligação ao imatinibe. Já as mutações E255V que substitui ácido glutâmico (GAG) para valina (GTG) e a Y253H responsável pela mudança de tirosina (TAC) para histidina (CAC) estão localizadas no domínio da alça P(sítio de ligação ao fosfato). Tabela 5. Pontos de mutação do domínio tirosina quinase do BCR-ABL utilizados no estudo (adaptado de HOUCHAUSS et al., 2002; BACCARANI, 2008). Mutação genômica Aminoácido Localização/ABL IC 50 (µm) * C T T 315 I éxon 6 >6400 A T E255V éxon 4 >6400 T C Y253H éxon 4 >6400 A posição do nucleotídeo ABL refere-se ao locus U extraída do banco de dados NCBI. 4.6 ASSAYS-BY-DESIGN As seqüências dos SNPs escolhidos foram enviadas à Applied Biosystems para desenho e síntese de iniciadores e sondas através do serviço Assays-by-design. 4.7 REAÇÃO EM CADEIA DA POLIMERASE (PCR) ALELO ESPECÍFICA EM TEMPO REAL. A detecção das mutações por PCR em tempo real foi realizada utilizando o aparelho ABI Prism 7000 e kit comercial TaqMan Genotyping Master Mix, ambos da Applied Biosystems. O protocolo da reação utiliza as quantidades de reagentes descritas na Tabela 6. O protocolo de amplificação da reação constituiu-se da seguinte ciclagem: 50ºC/2 min, 95ºC/10 min e 50 ciclos de 95ºC/15 seg e 60ºC/ 1 min. A leitura das mutações do BCR-ABL

39 26 em tempo real foi baseada no polimorfismo de nucleotídeo único, sendo utilizado fluoróforo VIC e FAM para marcar os nucleotídeos, respectivamente alelo selvagem e alelo mutado. Tabela 6. Reagentes utilizados na PCR alelo específica em tempo real. Reagentes µl Água deionizada 9,25 Tampão TaqMan Genotyping Master Mix 12,5 SNP 1,25 cdna 2

40 27 5. RESULTADOS Entre os pacientes portadores de LMC assistidos no Hospital Ophir Loyola (Belém-PA) diagnosticados por critérios clínicos e hematológicos e confirmados por PCR em tempo real para BCR-ABL, foram selecionados 58 pacientes que realizam a terapia com imatinibe e apresentaram falha na resposta. Os pacientes LMC 8, LMC 10 e LMC 27 e LMC 43 apresentaram intolerância ao imatinibe e já iniciaram a terapia com outros inibidores de tirosina quinase. Dentre os 58 pacientes estudados, 27 (47%) são do sexo feminino e 31 (53%) do sexo masculino. As idades variam entre 9 e 79 anos, com a média de idade de 46 anos. A maioria dos pacientes encontra-se na fase crônica da LMC 48 (83%) e 10 (17%) na fase acelerada, nenhum paciente encontra-se em fase blástica. Em relação à resposta molecular destes pacientes, 12 (21%) apresentaram redução de 1 log e encontram-se em remissão hematológica em contraposta a 46 (79%) que não apresentação redução de log. O intervalo entre o diagnóstico e o início do tratamento foi dividido em dois grupos: menor que 1 ano e maior que 1 ano, sendo que 40 (69%) iniciam o tratamento em menos de 1 ano e 18 (31%) dos pacientes iniciam o tratamento após 1 ano do diagnóstico, como podemos observar na Tabela 7.

41 28 Tabela 7. Perfil de mutações dos pacientes portadores de LMC. Paciente Sexo Idade Fase Resposta Intervalo Mutações (Log) D/T T315I Y253H E255V LMC 01 M 38 C < 1 ano S S S LMC 02 F 47 C 1.60 > 1 ano S S S LMC 03 F 71 C < 1 ano S S S LMC 04 M 43 A < 1 ano S S S LMC 05 M 34 C 0.47 < 1 ano S S S LMC 06 M 24 C < 1 ano S S S LMC 07 M 43 A > 1 ano S S S LMC 08 M 49 A 1.76 > 1 ano S S S LMC 09 M 44 C > 1 ano S S S LMC 10 M 50 C < 1 ano S S S LMC 11 F 36 C < 1 ano S S S LMC 12 F 34 C 0.04 < 1 ano S S S LMC 13 F 36 C < 1 ano S S S LMC 14 F 45 C 2.04 < 1 ano S S S LMC 15 F 37 C < 1 ano S S S LMC 16 F 32 C 1.45 > 1 ano S S S LMC 17 F 43 C > 1 ano S S S LMC 18 F 41 C < 1 ano S S S LMC 19 F 58 C < 1 ano S S S LMC 20 M 30 C < 1 ano S S S LMC 21 M 64 C > 1 ano S S S LMC 22 M 42 C 2.44 > 1 ano S S S LMC 23 M 63 C 1.73 < 1 ano S S S LMC 24 M 27 A 0.42 < 1 ano S S S LMC 25 F 49 C < 1 ano S S S LMC 26 M 20 C < 1 ano S S S LMC 27 M 53 C 0.94 > 1 ano S S S LMC 28 M 71 C < 1 ano S S S LMC 29 M 20 C < 1 ano S S S LMC 30 F 35 C 0.03 < 1 ano S S S

42 29 Paciente Sexo Idade Fase Resposta Intervalo Mutações (Log) D/T T315I Y253H E255V LMC 31 F 22 C < 1 ano S S S LMC 32 F 61 A -1,12 > 1 ano S S S LMC 33 F 9 C < 1 ano S S S LMC 34 M 74 C < 1 ano S S S LMC 35 M 62 C < 1 ano S S S LMC 36 M 44 C > 1 ano S S S LMC 37 M 79 C 0.65 > 1 ano S S S LMC 38 M 52 C 0.21 > 1 ano S S S LMC 39 F 38 C < 1 ano S S S LMC 40 M 27 C < 1 ano S S S LMC 41 F 68 C 1.93 < 1 ano S S S LMC 42 F 70 A 0.01 > 1 ano S S S LMC 43 F 47 A < 1 ano S S S LMC 44 F 38 C < 1 ano S S S LMC 45 M 36 C 0.10 < 1 ano S S S LMC 46 F 44 C > 1 ano S S S LMC 47 M 72 C < 1 ano S S S LMC 48 M 42 C < 1 ano S S S LMC 49 F 34 C 0.18 < 1 ano S S S LMC 50 M 72 A -0,35 < 1 ano S S S LMC 51 M 49 C 0.18 > 1 ano S S S LMC 52 F 39 C > 1 ano S S S LMC 53 F 53 C 0.05 < 1 ano S S S LMC 54 M 58 C 0.10 < 1 ano S S S LMC 55 F 73 A 0.21 < 1 ano S S S LMC 56 M 25 A 2.05 > 1 ano S S S LMC 57 M 30 C 1.30 < 1 ano S S S LMC 58 F 50 C < 1 ano S S S *Feminino: F, Masculino: M; Fase Crônica: C, Fase Acelerada: A, Fase Blástica: B; Intervalo D/T: Intervalo entre o diagnóstico e o tratamento; Alelo Selvagem: S, Alelo Mutante: M.

43 30 O estudo revelou que 58 (100%) dos pacientes apresentaram o selvagem para as mutações pesquisadas. A mutação T315I que sinaliza a mudança de base de (C/T), é identificada pela curva durante a reação de cadeia da polimerase, na qual o fluoróforo VIC marca o nucleotídeo C (alelo selvagem) e o FAM marca o nucleotídeo T (alelo mutante) observado no Figura 5. A curva é positiva para o alelo selvagem. Figura 5. Gráfico do PCR em tempo real referente ao SNP T315I (LMC 3). A mutação Y253H corresponde à mudança de base (T/C) em que o fluoróforo VIC marca o nucleotídeo T (alelo selvagem) e a o fluoróforo FAM marca o nucleotídeo C (alelo mutante). Na Figura 6 podemos observar a curva da reação positiva para o selvagem.

44 31 Figura 6. Gráfico do PCR em tempo real referente ao SNP Y253H (LMC 3). A Figura 7 corresponde a uma curva positiva para o alelo selvagem da mutação E255V, também marcada pelos fluoróforos VIC e FAM para a mudança de base de (A/T). Figura 7. Gráfico do PCR em tempo real referente ao SNP E255V (LMC 3).