Curso de mestrado em Ciências Odontológicas JOSÉ MAURÍCIO DE SOUZA CRUZ VELOSO FILHO

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1 Curso de mestrado em Ciências Odontológicas JOSÉ MAURÍCIO DE SOUZA CRUZ VELOSO FILHO ANÁLISE HISTOMÉTRICA DO SÍTIO CIRÚRGICO APÓS LEVANTAMENTO DE SEIO MAXILAR UTILIZANDO COÁGULO SANGUÍNEO OU PLASMA RICO EM FIBRINA COMO MATERIAL DE ENXERTIA BARRETOS 2015

2 JOSÉ MAURÍCIO DE SOUZA CRUZ VELOSO FILHO ANÁLISE HISTOMÉTRICA DO SÍTIO CIRÚRGICO APÓS LEVANTAMENTO DE SEIO MAXILAR UTILIZANDO COÁGULO SANGUÍNEO OU PLASMA RICO EM FIBRINA COMO MATERIAL DE ENXERTIA Dissetacao apresentada ao curso de Mestrado em Ciencias Odontológicas do Centro Universitário da Fundação Educacional de Barretos, para obtenção do título de Mestre em Impalntodontia. Orientador: Prof. Dr. Felipe Leite Coletti Co-orientador: Prof. Dr. Celso Eduardo Sakakura BARRETOS 2015

3 DADOS CURRICULARES JOSÉ MAURÍCIO DE SOUZA CRUZ VELOSO FILHO Nascimento 11/10/1983 MANAUS/AM Filiação José Maurício de Souza Cruz Veloso Ana Luiza Cardoso Cruz Veloso 2003/2008 Instituto Amazônia de Ensino Superior - IAES 2008/2010 Pós-graduado em Prótese Dentária da Associação Brasileira de Odontologia do Amazonas ABO-AM 2009/2011 Pós-graduado em Implantodontia da Associação Brasileira de Odontologia do Amazonas ABO-AM 2013/2015 Curso de Mestrado em Ciências Odontológicas Do Centro Universitário da Fundação Educacional de Barretos - UNIFEB 2011/Atualmente Professor da pós-graduação em implante e prótese dentária e graduação no Instituto Amazônia de Ensino Superior - IAES

4 DEDICATÓRIA Dedico, em primeiro lugar, este trabalho à minha querida esposa Samara, que sempre me apoiou estando junto de mim nessa jornada dando-me valorosos conselhos e ajuda de extrema importância que enriqueceram minha obra. Também gostaria de dedicar essa tese aos meus pais que me ajudaram em todas as fases da minha vida, dando-me sensatos e sábios ensinamentos que me guiaram na direção da perseverança e do sucesso. Finalmente gostaria de lembrar que o motivo principal desse estudo é dar um pequeno incremento no avanço da ciência da regeneração tecidual e, fundamentalmente, na melhoria da qualidade de vida de todos os pacientes, em especial, aqueles que me acompanham ma rotina diária da clínica odontológica.

5 AGRADECIMENTO A Deus por me amparar nos momentos difíceis, me dar força para superar as dificuldades, mostrar o caminhos nas horas incertas e me suprir em todas as necessidades. Ao meu professor orientador, por acreditar em mim, me mostrar o caminho da ciência e ser exemplo de profissional. À minha família, a qual amo muito, pelo carinho, paciência e incentivo. Aos professores do curso de Mestrado da UNIFEB por todo conhecimento dividido no decorrer desses anos de curso. incentivando. Aos amigos de curso que fizeram parte desses momentos sempre me ajudando e

6 EPÍGRAFE Uma pedra intransponível para o pessimista é uma pedra de apoio para o otimista. Eleanor Roosevelt.

7 SUMÁRIO LISTA DE ABREVEATURAS E SÍMBOLOS... 7 LISTA DE FIGURAS... 8 RESUMO....9 ABSTRACT INTRODUÇÃO REVISÃO PROPOSIÇÃO MATERIAL E MÉTODO RESULTADO DISCUSSÃO CONCLUSÃO REFERÊNCIAS... 40

8 7 LISTA DE ABREVIATURAS E SÍMBOLOS CS- coágulo sanguíneod EDTA - ácido etilenodiamino tetra-acético FC - Fatores de crescimento FCFb - fator de crescimento de fibroblastos-básico HE - hematoxilina e eosina L-PRF - Fibrina rica em plaquetas e leucócitos PBS - tampão fosfato-salina PDGF - fator do crescimento derivado de plaquetas PKB - proteína quinase B PPP plasma pobre em plaquetas PRGF - plasma rico em fatores de crescimento PRF - fibrina rica em plaquetas PRP -plasma rico em plaquetas PTM - porcentagem de tecidos moles PTO - porcentagem de tecido ósseo RCB glóbulos vermelhos TC Tecido Conjuntivo TGF - fator transformador de crescimento TO Tecido Ósseo VEGF - fator de crescimento endotelial vascular VS Vaso Sanguíneo

9 8 LISTA DE FIGURAS Figura 1: Incisão cirúrgica. Figura 2: Osteotomia vestibular. Figura 3: Deslocamento da membrana sinusal. Figura 4: Parafusos de enxertia estabilizando a cortical óssea rebatida. Figura 5: Membrana não absorvível estabilizada por tachinhas cirúrgicas. Figura 6: Biópsia removida. Figura 7: Esquema de uma secção do centro de uma amostra. Figura 8: Gráfico envidenciando a PTO e PTM. Figura 9: Aspecto histológico de amostras.

10 9 RESUMO VELOSO FILHO, JMSC. Análise Histométrica de tecido ósseo neoformado em humanos, utilizando LPR-F como material de enxertia em seios maxilares pneumatizados. [Dissertacao de Mestrado]. Barretos: Curso de Mestrado em Ceiências Odontológicas da UNIFEB; O presente estudo científico apresenta como principal e primordial objetivo executar uma análise histométrica no sítio cirúrgico após seis meses do levantamento de seio maxilar utilizando coágulo sanguíneo ou plasma rico em fibrina. Para tal propósito foi empregada a avaliação histométrica da porcentagem de tecidos moles e porcentagem de tecido duro em amostras do sítio cirúrgico, com a técnica cirúrgica que consiste no bloqueio regional dos nervos infraorbitário e alveolar superior posterior associado a técnica infiltrativa dos nervos nasopalatino e palatino maior (articaina 4% - 1: DFL ) da área correspondente ao seio maxilar. Verificou-se que algumas aplicações clínicas deste biomaterial autólogo foram descritas em várias áreas de medicina e relativamente a procedimentos específicos relacionados com a reabilitação em implantologia, leucócitos e plaquetas ricos em fibrina - LPR-F, tem, também, várias aplicações. As membranas de PRF, podem ser utilizadas sozinhas ou em combinação com material de enxerto ósseo como material de preenchimento em alvéolos pós-extração ou técnicas de levantamento do seio, sendo que com a sua arquitetura de fibrina forte e lenta liberação de fatores de crescimento e glicoproteínas ao longo de vários dias, esta membrana bioativa natural pode aumentar a cicatrização de tecidos moles e duros enquanto protege locais cirúrgicos e materiais enxertados de agressões externas. Tem ainda a vantagem de reduzir o edema e dor pósoperatório e diminuir o aparecimento de processos infeciosos. Foi utilizada uma secção histológica do centro de cada uma das amostras para se efetuar a análise histométrica. O

11 10 grupo de plaquetas rica em fibrina PRF, apresentou maior porcentagem de tecido ósseo - PTO (59,9 + 5,9), e menor porcentagem de tecidos moles - PTM (40,1 + 5,9), quando comparado com o grupo coagulação sanguínea - CS (PTO, 43,9 + 7,6 - p<0,01; PTO, 56,1 + 7,6 - p<0,01). Palavras-chave: Implante dentário; Seio maxilar; Fibrina e Materiais biocompatíveis.

12 11 ABSTRACT VELOSO FILHO, JMSC. Analysis of newly formed bone tissue histometric in humans using LPR-F as a grafting material in maxillary sinuses pneumatized. [Master of Dental Science] - Concentration in Implantology). University Center of Barretos Educational Foundation. This scientific study has as main and primary objective perform a Histometric analysis at the surgical site after six months of maxillary sinus lift using blood clot or rich plasma fibrin. For this purpose we used the Histometric evaluation of the percentage of soft tissue and percentage of hard tissue samples from the surgical site with surgical technique of regional blockade of infraorbital nerve and alveolar posterior superior associated with infiltrative technique of nasopalatine nerves and greater palatine (articaine 4% - 1: 100,000 DFL ) of the area corresponding to the maxillary sinus. It was found that some clinical applications of autologous biomaterials have been described in various fields of medicine and for specific procedures related to the rehabilitation in implantology, leukocyte and plateletrich fibrin - LPR-F has also various applications. Membranes PRF, can be used alone or in combination with bone grafting materials as filler in post extraction sockets or sinus lifting techniques, and with its heavy and slow fibrin architecture release factors and glycoproteins growth over several days, this natural bioactive membrane can enhance the healing of soft and hard tissue while protecting surgical sites and external aggressions grafted materials. It also has the advantage of reducing edema and postoperative pain and diminish the appearance of infectious processes. A histological section from the center of each sample was used to perform the histometric analysis. The rich platelet group fibrin - PRF, had a higher percentage of bone - PTO ( ), and a lower percentage of soft tissue - PTM ( ), compared to blood clotting group - CS (PTO p <0.01; PTO p <0.01).

13 Keywords: Dental implants; Maxillary sinus; Fibrin and Biocompatible materials 12

14 13 1 INTRODUÇÃO Nos dias atuais, um dos grandes desafios da investigação clínica prende-se com o desenvolvimento de aditivos cirúrgicos bioativos que auxiliem a regulação da inflamação e aumentem a velocidade do processo de cicatrização. Com efeito, a pesquisa e o desenvolvimento de protocolos que promovam a hemóstase e a cicatrização são uma questão recorrente em todas as áreas cirúrgicas. Fibrina rica em plaquetas e leucócitos (LPR-F) é um concentrado de plaquetas imune de segunda geração que contém numa única membrana de fibrina todos os constituintes de uma amostra de sangue favoráveis à cicatrização e imunidade (Choukroun et al., 2006). Essa membrana consiste numa malha 3D de fibrina de alta densidade e com junções trimoleculares equilaterais entre si resultante de uma polimerização lenta com a incorporação de plaquetas, leucócitos, fatores de crescimento, e com a presença de células estaminais circulantes (Dohan, Ehrenfest et al., 2009). Ela pode ser utilizada em combinação com materiais de enxerto ósseo para acelerar a cicatrização no levantamento lateral do seio maxilar. A utilização de LPR-F é uma técnica mais simples e rápida, onde prepara-se e aplica-se um protocolo mais econômico desenvolvido até a data. Assinala-se, deste posto, que o LPR-F é utilizada na reabilitação em implantodontia, com o intuito de melhorar as condições e diminuir o tempo de cicatrização dos tecidos. Assim, após cada intervenção cirúrgica, os profissionais enfrentam situações complexas no que tange à remodelação de tecidos e as consequências da cicatrização e sobrevivência dos tecidos. (Sá, 2013) Devido aos poucos estudos nesta área, esta pesquisa visa apresentar um estudo clínico acerca do uso do LPR-F em implantologia, verificando sua influência e importância no processo de reabilitação.

15 14 2 REVISÃO DA LITERATURA 2.1.Seio Maxilar Os anatomistas comparam o seio maxilar a uma pirâmide triangular, de base na parede das fossas nasais e vértice no processo zigomático. Gosau (2009), num estudo com cadáveres, medindo a distância entre o assoalho das fossas nasais e o ósteum concluiu que este não estará a uma altura inferior a 18 mm do assoalho das fossas nasais. Dos vários bordos, interessa-nos o bordo inferior, também designado pavimento do seio. Este bordo pode ser, em alguns casos, uma verdadeira face inferior e a sua importância deve-se ao fato de entrar em contato com os ápices dentários, normalmente de pré-molares e molares, sendo o segundo molar, com frequência, o mais intimamente relacionado com esta estrutura (Rosano, 2008). Segundo Jensen e Katsuyama (2012), após a perda dos dentes superiores posteriores pode ocorrer uma pneumatização secundária. Frequentemente se observam saliências cônicas que se projetam para dentro do seio maxilar. Essas saliências são formadas por raízes de molares e pré-molares. Pode haver também paredes ósseas ou septos que se projetam do assoalho e da parede lateral para dentro da cavidade sinusal. Os septos podem, de fato, dividir o seio maxilar em dois compartimentos completamente separados. Em geral são unitários e unilaterais e sua incidência varia entre 16% e 58% (Koymen et al., 2009). A atrofia maxilar severa na região posterior e pneumatização exagerada do seio maxilar, torna inviável a instalação de implantes osseointegráveis pela inadequada altura do osso alveolar (Reinert, Koning, 2004). Eliaz (2003) citou que o melhor caminho para localizar os septos ósseos no préoperatório é através de radiografia panorâmica e tomografia computadorizada.

16 Técnicas Cirúrgicas e Materiais de Enxertia Branemark afirmou que para realização da técnica de levantamento de seio maxilar deve-se saber indicá-la conforme sua peculiaridade. As técnicas mais citadas são: Acesso indireto com o uso de osteótomos e instalação de implante, chamada de técnica Atraumática ou técnica de summers; acesso direto ao seio maxilar com instalação de implante, chamada de Técnica traumática com instalação simultânea; e, acesso direto ao seio maxilar sem instalação de implante, chamada de técnica traumática sem instalação simultânea de implante. Apresentam-se também pesquisas recentes com técnica de levantamento de seio maxilar com enxerto de coágulo sanguíneo. (Mandia, 2007) As técnicas de levantamentos costumam ser realizadas concomitante a enxertia óssea. Os enxertos podem ser classificados quanto a sua origem em, autógenos, homógenos, heterógenos e aloplásticos e, quanto ao mecanismo de ação em osteoindutores, osteocondutores, osteogênico e osteopromotores (Gray, 1989; Toledo et al, 2012). Os biomateriais de enxertia para serem considerados ideais, não devem causar alterações físicas ao tecido, nem sequer reações alérgicas ou tipo corpo estranho, devendo ser farmacologicamente inertes (Zheng, Wang, 2001). Várias técnicas para o levantamento dos seios maxilares são projetados para permitir a inserção simultânea ou posterior dos implantes dentários entre a membrana do seio maxilar e o osso alveolar do paciente. O item que mais sofre variação entre as técnicas é o biomaterial, devido às inúmeras opções disponíveis no mercado (Soballe, 1993). Biomateriais são compostos artificiais que ao entrar em contato com o sistema biológico humano permitem tratar, aumentar ou substituir qualquer tecido órgão e restituir uma determinada função do organismo. Dentre estes, destacam-se: hidroxiapatita de cálcio, proteína morfogenética óssea e vidro bioativo (Martin, 2010).

17 16 Fugazzotto et al. (1998), relataram que torna-se necessário entender quando indicar o levantamento de seio maxilar e quando realizá-lo com a instalação de implantes simultaneamente. Existem situações relacionadas com a altura do remanescente ósseo, onde pacientes que apresentam de 01 a 04 mm de osso alveolar remanescente da maxila posterior, torna-se necessário realizar o levantamento de seio traumático, esperar a cicatrização do enxerto para poder instalar o implante, devido a impossibilidade de o osso remanescente promover estabilidade primaria ótima ao implante para sua osseointegração. Sendo assim uma cirurgia em dois tempos. Quando o remanescente ósseo apresenta remanescente superior a 06mm, sugere-se a técnica Atraúmatica de levantamento de seio maxilar, uma técnica mais conservadora, por não precisar de janela óssea (Summers,1994). Outra situação corriqueira é quando há uma quantidade óssea entre 05 a 07 mm, podendose realizar o Levantamento de seio maxilar traumático da maxila e instalar o implante no mesmo tempo cirúrgico, pois esta quantidade óssea é suficiente para assegurar a estabilidade primária do implante (Fugazzotto, Vlossis et al, 1998) Em trabalhos experimentais comprovaram que a quantidade de osso encontrada na proximidade do implante é maior com uso de osso autógeno, no entanto, estudos clínicos têm demonstrado, através de análise de frequência de ressonância, valores similares ou superiores de estabilidade de implantes inseridos em seio maxilar preenchido por coágulo sanguíneo (Palma, 2006). Dentre as dificuldades mais comuns estão as perfurações da membrana sinusal; dificuldades anatômicas dos seios maxilares (septos ósseos, seios estreitos); membranas sinusais pouco resistentes em pacientes fumantes; pacientes que fazem uso constante de descongestionantes nasais; pacientes com sinusites e infecções nos seios maxilares (Van Den Bergh et al.,2000).

18 17 Burnouf et al. (2013) destacaram que vários biomateriais podem ser obtidos a partir de sangue humano. Alguns são usados para indicações clínicas que requerem um elevado teor de fibrinogênio, enquanto outros são utilizados porque eles contêm vários fatores de crescimento de plaquetas. Imitando eventos fisiológicos induzidos por trombina de coagulação levando a fibrino-formação e ativação plaquetária, biomateriais de sangue têm vantagens críticas de serem desprovidas de tecidos necróticos e efeitos de serem biodegradáveis por enzimas do corpo. Biomateriais à base de fibrina, conhecidos como colas de fibrina ou selantes de fibrina, têm sido utilizados por mais de 30 anos como hemostático cirúrgico e agentes de vedação, demonstrando benefícios em praticamente todos os campos cirúrgicos, incluindo a cirurgia plástica reparadora e tratamento de feridas. O interesse clínico em crescimento plaquetário rico em fator de biomateriais (muitas vezes conhecido como géis de plaquetas ou plaquetas ricas em plasma) surgiu recentemente. As plaquetas são usadas em situações clínicas para atingir a cicatrização de feridas e reparação de tecidos moles e duros. As aplicações incluem a cicatrização de úlceras recalcitrantes e queimaduras, e estimulação da regeneração do tecido ósseo na odontologia, implantologia e cirurgia maxilofacial e plástica. O PRP é obtido a partir do próprio sangue do paciente com concentrado de plaquetas ricas em fatores de crescimento que são responsáveis pela integração e neoformação óssea. A hidroxiapatita com PRP, através de resultados clínicos, tem sido indicada como material alternativo para enxertia no seio maxilar, além do osso autógeno que é o material consagrado para esse procedimento (Eduard, Robert e York, 2009). No final do século passado, os trabalhos de Marx (1998), colocaram em evidência a possibilidade de obter citocinas ou fatores de crescimento concentrando o sangue autólogo através da centrifugação. Desta forma se deu o surgimento do PRP ou Plasma Rico em Plaquetas (Dohan, 2009).

19 18 Os concentrados plaquetários são utilizados de forma rotineira há vários anos em diversas especialidades da Medicina. A finalidade é recuperar as citocinas ou fatores de crescimento existentes nas plaquetas ou trombócitos após a centrifugação total do sangue. Muitos protocolos foram propostos de acordo com o tipo de centrifugação e o tipo de tubos utilizados: Plasma Rico em Plaquetas (PRP), Plasma Rico em Fatores de Crescimento (PRGF) e Fibrina Rica em Plaquetas (PRF). A técnica do PRF levou vários anos para entrar em uso, e atualmente é considerada a mais simples, menos onerosa e mais eficaz (Del Corso, 2010). Conforme ensinaram Ehrenfest et al. (2009), a classificação dos diferentes concentrados de fibrina divide-se em quatro categorias, dependendo do seu conteúdo em leucócitos e fibrina: puro plasma rico em plaquetas (P-PRP), como separador de células PRP, Vivostat PRF ou PRGF de Anitua; plasma rico em plaquetas e leucócitos (L-PRP), como o Curasan, Regen, Plateltex, SmartPReP, PCCS, Magellan ou GPS PRP, fibrina rica em plaquetas pura (P-PRF), como Fibrinet; e por fim fibrina rica em plaquetas e leucócitos (L- PRF). No entanto, para este estudo, será destacada apenas o plasma rico em fibrina, foco do tema desta dissertação. Talvez a técnica mais utilizada para a regeneração é o uso de enxertos de substituição óssea. Estes enxertos podem promover a regeneração de tecido ou osso através de diversos mecanismos tais como: osteogênese, osteoindução e osteocondução. Osteogênese é a propriedade de formação de novo tecido por células ósseas transplantadas. Osteoindução é a propriedade de formação de novo osso pelas células progenitoras do leito receptor sob a influência de um agente indutivo do enxerto. Osteocondução é a propriedade de produção de novo osso por proliferação e migração de de células ósseas do leito receptor através da superfície do enxerto, que age como arcabouço. (Gleizal & Beziat, 2007; Marx & Stevens, 2004; Gao et al., 2009)

20 19 O PRF ajuda a obter membranas de fibrina enriquecidas com plaquetas e fatores de crescimento. O PRF pela técnica de Choukroun é produzido de uma forma natural, sem o uso de um anticoagulante, trombina bovina, ou cloreto de cálcio para plaquetária ativação da fibrina e polimerização. Estudos in vitro têm demonstrado que o PRF autólogo libera fatores de crescimento gradualmente durante pelo menos 1 semana ou superior a 28 dias, potencializando assim, a neoformação de células ósseas (Vijayalakshmi et al., 2015). A polimerização natural é lenta ocorrendo durante o processo de centrifugação da PRF e leva à formação de uma organização tri-dimensional homogênea da rede de fibrina. Um modo de ativação progressiva significa um incremento da incorporação das citocinas circulantes na fibrina (Del Corso et al., 2010). O PRF é um concentrado de plaquetas que é obtida sem tratamentos bioquímicos e foi desenvolvido para acelerar o tempo de cura. O primeiro material relatado foi um adesivo de tecido referido como Tisseel (Baxter, Viena, Áustria). Apesar de ter sido elaborado com base no princípio de hemostasia, isto era difícil de utilizar pelos fatores de crescimento (Kim et al., 2013). O PRP é flexível, forma redes fortes de fibrina e induz a síntese de colágeno e formação de osso pela liberação de citocinas e fatores de crescimento gradualmente. Dohan (2009) e Choukroun (2006) relataram que, por causa da estabilidade da estrutura de fibrina gerados durante o processo de polimerização de PRF, a extensão dos fatores de crescimento contidos em PRF é de 7 dias, o que é mais do que o PRP. He et al. (2009) relataram que o fator transformador de crescimento (TGF) é derivado de plaquetas com fator de crescimento (PDGF) contido no PRP e são liberados maximamente no primeiro dia após o transplante. No entanto, o máximo da liberação da PRF é depois de 14 a 7 dias, respectivamente.

21 20 He et al. (2009) mostraram que, em comparação com o PRP, o PRF poderia liberar continuamente uma grande quantidade de fatores de crescimento que poderiam induzir a diferenciação e proliferação de osteoblastos. Os fatores de crescimento que são liberados da PRF são PDGF, TGF, fator de crescimento epidérmico, e outros. Eles são armazenados em grânulos de plaquetas e em tecidos danificados; eles medem o crescimento e diferenciação celular, a síntese de colágeno, e assim por diante por ativação de sinais intracelulares. Eles induzem o processo de cura geral pela indução da hemostasia, angiogênese, e osteoblastos diferenciados. Essa é uma das propriedades mais interessantes do PRF. Além disso, o PRF possui também a fibrina que funciona como matriz celular, ou seja, um composto que se enche de células e permite o surgimento de um novo tecido, uma vez que a fibrina não reabsorve, ela se transforma. Dessa forma, numerosas indicações foram descritas, como a utilização nos enxertos ósseos, levantamento de seio maxilar, preenchimento de alvéolos e estímulo para a cicatrização gengival (Simonpieri et al., 2011). Evidencia-se que a atividade biológica da fibrina é, por si só, suficiente, para explicar a capacidade cicatricial do PRF. E o modo de polimerização lento confere às membranas deste material uma arquitetura fisiológica particularmente favorável, que sustenta o processo de cicatrização. A matriz apresenta propriedades mecânicas que nenhum outro concentrado rico em plaquetas oferece. O alcance das aplicações clínicas do PRF é amplo, porém, um conhecimento preciso deste biomaterial, a sua eficácia e os seus limites são necessários para otimizar o seu uso sistemático na prática clínica diária (Del Corso, 2010). O PRF é então capaz de regular a inflamação e a estimular o processo imunológico de quimiotaxia. O PRF é um material de enxerto autólogo que elimina qualquer risco de transmissão da doença; além disso, sua gelatinosa consistência favorece a estabilidade do coágulo e do material de enxerto. Este material natural parece acelerar a cura

22 21 da ferida fisiológica e em associação com enxertos ósseos, parece que se acelera a neoformação óssea (Tatullo et al., 2012). O PRF tem muitas vantagens, de acordo com o que elencam Del Corso et al. (2012) e Tatullo et al. (2012): Protocolo simples e barato; Contém uma grande quantidade de fibrina, plaquetas e leucócitos; Acelera angiogênese, a multiplicação de fibroblastos e osteoblastos, e cicatrização. O PRF é um coágulo natural otimizado que pode melhorar o processo de cicatrização natural, no qual o carreador, uma matriz de fibrina homogênea e forte sem as células vermelhas do sangue, transporta plaquetas, leucócitos e células mesenquimais indiferenciadas circulantes. Essa estrutura forma um suporte natural complexo, que permite o repovoamento com células do próprio paciente. O PRF é produzido sem qualquer modificação do sangue e é a consequência natural da coagulação durante a centrifugação sendo um tecido vivo e um biomaterial sólido capaz de preencher um espaço. As plaquetas são ativadas, o que resulta em sua degranulação com liberação de citocinas. O PRF é obtido através da coleta de sangue sem anticoagulante processado em uma única centrifugação e sem uso de aditivos, com baixo custo, produzindo um coágulo mais estável que o coágulo de sangue natural, desempenhando o mesmo papel e estimulando o potencial de cura natural dos tecidos. O PRF possui mais de 60 mediadores biológicos, os quais envolvem mecanismos como quimiotaxia, proliferação celular, diferenciação, angiogênese, deposição da matriz intracelular, modulação imune, atividade antimicrobiana e remodelação (Del Corso, 2010; Wu et al., 2012; Panda et al., 2014). A propriedade angiogênica da matriz de fibrina é estabelecida pela estrutura 3D do gel de fibrina e pela ação simultânea de citoquinas presas nas malhas. Além disso, os

23 22 principais fatores solúveis da angiogênese, tais como o fator de crescimento de fibroblastosbásico (FCFb), o fator de crescimento endotelial vascular (VEGF), angiopoietina e PDGF são adicionadas no gel de fibrina (Wu et al., 2012) A principal vantagem do PRF é a menor morbidade para o paciente. Nas cirurgias convencionais para enxerto é preciso retirar osso de outras regiões, como crista ilíaca, osso mandibular, mento e céu da boca no caso de enxertos de gengiva. Se não for por esse meio, pode-se recorrer ao banco de ossos. Entretanto, quando o PRF é associado ao material de banco, os resultados são muito melhores. Se for utilizado apenas banco de osso, ele só tem o que chamamos de osteocondução, mas, com a associação, é possível tornar esse enxerto vivo, com células do próprio paciente. Na centrifugação, com 10 ml de sangue é possível conseguir uma membrana do tamanho de 20 mm x 10 mm para recobrir um defeito ósseo (Ehrenfest et al., 2010). Vários artigos têm descrito o uso destas membranas PRF para a estimulação do osso e cicatrização gengival durante o aumento do seio subantral e de reabilitações com implantes dentários. O efeito destas membranas na cicatrização dos tecidos moles e maturação é particularmente significativa. (Sá, 2013; Gonçalves, 2008) Pontua-se que em alguns minutos, a ausência de anticoagulante implica a ativação da maioria das plaquetas da amostra de sangue em contato com as paredes do tubo que desencadeia a cascata da coagulação. Inicialmente o fibrinogênio é concentrado no topo do tubo, até que a trombina circulante o transforme numa rede de fibrina. O resultado é um coágulo de fibrina obtido no meio do tubo entre os glóbulos vermelhos (red corpucules base RCB) do fundo do tubo e o plasma acelular, resultante de uma polimerização natural e progressiva que ocorre durante a centrifugação (acelular plasma platelet poor plasma, PPP) no topo (Dohan et al., 2006).

24 23 Destaca-se que estudos recentes têm reconhecido a importância do PRF na regeneração óssea. Tsai et al. (2009), investigaram os efeitos biológicos do PRF em fibroblastos gengivais humanos, nas células do ligamento periodontal, nas células epiteliais orais e nos osteoblastos. Uma cultura revelou que o PRF estimulou a proliferação celular de osteoblastos, das células do ligamento periodontal e dos fibroblastos gengivais sugerindo que pode ser benéfico para a regeneração periodontal. Wu et al. (2012), conduziram um estudo para determinar os efeitos do PRF na adesão celular, proliferação, proteína quinase B (PKB), proteína de choque térmico 47 e expressão lisil oxidase em osteoblastos humanos. Concluindo que o PRF é capaz de aumentar a fixação dos osteoblastos, a proliferação e, simultaneamente, regular a produção de proteína relacionada com o colágeno os quais promovem efetivamente a regeneração óssea. A preparação dos alvéolos após extração é uma questão diária desde que a reabsorção óssea após a avulsão dos dentes pode comprometer tanto a colocação de implantes como os resultados estéticos. Por esta razão, recomenda-se frequentemente inserir um material de enchimento no interior do alvéolo para manter o volume ósseo adequado. Muitos substitutos ósseos funcionam principalmente como mantenedores de espaço. No entanto, estes materiais são muitas vezes bastante lentos para reabsorver e remodelar, e seu uso muitas vezes atrasa a vascularização e regeneração óssea no alvéolo. Além disso, a administração do tecido mole sobre o enxerto requer a execução de retalho, dissecção extensa, e incisões verticais, a fim de cobrir o volume enxertado, reduzindo a microvascularização nas margens. Indicado para esta situação, as membranas de PRF atuam nas seguintes formas como um coágulo de sangue otimizado para melhorar o processo de cicatrização natural (Del Corso,et al., 2012). A incorporação intrínseca das citoquinas dentro das malhas de fibrina permite a sua liberação progressiva ao longo do tempo (7-11 dias), tal como a rede de fibrina se desintegra (Toffler et al., 2009) Embora as plaquetas e as citoquinas leucocitárias tenham um

25 24 papel importante na biologia deste biomaterial, a matriz de fibrina suportando-as constitui o elemento determinante responsável pelo verdadeiro poder terapêutico do PRF. Citoquinas são rapidamente usadas e destruídas num local em cicatrização. A sinergia entre as citoquinas e a matriz de fibrina que a suporta tem mais importância do que qualquer outro parâmetro. Uma matriz de fibrina fisiológica (como o PRF) vai ter efeitos diferentes de um adesivo de fibrina enriquecido com citoquinas (como o PRP) que terá um efeito incontrolável de curto tempo (Toffler et al., 2009). Segundo Wu et al. (2012), o plasma rica em fibrina (PRF) preparado pela técnica de Choukroun é derivada a partir de uma preparação de concentrado de plaquetas autógenas sem qualquer manipulação. O PRF foi encontrado para aumentar o crescimento e proliferação de osteoblastos. No entanto, os mecanismos subjacentes ainda não estão completamente esclarecidos. Os autores destacam que a PRF sozinha foi encontrada para estimular a fixação de células U2OS em comparação com controles não tratados (p <0,05). O PRF foi encontrada para aumentar a proliferação de osteoblastos, durante um período de incubação de 5 dias (p <0,05) e para aumentar a fosforilação de AKT numa forma dependente do tempo (p <0,05). Os autores sugeriram que a PRF é capaz de aumentar a fixação dos osteoblastos, proliferação e regulação positiva simultaneamente à produção de proteínas relacionadas com o colágeno. Estas ações em combinação seriam efetivamente para promover a regeneração óssea. As plaquetas são células pequenas, com cerca de 2-4 µm de diâmetro, anucleares e de forma irregular; têm um papel fundamental na hemostase e são uma fonte natural de fatores de crescimento (FC). Os FC são liberados pela ativação das plaquetas por estímulos ou substâncias como: trombina, cloreto de cálcio, colágeno ou adenosina 5c-difostafo (Sammartino et al., 2011).

26 25 3 PROPOSIÇÃO O objetivo desse trabalho foi realizar uma avaliação histométrica de biopsias removidas de levantamentos de seios maxilares, utilizando coágulo sanguíneo ou plasma rico em fibrina. Para tal propósito foi empregada a avaliação de porcentagem de tecidos moles e porcentagem de tecido duro em amostras do sítio cirúrgico.

27 26 4 MATERIAIS E MÉTODOS 4.1 Amostra Este é um estudo prospectivo clínico, onde os voluntários receberam inicialmente uma explicação da natureza e importância do estudo, os que aceiram participar assinaram o Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (TCLE) que informou as particularidades inerentes à participação na pesquisa, assim como sobre o desenvolvimento da mesma e a possibilidade de desistência da pesquisa a qualquer momento. Foram selecionados 13 indivíduos de ambos os gêneros, com idade variando entre 34 a 68 anos, apresentando ausência de elemento dentário na região posterior da maxila sendo candidatos a tratamento reabilitador no curso de mestrado do Centro Universitário da Fundação Educacional de Barretos UNIFEB e Instituto Amazônia de Ensino Superior IAES, onde seu respectivos panejamentos indicaram a necessidade de elevação sinusal para permitir o tratamento de implante dentário. Como critérios para inclusão no estudo constam: edentulismo total ou parcial com pneumatização uni ou bilateral, altura inferior a 5mm medindo da crista óssea alveolar até o assoalho do seio maxilar, ausência de doença periodontal e alteração sistêmica. Foram excluídos da pesquisa os indivíduos que apresentaram infecção na região cirúrgica, histórico de distúrbio hemorrágico ou em terapia anticoagulante ou em estado imunocomprometido, tabagistas e acometidos por doença debilitante. Radiografias panorâmicas foram utilizadas para avaliar altura óssea e verificação de patologias sinusais. Nenhum dos pacientes apresentaram patologias significativas ou estavam dentro dos critérios de exclusão. Dessa forma, todos foram submetidos à cirurgia de elevação sinusal.

28 Desenho Experimental A técnica cirúrgica consiste no bloqueio regional dos nervos infraorbitário e alveolar superior posterior associado a técnica infiltrativa dos nervos nasopalatino e palatino maior (articaina 4% - 1: DFL ) da área correspondente ao seio maxilar. A incisão foi realizada linear à crista do rebordo levemente deslocado para o lado palatino, com uma incisão relaxante mesial oblíqua a fim de permitir uma boa visualização do campo operatório, procedendo o deslocamento do retalho total para a exposição da parede vestibular na região do seio maxilar (Figura 1). Figura 1: Incisão linear à crista do rebordo levemente deslocado para o lado palatino, com uma incisão relaxante mesial oblíqua. Após a completa visualização do campo operatório, foi realizado uma osteotomia seguindo as delimitações anatômicas da região, realizada com auxílio de uma broca diamantada esférica número 6 (KG SORENSEN ), acoplada a uma peça reta cirúrgica redutora de 1/1 (Kavo ) sob irrigação abundante de cloreto de sódio 0,9% (Figura 2).

29 28 Figura 2: Osteotomia na parede vestibular do seio maxilar. No intuito de preservar ao máximo a janela cirúrgica foi realizado cuidadosamente o deslocamento da membrana sinusal sem que ocorresse seu rompimento com curetas específicas para essa abordagem (Neodent ), a janela óssea confeccionada foi rebatida para o interior do seio maxilar, em seguida foi adaptada uma membrana absorvível (BIONOVATION ) protegendo a membrana sinusal (Figura 3). Figura 3: Deslocamento da parede vestibular e elevação da membrana sinusal.

30 29 Foram transfixados os parafusos de enxertia 1.5mm de diâmetro por 13mm de comprimento (TITANIUMFIX ) através da crista óssea alveolar, tendo duas funções auxiliar a estabilização da membrana não absorvível (BIONOVATION ) em sua porção inferior e também criar suporte para a cortical óssea que foi deslocada para o interior do seio maxilar, criando assim um novo assoalho de seio maxilar e dando a característica de paus de barraca (Figura 4). Figura 4: Parafusos de enxertia 1.5mm de diâmetro por 13mm de comprimento (TITANIUMFIX ) através da crista óssea alveolar. A membrana não absorvível é então posicionada na face vestibular do acesso cirúrgico e estabilizada com auxílio de tachinhas (Dentoflex ) na porção superior da maxila afim de impedir a invaginação do tecido conjuntivo para dentro da cavidade do seio maxilar e permitir a formação e estabilização do coágulo sanguíneo (Figura 5). A cirurgia foi finalizada com suturas interrompidas simples com fio de nylon 4-0 (Ehtnow ).

31 30 Figura 5: Membrana não absorvível fixada com auxílio de tachinhas (Dentoflex ), na região vestibular do acesso cirúrgico. Os pacientes receberam orientações e cuidados pós-operatórios e os que faziam uso de próteses móveis, foram orientados a não utilizarem as mesmas. Foi prescrito medicação sistêmica constituída por antibiótico (Amoxicila 500mg, 8/8h, 7 dias), antiinflamatório (Nimesulida 100mg, 12/12h, 5 dias) e analgésico (Dipirona Sódica 500mg, 6/6, 3 dias) e medicação tópica através da aplicação de digluconato de clorexidina a 0,12% (Periogard ). A sutura foi removida após 14 dias e as próteses móveis foram reembasadas (COECONFORT ). 4.3 Obtenção das Amostras Decorridos 6 meses de pós-operatório foram solicitadas novas panorâmicas e realizadas as cirurgias para remoção das biópsias e instalação dos implantes. No momento da reabertura desses sítios cirúrgicos para a instalação dos implantes foram realizadas biópsias através do uso de uma broca trefina de 2mm de diâmetro externo (SIN, Sistemas de Implantes), montada em contra-ângulo redutor 20:1 com velocidade de rpm sob irrigação abundante de cloreto de sódio a 0,9%. As biópsias

32 31 foram coletadas nas regiões que coincidiam com o local em que os implantes foram instalados, a remoção foi realizada no sentido vertical e com movimento único, removendo em uma mesma amostra tanto o leito ósseo remanescente como o enxerto ósseo neoformado e em seguida os implantes foram instalados (Figura 6). Figura 6: Tecido da biopsia removido com broca trefina 2mm (SIN, Sistemas de Implantes) Após a retirada das biópsias e instalação dos implantes foi realizada a sutura e aguardado um período de 10 dias para sua remoção, após 6 meses os pacientes foram submetidos aos procedimentos de instalação dos cicatrizadores para enfim dar início as etapas reabilitadoras implanto-suportadas. 4.4 Processamento das Amostras Os espécimes foram submetidos à lavagem em água, e imersos em solução desmineralizadora (constituída de tampão fosfato-salina - PBS - acrescida de 10% de ácido etilenodiamino tetra-acético - EDTA, durante 30 dias). Após a desmineralização, as amostras foram lavadas em água, desidratadas, diafanizadas, impregnadas em parafina, incluídas em parafina e seccionadas em micrótomo com 4 µm de espessura. A microtomia foi executada

33 32 seguindo o plano longitudinal das amostras. Foram coletados cortes seriados da porção central dos espécimes, os quais foram submetidas à coloração pela hematoxilina e eosina (HE). 4.5 Análise das Amostras As secções histológicas foram analisadas sob iluminação de campo claro em microscópio óptico (Axiolab, Carl Zeiss). Foi utilizada uma secção histológica do centro de cada uma das amostras para se efetuar a análise histométrica. Nesta secção foram analisadas com um aumento de 50x duas áreas de 5,88 mm 2 (2,8 mm x 2,1 mm), uma situada na porção mais rostral e outra na porção intermediária da amostra. Foram consideradas a porcentagem de tecido ósseo (PTO) e porcentagem de tecidos moles (PTM) em cada espécime. A PTM consistiu naquela ocupada por tecido conjuntivo, tecido adiposo e tecido hematopoético (Figura 7). Foram capturadas imagens da área descrita acima via utilização de uma câmera digital (AxioCam, Carl Zeiss MicroImaging GmbH, Jena, Alemanha) acoplada a um microscópico óptico (Axiolab, Carl Zeiss MicroImaging GmbH, Jena, Alemanha) conectado a um microcomputador. Com auxílio do programa de análise de imagens (Axiovision 4.8.2, Carl Zeiss MicroImaging GmbH, Jena, Alemanha) foi mensurada a PTO e PTM.

34 33 PTO PT M PTO PT M Figura 7: Esquema representando uma secção longitudinal do centro de uma das amostras e as duas áreas onde se efetuou a análise histométrica da porcentagem de tecido ósseo (PTO) e porcentagem de tecidos moles (PTM). Para análise estatística dos dados foi utilizado o programa Bioestat 5.0 (Instituto Mamirauá, Manaus, Brazil). Foi empregado o teste estatístico T de Student. O nível de significância adotado foi de 5% (p < 0,05).

35 34 5 RESULTADOS 5.1 PTO e PTM em amostras do sítio cirúrgico O grupo PRF apresentou maior PTO (59,9 + 5,9), e menor PTM (40,1 + 5,9), quando comparado com o grupo CS (PTO, 43,9 + 7,6 - p<0,01; PTM, 56,1 + 7,6 - p<0,01) (Figura 8 e 9). Tais dados demonstram que no grupo PRP a neoformação óssea foi estimulada no sítio cirúrgico em comparação com o grupo CS. Tal estimulação resultou em alteração na composição tecidual do sítio cirúrgico, ou seja, houve aumento na proporção de tecido ósseo em relação aos tecidos moles, o que pode auxiliar tanto na estabilidade primária dos implantes, como em sua osseointegração. Figura 8: Gráfico evidenciando a PTO e PTM no sítio cirúrgico nos grupos CS e PRF. Teste estatístico: Teste T de Student. Símbolo:, diferença estatisticamente significante em comparação com o grupo CS.

36 35 Figura 9: Aspecto histológico de amostras do sítio cirúrgico dos grupos CS, Coagulação Sanguínea (A) e PRF, Fibrina Rica em Plaquetas (B). Fotomicrografias mostrando o predomínio de tecidos ósseo em relação aos tecidos moles no grupo PRF. Abreviações e símbolos: a, adipócito; tc, tecido conjuntivo; to, tecido ósseo; vs, vaso sanguíneo. Coloração: hematoxilina e eosina. Aumentos originais: A-B, 100x. Barras de escala: A-B, 100 µm.

37 36 6 DISCUSSÃO Palma e Oliveira (2006), relataram que estudos clínicos têm demonstrado que a neoformação óssea pode ser conseguida mediante a simples elevação da membrana sinusal, sem qualquer presença de biomaterial. Com a manutenção da membrana elevada, o espaço é totalmente preenchido por coágulo, induzindo a neoformação óssea. Entretanto esta técnica é bastante delicada, necessitando de boa experiência clínica para que a membrana não abaúle posteriormente. As análises morfométricas são descritas como um poderoso instrumento, o qual permite deduzir a quantidade de tecido e componentes celulares e também reforçar as análises feitas pela microscopia (Gundersen et al., 2006). O coágulo sanguíneo a partir das suas regiões periféricas, forma um tecido de granulação em direção central, finalizando esse processo com total substituição do coágulo sanguíneo pelo tecido formado, rico em alças vasculares, fibroblastos e células inflamatórias (Guimarães, 1982). A viabilidade do PRF no reforço da cicatrização do tecido ósseo é fundamentada na literatura. Porém, poucas evidências histológicas estão dispostas na literatura para elucidação da utilização de PRF ou de coágulo sanguíneo para instalação no sítio cirúrgico de elevação sinusal (Flores et al., 2012). Cricchio em 2011, realizou um estudo em 83 pacientes com atrofia da região posterior da maxila no qual 239 implantes foram instalados concomitantemente ao levantamento de seio maxilar preenchido somente com coágulo sanguíneo e obteve sucesso de 98,7% nos acompanhamentos de um a seis anos. Radiograficamente, esse autor observou formação óssea, e notou, ainda, que a quantidade de osso formado está relacionada ao comprimento do implante, corroborando a situação encontrada neste caso, no qual também foi

38 37 constatado radiograficamente o ganho de altura óssea e onde a altura óssea final alcançou 8 mm com a instalação de um implante de 10mm. Estudos mostraram a utilização do PRF em procedimentos odontológicos, resaltando a relação do mecanismo de ação voltado para o fator de crescimento e incitam a aplicação em procedimentos de elevação sinusal, como na pesquisa apresentada, defeitos periodontais, cicatrização de feridas cirúrgicas e casos de recessões gengivais. o PRF tem sido estudado principalmente com a finalidade de aumento do osso e cicatrização do tecido mole em outros locais (Kundu et al., 2014). Zhang et al. (2012) analisaram a influência do PRF na promoção da regeneração óssea quando associado a um xenoenxerto na elevação do seio maxilar. Os xenoenxertos são enxertos em que a sua espécie difere daquela onde vão ser enxertados. Para este estudo foram selecionados dez pacientes com o maxilar posterior atrófico; o grupo teste foi constituído por seis elevações do seio maxilar que foram tratadas com Bio-Oss misturado com PRF e o grupo de controle foi formado por cinco seios atróficos, tratados apenas com Bio-Oss. Nos seis meses seguintes, a cicatrização ocorreu sem complicações, para todos os pacientes; as radiografias pós-operatórias revelaram a presença de tecido mineralizado, em quantidade e densidade adequadas em todos os casos. Foram executadas biopsias e as características ósseas foram analisadas histologicamente: tanto as biopsias de PRF como as do grupo de controle, mostraram composição e distribuição muito semelhantes das estruturas histológicas e sem sinais significativos de reação inflamatória. Quanto à formação de novo osso, a percentagem no grupo em que foi utilizado PRF foi, aproximadamente, 1,4 vezes, superior, quando comparado com o grupo de controle. Relativamente à quantidade de Bio-Oss residual presente, bem como ao tamanho do contato entre o Bio-Oss e o novo osso formado, não se observaram diferenças estatisticamente significativas.

39 38 Nos resultados ora apresentados, o grupo PRF apresentou maior PTO (59,9 + 5,9), e menor PTM (40,1 + 5,9), quando comparado com o grupo CS (PTO, 43,9 + 7,6 - p<0,01; PTM, 56,1 + 7,6 - p<0,01). No grupo PRF a proporção de tecido ósseo foi superior aquela de tecidos moles, enquanto que no grupo CS a proporção de tecidos moles foi superior aquela de tecido ósseo, não havendo relevância clinica nos procedimentos realizados.

40 39 7 CONCLUSÃO O planejamento cirúrgico é a etapa mais importante para a realização de qualquer procedimento clínico, e influencia diretamente na escolha do material e técnica à ser utilizada na elevação sinusal. Após a realização da pesquisa clinica e bibliográfica, conclui-se que o plasma rico em fibrina proporcionou maior densidade de tecido ósseo em comparação com o coágulo sanguíneo, demostrando o potencial regenerativo do biomaterial.

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