Análise Proteômica dos Corações Hipertróficos de Animais C57BL6 Induzida por Isoproterenol

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1 Universidade Federal de Minas Gerais Instituto de Ciências Biológicas Departamento de Bioquímica e Imunologia Christiane Freitas Abreu Mendes Análise Proteômica dos Corações Hipertróficos de Animais C57BL6 Induzida por Isoproterenol Belo Horizonte, 2013

2 Christiane Freitas Abreu Mendes Orientador: Dr. Jader Santos Cruz - UFMG Co-Orientadora: Dra. Suely Gomes de Figueiredo - UFES Análise Proteômica dos Corações Hipertróficos de Animais C57BL6 Induzida por Isoproterenol Dissertação de mestrado apresentada ao Departamento de Bioquímica e Imunologia do Instituto de Ciências Biológicas da Universidade Federal de Minas Gerais como requisito para a obtenção do título de Mestre em Bioquímica e Imunologia. Belo Horizonte, 2013

3 Christiane Freitas Abreu Mendes Orientador: Jader Santos Cruz - UFMG Co-Orientadora: Suely Gomes de Figueiredo - UFES Análise Proteômica dos Corações Hipertróficos de Animais C57BL6 Induzida por Isoproterenol Área de concentração: Bioquímica Data de apresentação: 20 de Dezembro de 2013 Resultado: Examinadores: Dra. Fabiana Simão Machado Universidade Federal de Minas Gerais Dr. Daniel Moreira dos Santos Universidade Federal de Minas Gerais Orientador: Dr. Jader dos Santos Cruz Universidade Federal de Minas Gerais Co-Orientadora: Dra. Suely Gomes de Figueiredo Universidade Federal do Espírito Santo

4 AGRADECIMENTOS Agradeço a todos que de alguma forma contribuíram para o desenvolvimento deste trabalho e a Deus acima de tudo.

5 DEDICATÓRIA Dedico este trabalho à Dona Leila, minha mãe.

6 6 INDEX Lista de figuras...9 Lista de Tabelas...11 Lista de Abreviatuas...12 Introdução...14 Compreendendo Melhor o Coração...14 Microestrutura do Coração...18 A Importância dos Canais Iônicos para a Atividade Cardíaca...20 Hipertrofia Cardíaca...22 Mecanismos Moleculares da Hipertrofia Cardíaca...26 O Papel dos Canais Sensíveis a Voltagem no Processo Hipertrófico Patológico...27 A Função do ANP e do BNP...29 O Uso de Agonistas dos Receptores Beta Adrenérgicos e a Indução da Hipertrofia Cardíaca...30 Objetivos...32 Métodos...34 Aspectos Éticos...35 Indução da Hipertrofia Cardíaca...35 Análises Histomorfométricas...36 Preparo das Lâminas Histológicas...36 Dosagem de ANP...38 Mensuração da Expressão de Canais para Cálcio...40

7 7 Análise Estatística dos Parâmetros Morfométricos...41 Análise Proteômica...42 Obtenção do Extrato Protéico dos Ventrículos Esquerdos...42 Eletroforese Bidimensional...43 Focalização Isoelétrica...43 Redução e Alquilação das Proteínas Eletrofocalizadas...44 Eletroforese em Gel de Poliacrilamida...44 Aquisição, Processamento e Análise das Imagens...45 Identificação das Proteínas Diferencialmente Expressas entre os grupos...46 Digestão das Proteínas, Extração dos Peptídeos e Análise por Espectometria de Massas...46 Pesquisa em Bancos de Dados...46 Análise Estatística dos Experimentos de Proteômica...48 Resultados...49 Indução da Hipertrofia Cardíaca...50 Parâmetros Morfométricos...50 Parâmetros Histomorfométricos...56 Determinação do Nível de Expressão das Proteínas dos Canais para Cálcio do Tipo T e L por Western Blot...58 Análise Proteômica...59 Análise Comparativa dos Géis Bidimensionais dos

8 8 Extratos Protéicos do Ventrículo Esquerdo...59 Identificação das Proteínas...62 Discussão...69 Indução da Hipertrofia Cardíaca...70 Análise Proteômica...76 Conclusão...89 Referências...91

9 9 LISTA DE FIGURAS Figura 1: Ilustração de um corte transversal identificando as suas cavidades cardíacas bem como suas atérias e valvas componentes...15 Figura 2: Micrografia eletrônica das miofibrilas unidades básicas do tecido cardíaco...19 Figura 3: Desenho esquemático apresentando como seria a interação entre as bandas A, I e linhas Z...19 Figura 4: Potencial de ação do músculo cardíaco mostrando suas cinco fases componentes...21 Figura 5: Número de brasileiros mortos por ano devido a problemas associados ao aparelho circulatório...23 Figura 6: Perfil de expressão dos canais para cĺacio do tipo T e tipo L no coração ao longo do desenvolvimento...28 Figura 7: Exemplo de cardiomiócito contendo núcleo oval, claro e central que foi utilizado nas medidas de diâmetro das células cardíacas...35 Figura 8: Valores absolutos obtidos para massa do coração; ventrículo esquerdo; e dos átrios de animais do grupo controle e tratado...48 Figura 9: Variação da massa corporal dos animais ao longo do tratamento com isoproterenol e solução salina...49 Figura 10: Correlações obtidas para os grupos controle e tratado da massa do coração vs massa corporal; e da massa do coração vs tamanho da tíbia...50 Figura 11: Relação morfométrica entre a massa do ventrículo esquerdo e massa corporal; massa do coração; e tamanho da tíbia...51 Figura 12: Dosagem de ANP presente nos átrios de animais do grupo controle e tratado por RIE...52

10 10 Figura 13: Diâmetro aferido das células cardíacas em animais do grupo controle e animais do grupo tratado...53 Figura 14: Contagem dos miócitos cardíacos nos grupos controle e tratado em um total de 40 micrografias para cada grupo...53 Figura 15: Micrografia representativa do tecido de um animal controle e de um animal tratado com isoproterenol...54 Figura 16: Micrografias do tecido cardíaco de animais do grupo controle e tratado com isoproterenol...55 Figura 17: Células sanguíneas encontradas fora dos vasos e entre as fibras musculares cardíacas...56 Figura 18: Expressão protéica de canais para cálcio do tipo T e L em animais controle e tratados com isoproterenol...57 Figura 19: Perfil protéico de amostras de ventrículos esquerdos dos animais dos grupos controle e tratado...58 Figura 20: Gráfico de análise de fatores onde há a projeção dos géis analisados para o delineamento dos grupos experimentais...60 Figura 21: Figura esquemática mostrando o processo de análise de um spot protéico ente dois grupos distintos...61

11 11 LISTA DE TABELAS Tabela 1: Composição dos tubos utilizados na dosagem de ANP por RIE...37 Tabela 2: Correlações obtidas a partir das massas dos átrios quando comparadas às massas corpóreas, do caoração e ao tamanho da tíbia...52 Tabela 3: Análise do tamanho do coração; da espessura do ventrículo esquerdo; do diâmetro do ventrículo esquerdo; e do diâmetro dos átrios...55 Tabela 4: Análise de reprodutibilidade dos géis...59 Tabela 5: Identidade dos spots protéicos diferencialmente expressos entre os grupos controle e tratado por MS e MS/MS...63 Tabela 6: Dados das proteínas diferencialmente expressas entre os grupos...65

12 12 LISTA DE ABREVIATURAS ANP Peptídeo atrial DVE Diâmetro do ventrículo natriurético esquerdo BDNF Fator neurotrófico EDTA Ácido etilenodiamino derivado do cérebro (do inglês tetra-acético Brain derived neurothrophic factor) BK Branco BSA Albumina de soro bovino (do inglês Bovine serum albumin) CaCl2 Cloreto de cálcio CaMK Calmodulina quinase CaMKII Calmodulina quinase II Cav 2.1 Canais para cálcio GSK3b Glicogênio sintase quinase 3 beta IP3 Inositol-3-fosfato 125 I Iodo 125 radioativo JNK Quinases Jun N terminal (do inglês Jun N-terminal kinases) HCl Ácido clorídrico KCl Cloreto de Potássio MAPK MAP quinase dependentes de voltagem do MAts Massa dos átrios tipo 2.1 MCr Massa do coração Cav 3.2 Canais para cálcio MgCl2 Cloreto de magnésio dependentes de voltagem do tipo 3.2 CPM Contagem por minuto DA Diâmetro dos átrios DAG Diacil glicerol DTT Ditiotreitol MM Massa molecular mrna RNA mensageiro MS Espectometria de massa (do inglês Mass spectometry) MVe Massa do ventrículo

13 13 esquerdo NaCl Cloreto de sódio NaNO3 Nitrato de sódio NFAT Fator nuclear de células T ativadas (do inglês nuclear factor of activated T cells) NL Não linear RyR2 Receptores de rianodina SDS Sódio duodecil sulfato SDS-PAGE gel de poliacrilamida com sódio duodecil sulfato SERCA ATPases transportadoras de cálcio do PI Ponto isoelétrico retículo sarcoplasmático (do PKC Proteína quinase C inglês Sarcoplasmic reticulum PLB Fosfolambam PMSF Ácido Fenil metil calcium-transporting ATPases) SNC Soro normal de coelho sulfonil fluorídrico ( do inglês TC Tamanho do coração phenylmethylsulfonyl fluoride) TEMED tetrametiletileno PVDF - Polivinilideno diamina ranp ANP radioativo TFA Ácido trifluoroacético RE Retículo Endoplasmático UFES Universidade Federal ROS Espécies reativas de do Espírito Santo oxigênio (do inglês Reactive UFMG Universidade Federal oxigene species) de Minas Gerais VE Ventrículo esquerdo

14 Introdução

15 INTRODUÇÃO 1.2 COMPREENDENDO MELHOR O CORAÇÃO O coração, órgão pulsátil tetracavitário, tem sido considerado desde os primórdios da ciência como uma das principais peças em seres humanos. Para o filósofo grego Aristóteles, que observou o coração de galinhas, este órgão seria o primeiro a se formar durante o desenvolvimento dos organismos que possuem sangue e portanto, atribuiu a ele importância maior que todos os demais componetes de um ser vivo. O coração é composto por quatro câmaras bombeadoras, dois átrios (superiores) e dois ventrículos (inferiores), sendo que a musculatura dos ventrículos é consideravelmente mais espessa que a dos átrios uma vez que aqueles estão sujeitos a maiores pressões. A função destas câmaras é bombear o sangue, através dos grandes vasos localizados na base do órgão, em direção aos tecidos de forma a remover os resíduos provenientes do metabolismo das células além de transportar nutrientes, oxigênio e mensageiros, como hormônios e neurotransmissores. A figura 1 mostra um desenho esquemático das cavidades e vasos que compõem o coração. Fig. 1: Ilustração de um corte transversal identificando as suas cavidades cardíacas bem como suas artérias e valvas componentes.

16 16 Como é possível observar pela figura, na margem superior direita está localizada a veia cava que desemboca no átrio direito, e na margem superior esquerda a artéria pulmonar que recebe o sangue vindo do ventrículo direito. Entre estes vasos encontra-se a artéria aorta que está diretamente conectada ao ventrículo esquerdo. Lateralmente à aorta estão as veias pulmonares que direcionam o sangue vindo dos pulmões para o átrio esquerdo. No ápice localiza-se a junção das paredes ventriculares e o septo ventricular. Revisto por Fuster et al., O sangue venoso originário dos tecidos chega ao coração via veia cava superior e desemboca no átrio direito, onde é armazenado durante a sístole ventricular. Durante a diástole ventricular o sangue flui através da valva tricúspide em direção ao ventrículo direito que então bombeia o sangue para a artéria pulmonar atravessando a valva semi-lunar. Este sangue circula pelo pulmão onde ocorre a liberação de CO 2 e a oxigenação da hemoglobina. O átrio esquerdo recebe o sangue oxigenado através das veias pulmonares e durante a sístole atrial provê sangue ao ventrículo esquerdo fazendo-o distender e preparando-o para ejeção. À medida que a contração ventricular aumenta, a valva átrio-ventricular se fecha, a valva semi-lunar se abre e o sangue é direcionado para a aorta. Este processo é seguido da diástole atrial e ventricular reiniciando o ciclo cardíaco (Fuster et al., 1998). Para suprir as necessidades fisiológicas de um indivíduo as câmaras cardíacas precisam realizar movimentos de contração e relaxamento de maneira sincronizada aproximadamente setenta vezes a cada minuto e cem mil vezes ao longo de um dia. Em uma pessoa com setenta anos de idade o coração terá batido mais de dois bilhões de vezes sem nenhuma pausa. A observação do médico e filósofo Cláudio Galeno de que as fibras cardíacas superam todos os demais tecidos em resistência a injúrias, tensão e força é aceita ainda hoje pela comunidade científica como verdadeira. A fim de realizar o bombeamento de sangue de maneira síncrona, o coração utiliza de diferentes tipos celulares como os miócitos contráteis, especializados na contração; as fibras de Purkinje, especializadas na

17 17 condução rápida dos estímulos elétricos; e as células nodais responsáveis pela atividade de marca-passo. Cada um deles com papel fundamental para a atividade cardíaca (Katz A. M., 1992). Além disso, o nodo sinoatrial, uma pequena área especializada localizada entre a veia cava superior e o átrio direito que contém tecido nervoso além outros tipos celulares, espontaneamente despolariza-se e envia sinais elétricos que estimulam a contração dos átrios forçando a passagem de sangue para os ventrículos. A sístole ventricular inicia-se quando o estímulo elétrico é propagado em direção ao ápice cardíaco através do nódulo átrio-ventricular. Este impulso entra então no sistema His- Purkinje e determina a contração ventricular. A sincronia da atividade de contração e relaxamento destas duas câmaras é dada também por um complexo sistema de membranas e compartimentos intracelulares que permitem a comunicação íntima entre as células e um rápido fluxo de informação (estímulos elétricos e/ou mensageiros moleculares) através do tecido cardíaco (Boyden et al., 2010) (Katz, A. M., 1992) (Fabiato and Fabiato, 1972) (Silverman et al., 2006). Além de sua função contrátil, o coração também apresenta atividade endócrina. Se observados ao microscópio óptico de luz, os miócitos cardíacos atriais apresentam grânulos densamente corados que representam estoques intracelulares do peptídeo atrial natriurético (ANP) (Lattion et al., 1986). Desta forma, o coração não é apenas uma bomba, mas também um órgão endócrino. Pequenas quantidades de ANP e de BNP ( brain natriuretic peptide ), uma molécula estruturalmente relacionada ao ANP, são também encontradas nos ventrículos, porém em pequenas quantidades. Estes peptídeos são liberados dos estoques internos quando as paredes dos átrios e/ou ventrículos são distendidas e podem ser vistas como sensores de volume (Lattion et al., 1986; Katz, 1992). O ANP é encontrado como um hormônio circulante e atua também em diversos processos biológicos como vasodilatação, diurese, natriurese, regulação da pressão sanguínea e inibição da secreção de renina e aldosterona (de Bold, 1985; Laragh, 1985; Cantin and Genest, 1987).

18 MICROESTRUTURA DO CORAÇÃO Uma análise microscópica da estrutura dos cardiomiócitos mostra que aproximadamente metade do volume destas células é ocupada por miofibrilas, o arranjo molecular básico do tecido cardíaco que executa a contração. Cada miofibrila é constituída principalmente das proteínas actina, miosina e titina, além do envoltório que as mantém unidas. Estas proteínas se organizam de maneira a formar filamentos finos (dupla fita de actina juntamente com tropomiosina e três proteínas do complexo troponina) e filamentos grossos (polímeros de miosina e titina). O encurtamento do músculo cardíaco durante a contração é dado pelo deslizamento dos filamentos finos sobre os filamentos grossos. O restante da célula é densamente ocupada por mitocôndrias responsáveis suprir o tecido com energia suficiente para realizar o bombeamento vigoroso e contínuo de sangue (Stenger and Spiro, 1961; Katz, 1992). Na figura 2, a região de coloração escura contêm os miócitos responsáveis pela contração e é denominada banda A. A região mais clara, banda I, contém apenas os filamentos finos. Cada banda I é delimitada por uma linha altamente corada, a linha Z. Um sarcômero está contido entre duas linhas Z e é composto, portanto, por uma banda A e duas bandas I. O disco intercalar representa uma junção célula-célula e apresentam baixa resistência elétrica. A figura 3 apresenta um esquema simplificado de um sarcômero e seus componentes.

19 19 Fig. 2: Micrografia eletrônica das miofibrilas unidades básicas do tecido cardíaco. (M) mitocôndrias; (Z) linha Z; (D) disco intercalar; (L) lipídeos; (A) banda A; (I) banda I; Adaptado de Katz et al. Fig. 3: Desenho esquemático apresentando como seria a interação entre as bandas A, I e linhas Z. Adaptado de Ferreira-Castro, 2011.

20 A IMPORTÂNCIA DOS CANAIS IÔNICOS PARA ATIVIDADE CARDÍACA A partir da descoberta de que o cálcio seria o mensageiro responsável pela ativação das proteínas contráteis, C. A. V Hill concluiu ainda em 1949 que devido à intensa atividade cardíaca esse íon não poderia ser propagado por difusão através da superfície das células. De acordo com o autor, um estímulo excitatório deveria ser propagado ao interior da célula para ser controlado por mecanismos mais rápidos (Fabiato & Fabiato, 1979; Hill, 1949). Como predito por Hill, o coração de um mamífero adulto depende da interação de dois sistemas de membranas para superar as limitações impostas pela difusão e para realizar de maneira eficiente o processo de excitação-contração. O primeiro deles, denominado túbulos transversos (ou túbulos-t) são projeções da membrana plasmática que rapidamente propagam os potenciais de ação para o interior das células cardíacas. O segundo sistema, o retículo sarcoplasmático (RS), é uma região especializada do retículo endoplasmático capaz de armazenar íons cálcio. A propagação do potencial de ação através dos túbulos-t e a liberação e recaptação de cálcio pelo RS explica a rápida atividade cardíaca. Juntamente com este complexo sistema de membranas, os canais iônicos, poros transmembranares que permitem a passagem seletiva de substâncias carregadas através da bicamada lipídica, controlam o fluxo rápido de informações entre o meio extracelular e o intracelular bem como entre duas células justapostas (Hille, 2001). Uma elaborada sequência de abertura e fechamento de canais iônicos resulta em mudanças no potencial elétrico através da membrana plasmática que, dependendo da magnitude, pode desencadear o potencial de ação. No coração, o potencial de ação consiste em diversas fases (Fig. 4) que podem ser diferentes de acordo com a região analisada. Em cada fase podemos identificar a prevalência do fluxo de um íon específico sem entretanto, alterar a composição química do meio intracelular (Katz, 1992; Hille, 2001)).

21 21 Fig. 4: Potencial de ação do músculo cardíaco mostrando suas cinco fases componentes (0-4). O eixo X representa o tempo e milisegundos e o eixo Y representa o potencial de membrana em milivolts. Adaptado de Katz, A.M. De maneira simplificada, o potencial de ação cardíaco dura aproximadamente 300ms e consiste em cinco fases: fase zero (despolarização, onde cátions sódio fluem em direção ao citossol); fase 1 (repolarização inicial, relativa à saída de íons potássio para o meio extracelular); fase 2 (plateau, onde há um intercâmbio de íons em ambas as direções sendo que as correntes de saída de potássio são balanceadas pelas correntes de entrada de cálcio); fase 3 (repolarização consistindo basicamente pela saída de íons potássio); e fase 4 (correspondente ao potencial de repouso) (Draper And Weidmann, 1951; Katz, 1992; Hille, 2001). Assim, o fluxo de íons através de canais dependentes de voltagem regulam não apenas os batimentos cardíacos através do potencial de ação mas também são responsáveis pela despolização do nodo sinoatrial e sua consequente atividade de marca-passo; e são os principais responsáveis pelo transporte de informação para o interior da célula (que é feito especialmente através do influxo de íons cálcio) (Carmeliet And Lacquet, 1956) (Guilbault and Coraboeuf, 1965). Além dessas funções no coração de um indivíduo

22 22 adulto, os canais iônicos, particularmente os canais para cálcio dependentes de voltagem do tipo T (Cav. 3.2) e do tipo L (C av. 2.1) têm papel fundamental no correto desenvolvimento do coração durante o estágio embrionário. C av. 3.2, prevalece principalmente nos estágios precoces do desenvolvimento do embrião enquanto Cav. 2.1 se torna mais abundante a partir do nascimento do indivíduo (Yasui et al., 2005). O controle da expressão dos genes para estes canais em cada estágio de vida é, portanto, necessário para a correta formação do sistema circulatório e para a fisiologia cardíaca saudável em um indivíduo adulto como discutiremos posteriormente. 1.5 HIPERTROFIA CARDÍACA A falência cardíaca é uma desordem clínica grave que representa a causa primária de internações hospitalares e morte na Europa e nos Estados Unidos. Devido a alta prevalência na população americana (em torno de 10%) aproximadamente 28 bilhões de dólares são gastos anualmente com tratamento pelo governo americano. No mundo, mais de 15 milhões de pessoas são acometidas por esta doença, sendo o grupo de risco composto por hipertensos, fumantes, diabéticos, pessoas que já sofreram infarto ou possuem alguma doença que afete as artérias coronárias (Srivastava et al., 2008)(Rapp, 2000)(Mill et al., 1998)(Widgren et al., 1993)(Cooper, 1987). No Brasil, o número de mortes por doenças associadas ao aparelho circulatório tem crescido assustadoramente ao longo dos anos de acordo com dados do Sistema Único de Saúde SUS (Fig. 5).

23 23 Fig. 5: Número de brasileiros mortos por ano devido a problemas associados ao aparelho circulatório. Freitas & Cruz, 2011 A maior parte das doenças que acometem o sistema cardiovascular prejudicam o fluxo sanguíneo e geram uma sobrecarga hemodinâmicca no coração. Portanto, para compensar essa redução no fluxo de sangue e suprir as demandas energéticas aumentadas do órgão, o coração precisa passar por um remodelamento morfológico e molecular que leva ao aumento em massa deste tecido. Esse estímulo, entretando, se persistente, gera danos ao coração e aumenta as taxas de morbidade e mortalidade dos pacientes (Mudd and Kass, 2008). A hipertrofia cardíaca é classificada em patológica e fisiológica: (i) Hipertrofia cardíaca patológica é aquela em resposta ao aumento no stress biomecânico induzido tanto por fatores extrínsecos (aumento de pressão e/ou volume em doenças como hipertensão e/ou disfunções nas válvulas cardíacas) ou em resposta a fatores intrínsecos (como o remodelamento cardíaco induzido por isquemia ou cardiomiopatias hipertróficas). O aumento em massa do órgão pode ser explicado pelo aumento nas dimensões do cardiomiócitos, aumento no número de células, e proliferação do tecido fibroso intersticial (Abduch et al., 2009; Du et al., 2010; Ieda and Fukuda, 2009). Além destas

24 24 alterações ainda são identificados um aumento no número de mitocôndrias, no número de miofibrilas por sarcômero e de sarcômeros em série (Anversa et al., 1984; Bernardo et al., 2010; Grossman et al., 1975).(ii) Hipertrofia cardíaca fisiológica é aquela que também induz ao aumento em massa do coração mas não acarreta danos como fibose, arritimias e falência do órgão, nem compromete a saúde do paciente. Este processo é comum em atletas e gestantes, pessoas que por certo período de tempo apresentam uma maior demanda energética. Diversos estudos tentam entender os mecanismos moleculares que determinam as principais consequências dos tipos de hipertrofia, com o objetivo de gerar conhecimentos para minimizar os danos em pacientes acometidos pela hipertrofia cardíaca patológica (Ligeti, 1960; Santacruz et al., 2013). Durante o processo hipertrófico patológico, o órgão passa por duas fases distintas, sendo a primeira chamada de compensatória e a segunda, descompensada. Durante a fase compensatória, a resposta do coração ao estímulo hipertrófico corresponde ao aumento no trabalho realizado e portanto, não exitem impactos negativos à sua morfologia e performance contrátil. Em contraste, a fase descompensada da hipertrofia cardíaca inicia-se logo após a fase compesada e é nesta fase onde se inicia processos de disfunção cardíaca e falência do órgão (Luethy et al., 1964; Meerson and P Ogosova, 1962). Caso a sinalização hipertrófica patológica persista, há um aumento exponencial do risco de falência cardíaca e/ou morte súbita. Essa observação sugere que a hipertrofia cardíaca apesar de ser considerada uma adaptação, se torna mal adaptativa e leva à falência cardíaca se prolongada. A falência aparece, portanto, como um desfecho desfavorável da hipertrofia cardíaca patológica (Bi, 2012; Clemo et al., 1998). No nível celular, a hipertrofia cardíaca patológica pode ser considerada como uma resposta dos cardiomiócitos ao estresse biomecânico incluindo o aumento da pressão e do volume saguíneos, espécies reativas de oxigênio, citocinas e neuro hormônios circulantes, os quais podem ativar

25 25 cascatas intrínsecas e específicas de sinalização. Muitas destas vias de sinalização terminam no núcleo com a ativação de fatores de transcrição, co-reguladores e micrornas levando à alterações na expressão gênica cardíaca (Chien et al., 1997; Swynghedauw, 1999; Swynghedauw et al., 2010). As alterações moleculares observadas durante o desenvolvimento do processo hipertrófico patológico são similares a aqueles observados durante o desenvolvimento fetal do coração e portanto, a hipertrofia cardíaca patólogica é frequentemente descrita como sendo acompanhada da reativação de genes fetais. Apesar da reativação deste programa gênico fetal ser apenas uma resposta adaptativa ao stresse, está claro que a expressão aberrante de genes fetais envolvidos na contratilidade, no mauseio do cálcio intracelular e também de moléculas envolvidas com processos energéticos levam a mudanças mal-adaptativas da função cardíaca (Haberland et al., 2009; Molkentin, 2004).

26 MECANISMOS MOLECULARES DA HIPERTROFIA CARDÍACA PATOLÓGICA Os processos que desencadeiam a hipertrofia cardíaca são considerados complexos e, apesar de muito estudados não são compreendidos em sua totalidade e diversos mecanismos já foram descritos como reguladores do processo hipertrófico patológico. Arber e colaboradores escreveram sobre a participação de proteínas do citoesqueleto e dos receptores ativados por estiramento (proteínas LIM) na cardiomiopatia dilatada (Arber et al., 1997), enquanto outros autores focaram-se nas complexas vias envolvendo quinases como a GSK3β, p38, MAPK, GATA-4, JNK e etc (Marber et al., 2011; Rohini et al., 2010; Sugden et al., 2008; Wilkins and Molkentin, 2004). Dentre os mecanismos propostos o mais bem estudado é o desencadeado pela ativação de receptores associados à proteína G. A partir da ligação de um agonista à proteína receptora de membrana, ocorre a dissociação do complexo alfa e beta-gama, componentes das proteínas G, levando e à ativação da fosfolipase C. Esta realiza a hidrólise de lipídios de membrana formando diacil glicerol (DAG) - responsável por ativar a proteína quinase C (PKC) que fosforila proteínas citosólicas e nucleares críticas para o crescimento celular - e inositol- 1,4,5-trifosfato (IP3) (Komuro et al., 1991; Poggioli et al., 1986; Sadoshima et al., 1992). O IP3 liga-se a receptores no retículo endoplasmático (RE) ou no envelope nuclear e mobiliza estoques internos de cálcio (Berridge, 2009). O cálcio liberado destes estoques associa-se à calmodulina quinase (CaMK) e ativa a fosfatase calcineurina. A calcineurina promove a ativação por desfosforição, de resíduos de serina no domínio N-terminal, do fator nuclear de células T ativadas (NFAT), o que possibilita seu translocamento para o interior do núcleo onde participa da transcrição de genes envolvidos na hipertrofia (Prasad and Inesi, 2011; Yamaguchi et al., 2011; Zarain-Herzberg et al., 2011). Parte dos genes ativados durante o remodelamento hipertrófico em um animal adulto atuam, em condições normais, durante o desenvolvimento embrionário e, portanto os

27 27 mecanismos moleculares da hipertrofia cardíaca estão associados à re-expressão de proteínas do estágio fetal como o ANP, a enzima conversora de angiotensina I, a subunidade beta da creatina quinase, a subunidade M da lactato desidrogenase, algumas isoformas de proteínas contráteis e de canais para cálcio do tipo T (Bjørnstad et al., 2012; Eppenberger-Eberhardt et al., 1990; Lompré et al., 1984; Naito et al., 2006; Weikert et al., 2003). Dependendo do estímulo, quinases presentes no núcleo podem cessar a expressão destes genes fetais a partir da fosforilação do NFAT, evento que determina o retorno desta molécula para o citosol. O cálcio liberado dos estoques internos participa ainda da acetilação de histonas, desenovelando-as do DNA e permitindo que algumas regiões do genoma estejam disponíveis para a transcrição (Haberland et al., 2009; Molkentin, 2006) O PAPEL DOS CANAIS PARA CÁLCIO SENSÍVEIS A VOLTAGEM NO PROCESSO HIPERTRÓFICO PATOLÓGICO O cálcio é o segundo mensageiro que controla o maior número de processos celulares inclusive a hipertrofia cardíaca. Durante a sinalização hipertrófica a dinâmica citosólica deste íon regula a atividade de proteínas como a calcineurina, a proteína quinase C (PKC) e a calmodulina quinase II (CaMKII) (Molkentin, 2006; Wilkins and Molkentin, 2004). Por influenciar diretamente diversas classes de proteínas intracelulares o fluxo de cálcio determina a regulação de processos importantes para o correto desenvolvimento e funcionamento da maquinaria celular, de órgãos e consequentemente para a sobrevida do indivíduo. Nas células cardíacas, o fluxo de cálcio é controlado principalmente por dois tipos de canais para cálcio ativados por voltagem: os canais do tipo T (Cav 3.2) e os canais do tipo L (Cav 2.1). Ambas as classes de canais coexistem em um indivíduo adulto saudável, entretanto há a prevalência de uma das classes dependendo do estágio de desenvolvimento do indivíduo. Yasui e colaboradores demonstraram em 2005 que durante o desenvolvimento de um indivíduo normal ocorre uma clara

28 28 inversão da concentração de canais para cálcio do tipo L e T (Yasui et al., 2005; Freitas and Cruz, 2011) (Figura 6). Fig. 6: Perfil de expressão dos canais para cálcio do tipo T e tipo L no coração ao longo do desenvolvimento. Adaptado de Yasui, 2005 No estágio embrionário, o cálcio necessário para ativar a contração lenta, característica dos miócitos cardíacos fetais, vem do fluido extracelular e atravessa a membrana plasmática majoritariamente por meio de canais para cálcio do tipo T. Para garantir a rápida contração dos cardiomiócitos de um coração adulto, é necessário que o cálcio extracelular induza a liberação de cálcio dos estoques internos (RS) processo conhecido como liberação de cálcio induzida por cálcio. Nesta fase do desenvolvimento o cálcio que flui para o interior da célula utiliza os portões para cálcio do tipo L. Alterações na atividade dos canais para cálcio do tipo L respondem por

29 29 patologias cardíacas como arritmias, mas não estão implicados no desenvolvimento da hipertrofia cardíaca (Houser, 2009). Por outro lado, a superexpressão de canais para cálcio do tipo T não induz ao desequilíbrio contrátil do coração, mas estimula a ativação de mecanismos pró-hipertróficos (Cribbs, 2010; David et al., 2010; Nakao et al., 2009). Desta forma, podemos entender que estes complexos macromoleculares, mais do que transportar íons através da bicamada lipídica, regulam o transporte de informações específicas ao interior da célula A FUNÇÃO DO ANP E DO BNP Assim como os canais para cálcio do tipo T, o ANP é estritamente controlado durante o desenvolvimento. Durante os estágios fetais essa molécula é abundantemente encontrada em miócitos ventriculares (especialmente no ventrículo direito) e após o nascimento são raramente detectadas nestas células em indivíduos saldáveis (Bloch et al., 1986; Tsuchimochi et al., 1987; Wei et al., 1987). Acredita-se que a produção e estocagem de ANP no ventrículo direito durante os estágios fetais sejam desencadeadas devido ao maior estresse mecânico desenvolvido por esta câmara durante as primeiras etapas do desenvolvimento. Em pacientes adultos com cardiomiopatia dilatada grave as fibras ventriculares (em especial as do ventrículo esquerdo) sintetizam e estocam novamente o ANP (Ding et al., 1987; French et al., 1988). Sabe-se que esse processo patológico é caracterizado por dilatação das câmaras ventriculares e aumento da resistência dos vasos aferentes, corroborando, portanto com a hipótese de que a produção e liberação do ANP ocorrem em condições de estresse e estiramento das câmaras cardíacas. A produção e secreção de BNP também podem estar alteradas em diversos quadros clínicos como durante a fibrilação atrial, doenças pulmonares, hipertensão, falência renal e sobrecarga de pressão ou volumétrica. A produção de BNP é desencadeada por estiramento mecânico e

30 30 pode ocorrer tanto nos átrios quanto nos ventrículos. O aumento na concentração deste peptídeo no plasma é associado com disfunção sistólica ventricular e é característico de diversas doenças cardíacas (Paelinck et al., 2006; Selvais et al., 1998). Apesar das evidências de que o BNP é secretado devido ao estiramento mecânico e à sobrecarga ventricular, há uma grande variação entre indivíduos tornando, portanto a interpretação dos níveis de BNP difíceis (Burke and Cotts, 2007). 1.6 O USO DE AGONISTAS DOS RECEPTORES BETA ADRENÉRGICOS E A INDUÇÃO DA HIPERTROFIA CARDÍACA No coração, a ativação de receptores beta adrenérgicos são responsáveis por modular a força e a frequência cardíaca (Kadambi et al., 1996). Diversos autores mostraram que a atividade simpática do sistema nervoso é importante para o desenvolvimento da insuficiência cardíaca (Bristow, 2003; Cohn et al., 1984; Kaye et al., 1995). Este sistema é responsável por liberar altas concentrações de catecolaminas na circulação resultando, portanto na ativação crônica dos receptores beta adrenérgicos. É possível que este seja um mecanismo compensatório para aumentar a contratilidade do órgão (Ni et al., 2011). Entretanto, a ativação sustentada destes receptores é nociva ao coração por induzir o crescimento patológico do órgão, disfunção ventricular, apoptose e insuficiência cardíaca (Port and Bristow, 2001). Desta forma, a ativação crônica dos receptores beta adrenérgicos contribui para a progressão de patologias cardíacas e aumenta a mortalidade tanto em modelo animal quanto em pacientes humanos. As cascatas intracelulares ativadas após estimulação beta adrenérgica envolvem a ativação da proteína quinase A (PKA) e consequente regulação das proteínas SERCA, fosfolamban (PLB), receptores rianodina (RyR2) e canais para cálcio do tipo L presentes no sarcolema. A hiperatividade dos RyR2 induzida pela fosforilação da PKA, provoca o vazamento de cálcio

31 31 do RS durante a diástole e consequentemente causa a depleção dos estoques internos de cálcio. Este processo contribui para o 'estresse do RS - um conhecido mecanismo indutor da insuficiência cardíaca, arterosclerose, isquemia e cardiomiopatia dilatada (Maier and Bers, 2007; Marx et al., 2000; Okada et al., 2004; Orrenius et al., 2003). Os modelos animais de cardiomiopatias são importantes para o estudo dos processos bioquímicos e cascatas celulares envolvidas no desenvolvimento patológico do coração. O entendimento destas vias fornece os substratos necessários à manipulação do sistema e elaboração de estratégias terapêuticas visando a reversão do quadro patológico ou a melhora na qualidade de vida dos pacientes. Estes modelos, entretanto, podem não representar fielmente os cenários produzidos em um quadro de hipertrofia cardíaca desenvolvida espontaneamente em um paciente humano. Desta forma, é importante que estes modelos sejam testados para os diversos parâmetros característicos de um processo patológico específico para que os resultados obtidos destes estudos não se tornem mera especulação desprovida de qualquer sentido fisiopatológico. O modelo de hipertrofia cardíaca induzida através da administração subcutânea de isoproterenol é confiável, reprodutível e utilizado por diversos grupos no mundo. A existência de informações abundantes acerca dos processos envolvidos na hipertrofia cardíaca estimulada por este agonista beta-adrenérgico foi essencial na determinação do tratamento a ser estudado.

32 Objetivos

33 33 Objetivos Os objetivos gerais deste trabalho foram I) avaliar as proteínas diferencialmente expressas entre os grupos controle e tratado de forma a entender os mecanismos responsáveis pelo processo hipertrófico patológico induzido pelo Isoproterenol; e II) verificar a participação de canais para cálcio do tipo T (Cav3.2) na cascata de sinalização da hipertrofia cardíaca. Como objetivos específicos destacamos: I) Induzir a hipertrofia cardíaca através da administração do agonistra beta-adrenérgico isoproterenol na dose de 50mg/Kg/dia durante sete dias consecutivos em camundongos machos da linhagem C57BL6; II) Verificar as alterações morfológicas induzidas pelo isoproterenol no coração dos animais do grupo tratado após uma semana de tratamento; III) Obter o padrão protéico bidimensional do ventrículo esquerdo dos corações hipertróficos e identificar as proteínas diferencialmente expressas entre os grupos controle e tratado; IV) Inferir a função biológica das proteínas identificadas e seu papel no processo hipertrófico patológico; V) Investigar os mecanismos responsáveis pela hipertrofia cardíaca induzida pelo Isoproterenol e a função da sinalização de cálcio via canais para cálcio do tipo T neste processo.

34 Métodos

35 Métodos 3.1 ASPECTOS ÉTICOS Todos os experimentos envolvendo animais foram realizados de acordo com o guia para utilização de animais de laboratório e foram aprovados pelo Comitê de Ética de Experimentação Animal da UFMG sob o protocolo número 129/ INDUÇÃO DA HIPERTROFIA CARDÍACA Camundongos C57BL6 (8-10 semanas de idade) foram cedidos pelo CEBIO/UFMG. Os animais foram mantidos em gaiolas de polipropileno com dimensões de 27 x 18 x 13 cm. No máximo quatro animais foram alocados por gaiola, mantidos com água e ração (Nuvilab) ad libtum em ciclo claro / escuro de 12h. Ao completarem 12 semanas os animais foram selecionados aleatoriamente para compor os grupos experimentais (controle e tratado). Os animais do grupo tratado receberam durante 7 dias consecutivos, 50mg/kg/dia de isoproterenol, a qual foi administrada via subcutânea em duas aplicações diárias com intervalo de 6 horas entre elas. O (-) isoproterenol (Sigma-Aldrich) foi dissolvido em solução salina composta de NaCl 140mM, NaH2PO4 1,86mM, Na2HPO4 8,4mM e ácido ascórbico 0,02%. Os animais controle receberam duas aplicações diárias de solução salina proporcional à massa corporal aferida no dia. No oitavo dia os animais foram heparinizados (Hemofol, Cristália 5000UI) por via intraperitoneal, sacrificados por decaptação e adequadamente preparados para os experimentos posteriores.

36 ANÁLISES HISTOMORFOLÓGICAS Para a obtenção dos parâmetros morfométricos, após o sacrifício o tórax dos animais foi aberto e o coração foi rapidamente dissecado e imediatamente transferido para uma placa Petri contendo solução salina fisiológica Tyrode gelada (Glicose 5mM, NaCl 135mM, KCl 5,4mM, MgCl2 0,5mM, CaCl2 1,8mM, HEPES 10mM) a 4ºC. Após remoção dos vasos da base por excisão e do sangue por seguidas lavagens em solução salina, o coração foi pesado rapidamente em béquer contendo Tyrode gelado. Posteriormente, o ventrículo esquerdo e os átrios foram separados e mensurados. Um dos membros posteriores foi dissecado e após a limpeza de todo o tecido em torno do osso, fez-se as medidas da tíbia PREPARO DAS LÂMINAS HISTOLÓGICAS Para o preparo das lâminas para a avaliação morfológica da hipertrofia cardíaca, primeiramente os corações inteiros foram mantidos por 10 minutos em solução fixadora formalina neutra tamponada 10% por tempo suficiente para criar uma resistência superficial e permitir o corte e a separação das câmaras cardíacas em duas metades longitudinais. As partes obtidas foram mantidas por mais 24 horas em solução fixadora. Posteriormente foram lavados em água corrente (3 banhos rápidos), e transferidos para o álcool 70%. As peças foram posteriormente desidratadas em séries crescentes de álcool (70 %, 80%, 90% seguidos de mais 3 banhos de álcool absoluto) por meia hora cada, diafanizadas em xilol (3 banhos de 20min) e incluídas em parafina (3 banhos à 58 graus por 20 minutos cada). Os blocos de parafina contendo os corações foram submetidos a microtomia sendo obtidos cortes de 6 µm de espessura para montagem das lâminas. Os tecidos aderidos às laminas foram corados pelo método HE (hematoxilina eosina) e submetidos à análise morfométrica para medidas das câmaras e paredes musculares em ganho de 20X. Todos os parâmetros foram obtidos na região central do coração (metade do comprimento longitudinal do

37 37 órgão), considerando que a espessura da cavidade e parede cardíacas podem variar de acordo com a região escolhida. As análises ocorreram de maneira similar para átrios e ventrículos. O diâmetro dos cardiomiócitos do ventrículo esquerdo foi mensurado, em ganho de 400X, em dois cortes representativos de cada amostra, tomando-se como referência a medida de 100 cardiomiócitos/animal. Somente cardiomiócitos bem definidos em secções longitudinais, com núcleos claros e em posição central nas fibras tiveram suas medidas aferidas. As análises foram realizadas com a ajuda do programa Image J. Fig. 7: Exemplo de cardiomiócito contendo núcleo oval, claro e central que foi utilizado nas medidas de diâmetro das células cardíacas. GanhoX e coloração HE. Para identificar áreas de lesões dos corações e o aparecimento de tecido fibroso, uma parte dos cortes obtidos foi corada com tricrômico de Gomori ou tricrômico de Masson, a qual permite visualização de fibras de colágeno (tecido corado em verde por Gomori ou em roxo por Masson). A identificação de regiões de lesão foi feita por imagens capturadas com ganho de 200X e analisadas também através do programa Image J. Todas as

38 38 imagens foram capturadas através de uma microcâmera Q-color 3 (Olympus) acoplada ao microscópio BX-41 (Olympus). As medidas foram calibradas a partir de uma régua micrométrica fotografada com cada uma das objetivas utilizadas nas morfometrias. Um único examinador foi responsável por todas as análises. 3.5 DOSAGEM DE ANP O ANP foi quantificado no extrato protéico do átrio direito e esquerdo de animais do grupo controle e tratados, utilizando radioimunoensaio de duplo anticorpo (RIE) de acordo com método descrito por Gutkowska e colaboradores em 1987 (Gutkowska et al., 1987). Para esta análise o coração foi dissecado conforme item 3.3, e as câmaras atriais foram homogeneizadas com um politron automático (Euroturrax IKA Labortechnix) em solução de ácido acético (0,1N) contendo inibidores de proteases (PMSF 100mM, EDTA 100mM e pepstatina 1mM). O homogenato resultante foi centrifugado a rpm por 20 minutos a 4ºC e uma alíquota do sobrenadante diluída 3000 vezes em tampão fosfato (NaCl 49 mm, albumina bovina 0,01mM, Triton X100 1%, NaNO3 1,17mM, ph 7,4) foi utilizada para a dosagem. Uma curva padrão foi empregada para determinar a concentração de ANP nas amostras em análise. Para a obtenção da curva de calibração, realizamos a diluição seriada do ANP marcado com iodo radioativo (125I 156pg/ml) em tampão fosfato. Uma parte desta diluição (100 µl) foi transferida para tubos de ensaio (identificados de B a L, Tabela 1) onde adicionamos também 100 µl do anticorpo primário (diluição 1:60.000). A solução foi incubada durante 24 horas em geladeira comum (~4ºC). Após este período adicionamos 100 µl do ANP marcado (a cpm contagens por minuto) e os tubos retornaram à geladeira por mais 24 horas. Ao terceiro dia de experimento, acrescentamos 100 µl do anticorpo secundário (diluição 1:10), seguidos de 100 µl de SNC (Soro Normal de Coelho) (diluição

39 39 1:30 em tampão fosfato) e deixamos por mais 2 horas de incubação a temperatura ambiente visando a formação dos imunocomplexos. Acrescentamos a cada tubo 0,5ml de polietilenoglicol (massa molecular Da) a 6,25% em água. Após centrifugarmos esta mistura a 3000 rpm por 20 minutos a 4ºC, retiramos o sobrenadante para a contagem em contador gama (LKB Perkin Elmer). Cada diluição foi lida em triplicata para maior homogeneidade dos resultados. Além da diluição seriada e dos tubos para a dosagem das amostras, também medimos a atividade (em CPM) de: duplicatas contendo apenas o ANP radioativo (tubo T); de um tubo branco (BK); e de duplicatas contendo todos os reagentes descritos exceto a amostra contendo ANP (A). A tabela 1 apresenta a descrição dos reagentes encontrados em cada um dos tubos deste ensaio. Tabela 1: Composição dos tubos utilizados na dosagem de ANP por RIE. Os tubos numerados de B a L foram usados na diluição seriada para a quentificação das amostras.

40 MENSURAÇÃO DA EXPRESSÃO DE CANAIS PARA CÁLCIO A expressão de canais para cálcio (tipo T e L) foi medida no ventrículo esquerdo de cinco animais de cada grupo através da técnica de Western Blot. Após lavagens consecutivas do ventrículo esquerdo em TBS (Tris-base 16mM, NaCl 136mM, ph 7,6) a 4oC amostras do tecido foram homogeneizadas com solução de lise (Trizima 65mM, NaCl 154mM, 0,25% de Na-deoxicolato a 10%, MP40 1%, 1% de EDTA 100mM e 0,1% de SDS a 10% contendo inibidores de protease (Sigma-Fast, Sigma) na concentração de 0,0016g/mL. O procedimento foi conduzido em banho de gelo com auxílio de um homogeneizador tipo Potter. Após o processamento, as amostras foram centrifugadas a 3.600g por 10 minutos a 4oC. O sobrenadante foi aliquotado e armazenado em freezer a -80oC para posterior utilização. A concentração de proteínas nas amostras foi determinada pelo método de Lowry em 1951 (Lowry et al., 1951). Amostras do extrato protéico dos tecidos, foram diluídas com o tampão da amostra (4X tris-hcl/sds, ph 6.8, glicerol 3%, SDS 1%, β-mercaptoetanol 0.6% e azul de bromofenol 1%) na proporção de 1:3 v/v. Alíquotas desta solução contendo 50µg de proteína foram aplicadas na eletroforese. A eletroforese foi realizada conforme descrito por Laemmli em 1970 (Laemmli, 1970) utilizando um mini sistema de eletroforese (Bio-Rad) com placas de 10 cm de comprimento por 8,2 cm de largura. O gel de separação (7%) foi preparado a partir de uma solução de acrilamida-bis-acrilamida em água (49,5% T e 3% C), contendo 0,1 % de SDS p/v, 0,033% de persulfato de amônio p/v, 0,033% de TEMED v/v e 1,0 M de Tris-HCl ph 8,45. O gel de concentração foi preparado a 4 % a partir da mesma solução de acrilamida-bisacrilamida, contendo as mesmas proporções de SDS, TEMED e persulfato de amônio do gel de separação.

41 41 A eletroforese foi conduzida a uma diferença de potencial de 90 V por 90 minutos e após a separação por massa molecular as proteínas foram transferidas para uma membrana PVDF (Milipore, USA) com poro de 0.45µm (100 V por 120 min). Ao fim deste processo a membrana foi corada com solução de Ponceu (0.3%) para verificar a eficiência da transferência. Após a lavagem da membrana com TBS-tween (solução TBS adicionada de Tween %) até o desaparecimento de todo corante esta foi incubada em solução de bloqueio (TBS-Tween 0.1% e leite em pó Molico desnatado 2.5%) por uma hora. O excesso de solução de bloqueio foi lavado com TBS-Tween anteriormente à adição da solução contendo o anticorpo primário específico (diluído em TBS, leite 0,2% e albumina bovina 2%) para canal T ou para canal L (MiliPore). Após 3 horas de reação com o anticorpo primário, o excesso de anticorpo foi lavado com TBS-Tween e a membrana foi exposta à solução contendo o anticorpo secundário conjugado com peroxidase por duas horas (anticorpo diluído em TBS adicionado de 1% leite) (Santa Cruz). O excesso de anticorpo foi novamente lavado em solução salina e a visualização das bandas protéicas de interesse foi feita através da sensibilização de um filme fotográfico por quimioluminescência após a exposição da membrana à solução Luminata Forte (Milipore). A análise das imagens foi realizada através do programa ImageJ. 3.7 ANALISE ESTATÍSTICA DOS PARÂMETROS MORFOMÉTRICOS Os resultados dos parâmetros morfométricos dos grupos controle e tratados foram apresentados como média ± erro padrão da média (EPM) e comparados através teste-t de student através do programa Excel (Microsoft). Para estas análises assumimos que a variância entre os grupos é homogênia (homocedástica) e a distribuição de probabilidade bicauldal. O nível de significância adotado foi α=0,05.

42 ANÁLISE PROTEÔMICA Para a análise proteômica comparativa do ventrículo esquerdo de animais dos grupos dos experimentais, o coração dos animais foi rapidamente removido, e lavado com solução salina (4X) e posterior lavagem com água milli Q a 4oC. O excesso de solução de lavagem foi removido por contato com papel de filtro. Em seguida, os átrios e tecidos adjacentes foram removidos e a massa restante do coração (ventrículos) foi rapidamente mensurada. O ventrículo esquerdo (VE) foi separado do direito, pesado e alocado em criotubo, o qual foi imediatamente mergulhado em nitrogênio líquido e posteriormente armazenado a -80oC até o momento da análise OBTENÇÃO DO EXTRATO PROTÉICO DOS VENTRÍCULOS ESQUERDOS Para a extração das proteínas do ventriculo esquerdo de animais dos grupos controle e tratado foi utilizada a metodologia descrita por Burniston em 2009 (Burniston, 2009), com algumas modificações. Alíquotas de aproximadamente 100mg de tecido do ventrículo esquerdo de três animais de cada grupo foram pulverizadas utilizando-se grau e pistilo de porcelana sob atmosfera de nitrogênio líquido. Ao pó resultante foi adicionado tampão de lise (8M de uréia, 2M de tiouréia, 40mM de Tris, 4% (p/v) de CHAPS 0,2% de anfólitos e 1% (v/v) de coquetel inibidor de proteases na proporção de 1:12 (p/v). Posteriormente, o material foi submetido à sonicação (3 ciclos de 15 segundos, 15 Hz, com intervalos de 1 minuto, em banho de gelo) usando um sonicador ultrassônico. Para remoção do material insolúvel do lisado celular, o homogenato foi centrifugado a g por 45 minutos a 4oC. Os sobrenadantes foram aliquotados e armazenados a -80oC para posterior análise. O conteúdo protéico das amostras foi determinado utilizando o kit de dosagem de proteína 2-D Quant Kit, conforme especificações do fabricante.

43 ELETROFORESE BIDIMENSIONAL (2DE) As amostras protéicas do ventrículo esquerdo dos animais dos grupos controle e tratado foram submetidas à eletroforese bidimensional. Foram obtidos seis géis (3 para cada grupo experimental cada um correspondendo a um animal diferente) FOCALIZAÇÃO ISOELÉTRICA (PRIMEIRA DIMENSÃO) Amostras de 1000 μg de proteínas solúveis (obtidas conforme o item 3.8.1) foram diluídas em tampão de reidratação (Destreak) contendo 0,2% de anfólitos, para um volume final de 350 μl. As soluções resultantes foram transferidas para uma bandeja de reidratação, e sobre estas foram colocadas as IPG strips desidratadas (17 cm, ph 3-10 não linear) durante 30 minutos. Posteriormente as IPG strips carregadas com as amostras foram alocadas adequadamente no sistema IEFCell (Bio-Rad) a 20oC com corrente máxima de 50 ma/gel. A programação utilizada foi: reidratação ativa (50 V por 12 horas a 20oC) e focalização isoelétrica (1a etapa: 300 V por 3 horas; 2a etapa: aumento gradual da voltagem, por rampa rápida, até V em 2 horas; 3a etapa: acúmulo de Vh; 4a etapa: 500 V por 5 horas), seguindo especificação do fabricante para strips de 17 cm.

44 REDUÇÃO E ALQUILAÇÃO DAS PROTEÍNAS ELETROFOCALIZADAS As proteínas eletrofocalizadas nas IPG strips foram reduzidas e alquiladas. Esse processo foi realizado pela incubação seqüenciada das strips com: DTT (10 mg/ml), e posteriormente iodoacetamida (25 mg/ml), em tampão de equilíbrio (50 mm Tris- HCl ph 8,8, 6 M de uréia, 30% (v/v) glicerol, 2% (p/v) SDS e 0,002% de azul de bromofenol) por 15 minutos cada à temperatura ambiente ELETROFORESE EM GEL DE POLIACRILAMIDA (SEGUNDA DIMENSÃO) A segunda dimensão foi realizada por SDS-PAGE, utilizando o sistema Protean II XL (Bio-Rad) e seguindo o método descrito por Laemmli (1970). As IPG strips contendo as proteínas reduzidas e alquiladas foram transferidas para a superfície do gel de poliacrilamida (12%), as quais foram seladas com solução de agarose 0,5% preparada no tampão de corrida (tampão Tris/Glicina/SDS, ph 8,8). A eletroforese foi conduzida a 16 ma/gel por 30 minutos e, em seguida, a 24 ma/gel até o término da corrida. Decorrido o tempo da eletroforese, o gel foi retirado da placa e submetido à coloração pelo método Coomassie coloidal (Brilliant Blue G-250) de acordo com Neuhof e colaboradores em 1988 (Neuhof et al., 1988) com algumas modificações. Inicialmente o gel foi incubado três vezes (30 minutos cada) com solução 2% de ácido ortofosfórico em etanol 30%, em seguida lavado três vezes (10 minutos cada) com solução 2% de ácido ortofosfórico. Posteriormente o gel foi incubado por 30 minutos em solução ácido ortofosfórico/sulfato de amônio/etanol (2%:12%:18%), e em seguida corado durante 5 dias pela adição de Coomassie G-250 na solução acima para concentração final 0,01% do corante. O excesso do corante foi removido do gel com solução de etanol 20%.

45 AQUISIÇÃO, PROCESSAMENTO E ANÁLISE DAS IMAGENS Para obtenção das imagens, os géis bidimensionais foram digitalizados utilizando scanner ImageScanner III (GE Healthcare Life Sciences) no modo de transmissão calibrado. Foram obtidos três géis bidimensionais para cada um dos grupos, perfazendo um total de seis imagens. As imagens foram analisadas pelo software Image Master 2D Platinun v 7.05 (GE Healthcare Life Sciences). A autenticidade de cada spot foi validada por inspeção visual e editada quando necessário. Após normalização da intensidade de cada spot em % do volume total dos spots, utilizando a equação descrita abaixo, foram realizadas as análises quantitativas para a identificação de spots com diferença de expressão protéica. Vol = área da base do pico do spot (a 75% do cume) x intensidade do spot Vols é o volume do spot s em um gel contendo n spots

46 IDENTIFICAÇÃO DAS PROTEÍNAS DIFERENCIALMENTE EXPRESSAS ENTRE OS GRUPOS PEPTÍDEOS DIGESTÃO E ANÁLISE DAS PROTEÍNAS, EXTRAÇÃO POR ESPECTOMETRIA DE DOS MASSAS As frações dos géis contendo os spots de interesse, selecionados conforme item acima, foram manualmente removidas do gel, com auxilio de pipetas Pasteur de plástico, e descoradas por 3 lavagens de 15 minutos com 400 μl de solução de acetonitrila 50% (v/v) em bicarbonato de amônio 25mM ph 8,0, sob agitação. Após a remoção da solução descorante, as frações dos géis foram tratadas com 200 μl de acetonitrila, até a opacificação do gel. Em seguida este solvente foi removido da amostra por concentrador a vácuo (Concentrador Plus, Eppendorf). As frações foram reidratadas com 10 μl de solução de bicarbonato de amônio 50 mm, contendo 20 ng/μl de tripsina (Golden) e mantidas por 30 minutos em banho de gelo para incorporação da solução. Para manter as frações úmidas durante a hidrólise tríptica, 20 μl de solução de bicarbornato de amônio 50 mm foram adicionados, e a mistura foi incubada por 14 horas a 37 C. Em seguida, a solução não incorporada ao gel foi recolhida e as frações do gel foram submetidas a duas lavagens sucessivas com 30 μl de solução de ácido fórmico 5% em acetonitrila 50% (30 minutos cada, sob agitação), para completa remoção dos fragmentos trípticos. As soluções foram agrupadas e o volume resultante foi reduzido até aproximadamente 10 μl, por concentração a vácuo. Posteriormente, as amostras obtidas foram dessalinizadas em micro coluna Zip-Tip (resina C18; P10, Millipore Corporation, Bedford, MA) equilibrada com solução 0,1% de ácido trifluoracético (TFA). Os fragmentos da hidrólise enzimática foram eluídos da resina com 6 μl de solução 50% de acetonitrila,tfa contendo 0,1% de TFA (Vergote et al., 2005). Como controle negativo e positivo para as análises, foram utilizados, respectivamente, uma fração do gel destituída de spot protéico e o spot protéico correspondente à albumina bovina (BSA) do padrão de peso molecular. Alíquotas de 0,5 e 1,0 μl

47 47 de cada solução dos fragmentos trípticos dessalinizados foram aplicadas em placa anchorship 600 (Bruker Daltonics, Bilerica, EUA) e em seguida co-cristalizadas com 0,25 μl de solução saturada da matriz 5 mg/ml de CHCA em acetonitrila 70%/TFA 0,1%) à temperatura ambiente. Os espectros de massas foram obtidos em sistema MALDI-TOF/TOF Autoflex III TM, softwares FlexControlTM e FlexAnalysisTM (Bruker Daltonics, Bilerica, EUA), operando no modo positivo/refletor. A calibração externa do modo MS foi realizada utilizando a mistura de peptídeos Peptide Calibration Standard II (bradicinina m/z = 757,39; angiotensina II m/z = 1046,54; angiotensina I m/z = 1296,68; sustância P m/z = 1347,73; bombesina m/z = 1619,82; substrato da renina m/z = 1758,93; ACTH (1-17) m/z = 2093,08; ACTH (18-39) m/z = 2465,19; e somatostatina (28) m/z = 3147,47) da Bruker Daltonics, Bilerica (EUA). Os sinais dos íons mais intensos foram selecionados como precursor para aquisição do MS/MS. As análises por espectrometria de massas foram realizadas no Núcleo de Biomoléculas do Departamento de Bioquímica e Imunologia da UFMG.

48 PESQUISA EM BANCO DE DADOS Os espectros de massas obtidos de cada spot protéico (MS e MS/MS) foram combinados pelo software BioTools (Bruker Daltonics, Bilerica, EUA) e posteriormente investigados nos bancos de dados do Centro Nacional de Informações Biotecnológicas não redundante (NCBInr), por meio do software MASCOT (www.matrixscience.com). Os parâmetros de busca utilizados no MASCOT foram: Mus como taxonomia; peptídeos trípticos com ausência de um único fragmento; ausência de restrições no peso molecular da proteína; oxidação da metionina e carbamidometilação da cisteína como modificações variável e fixa, respectivamente; valores de massa monoisotópica; carga do peptídeo 1+; e tolerância de 0,8 Da na massa do MS e do MS/MS. Score global do MASCOT correspondente à significância estatística de α<0,05 foi utilizado para validação da identificação das proteínas, quando estas apresentavam homologia com Mus musculus. A categorização funcional das proteínas identificadas foi realizada por meio das anotações dos processos biológicos e funções moleculares obtidas nos bancos de dados do Gene Ontology (GO) e PANTHER (Thomas et al., 2003) para Mus musculus. 3.9 ANÁLISE ESTATÍSTICA DOS EXPERIMENTOS DE PROTEÔMICA Os resultados foram apresentados como média ± erro padrão da média (EPM). A análise de fatores para determinação dos grupos foi realizada com auxílio do software Image Master 2D Platinun v 7.05, utilizando os seis géis como fatores. Os valores de volume normalizado dos spots dos grupos controle e tratado foram analisados por meio de teste t não pareado. As diferenças foram consideradas estatisticamente significantes quando p<0,05.

49 Resultados

50 RESULTADOS 4.1 INDUÇÃO DA HIPERTROFIA CARDÍACA PARÂMETROS MORFOMÉTRICOS Para determinarmos se o protocolo experimental proposto (tratamento com isoproterenol) foi efetivo em induzir a hipertrofia, realizamos aferições de estruturas que poderiam ser influenciadas pelo tratamento. Foram medidas a massa do coração, massa do ventrículo esquerdo e a massa total dos átrios, nos dois grupos de animais (tratado e controle). Os dados foram sintetizados na figura 8. Fig. 8: Valores absolutos obtidos para (a) massa do coração; (b) ventrículo esquerdo; e (c) dos átrios de animais do grupo controle (verde) e tratado (vermelho). MCr = massa do coração(g); MVe = massa do ventrículo esquerdo(g); MAts = massa dos átrios(g). *p<0,05; **p<0,005

51 51 Posteriormente, buscamos por correlações que nos permitissem comparar amplamente os indivíduos de cada grupo de forma a entender os parâmetros que são influenciados pela perturbação provocada no sistema. Para alcançarmos este objetivo, inicialmente correlacionamos os parâmetros de interesse com aqueles que sabidamente não são influenciadas pelo tratamento. As aferições utilizadas nesta análise foram ralizadas durante os sete dias de tratamento e também após o sacrifício. As estruturas de nosso interesse consistiram na massa do coração, massa do ventrículo esquerdo e a massa total dos átrios; enquanto as estruturas utilizadas como padrões foram massa corpórea e tamamnho da tíbia. A massa corpórea, como demonstrado pela figura 9 não foi significativamente alterada pelo tratamento. Fig. 9: Variação da massa corporal dos animais ao longo do tratamento com isoproterenol (vermelho) e solução salina (verde). Não houveram diferenças significativas entre os dois grupos (n=30).

52 52 A partir da comparação entre as estruturas de interesse e as estruturas invariáveis obtivemos as seguintes correlações que nos permitiram analisar o crescimento cardíaco relativo como demonstrado na figura 10: Fig. 10: Correlações obtidas para os grupos controle e tratado da massa do coração vs massa corporal (a) e da massa do coração vs tamanho da tíbia (b) Além destes parâmetros, também verificamos o crescimento do ventrículo esquerdo a partir da correlação desta estrutura com a massa corporal, massa do coração e com o tamanho da tíbia (Fig. 11).

53 53 Fig. 11: Relação morfométrica entre a massa do ventrículo esquerdo e (a) massa do corporal; (b) massa do coração; e (c) tamanho da tíbia. Os dados mostram que o aumento em massa do coração não é percebido quando comparado com a massa total do coração. *p<0,05 Visto que as células que compõem os átrios são responsáveis pela produção e armazenamento da maior parte do ANP (a Fig. 12 apresenta o resultado da dosagem de ANP nos átrios, onde houve um aumento significativo na produção de ANP nos animais tratados com isoproterenol, corroborando com a literatura existente) e BNP durante os processos hipertróficos patológicos, nos questionamos também se estas

54 54 estruturas passariam por um remodelamento morfológico. Os dados foram sintetizados na tabela 2 a seguir: Fig. 12: Dosagem do ANP presente nos átrios de animais do grupo controle e tratado por RIE. ***p<0,00001 Tabela 2: Correlações obtivas a partir das massas dos átrios quando comparadas às massas corpóreas, do coração e ao tamanho da tíbia. MA = massa dos átrios(g); MCp = massa corpórea (g); MCr = massa do coração (g); TTb = tamanho da tíbia (mm). Diversos autores argumentam que a hipertrofia cardíaca é dada unicamente pela proliferação do tecido fibroso intersticial e pelo crescimento em largura e diâmetro das células, uma vez que as células cardíacas, extremamente ativas, não poderiam se multiplicar. Entretanto, ao realizarmos uma busca mais cuidadosa da literatura, encontramos

55 55 autores que defendem que a hipertrofia cardíaca patológica é também uma consequência do aumento em número do miócitos cardíacos. Para verificar estas divergências, realizamos a mensuração do diâmetro das células em cada grupo (Fig. 13) e também a contagem manual das células cardíacas (Figura 14): Fig. 13: Diâmetro aferido das células cardíacas em animais do grupo controle (verde) e em animais do grupo tratado (vermelho). ****p<0,00001 Fig. 14: Contagem dos miócitos cardíacos nos grupos controle e tratado em um total de 40 micrografias para cada grupo (ganho 400X). *p<0,05

56 PARÂMETROS HISTOMORFOMÉTRICOS Diversos parâmetros foram avaliados a partir das lâminas histólogicas dos tecidos de animais que integraram ambos os grupos deste estudo. Inicialmente, a observação do tecido cardíaco dos animais do grupo tratado poderia indicar que houve crescimento longitudinal deste órgão (Fig. 15). Entretando, uma avaliação mais detalhada mostra que este parâmetro não diferiu significativamente dos animais do grupo controle (Tabela 3). Fig. 15: Micrografia representativa do tecido cardíaco de um animal controle (a) e de um animal tratado (b). Ganho 20X e coloração HE. A barra horizontal corresponde a 650 µm.

57 57 Tabela 3: Análise do tamando do coração (TC); da espessura do ventrículo esquerdo (VE); do diâmetro do ventrículo esquerdo (DVE); e do diâmetro dos átrios (DA) a partir das micrografias dos corações de indivíduos de ambos os grupos (tratado e controle). *p<0,05 Outro parâmetro morfométrico de grande importância para a constatação do processo hipertrófico patológico, a substituição do tecido cardíaco por tecido fibroso, também foi verificado por nós através do estudo das lâminas histológicas em coloração Tricrômico de Gomori. A figura 16 apresenta uma lâmina representativa de cada grupo sendo que somente podemos visualizar regiões mais claras relativas ao tecido fibroso intersticial nos animais tratados com isoproterenol. Fig. 16: Micrografias do tecido cardíaco de animais do grupo controle (a) e tratados com isoproterenol (b). As setas vermelhas indicam a presença de tecido fibroso entre as células musculares cardíacas. Ganho 200X e coloração com tricrômico de Gomori.

58 58 Além da fibrose no tecido cardíaco, também observamos que nos animais submetidos ao tratamento com isoproterenol células do sistema circulatório encontravam-se fora dos vasos sanguíneos permeando as fibras contráteis do coração (Fig. 17). Essa evidência nos instigou a investigar se as células sanguíneas encontradas fariam parte de um infiltrado inflamatório no tecido destes animais. Entretanto, até o presente momento não obtivemos os resultados definitivos para provar nossa hipótese. Fig. 17: Células sanguíneas (indicado pelas setas vermelhas) encontradas fora dos vasos e entre as fibras musculares cardíacas. Ganho 400X e coloração HE. 4.3 DETERMINAÇÃO DO NÍVEL DE EXPRESSÃO DAS PROTEÍNAS DOS CANAIS PARA CÁLCIO DO TIPO T E L POR WESTERN BLOT Para averiguar nossa hipótese de que os canais para cálcio dependentes de voltagem são essenciais no processo hipertrófico patológico, também realizamos experimentos de Western Blot de forma a comparar os níveis protéicos deste canal existentes no tecido cardíacdo dos animais de cada grupo. Nossos resultados demonstram que não houveram diferenças significativas (Fig. 18). Nosso grupo deu início a outros experimentos para investigar se o número de moléculas de mrna

59 59 (RNA mensageiro) teria sido afetada pelo tratamento, entetando os resultados ainda não haviam sido analisados até a presente data. Fig. 18: Expressão protéica de canais para cálcio do tipo T e L em animais controle (verde) e tratados com isoproterenol (vermelho). n=5 4.4 ANÁLISE PROTEÔMICA ANÁLISE COMPARATIVA DOS GÉIS BIDIMENSIONAIS DOS EXTRATOS PROTÉICOS DO VENTRÍCULO ESQUERDO Foram produzimos 6 géis bidimensionais para a análise proteômica comparativa do VE dos grupos analisados (Figura 19), sendo correspondente ao extrato obtido de três animais de cada grupo. Alíquotas de 1000 μg foram eletrofocalizadas e posteriormente resolvidas em gel SDS-PAGE 12%. A análise das imagens dos géis pelo software Image Master 2D Platinun v 7.05, detectou aproximadamente 743 spots protéicos por gel no grupo controle e 512 spots no grupo tratado.

60 Non linear ph 3 MM T6 10 T7 T11 Fig. 19: Perfil protéico de amostras de ventrículos esquerdos dos animas dos grupos controle e tratado. Alíquotas de 1000 μg de proteínas foram focalizadas em IPG strip pi 3-10 não linear (NL) de 17cm. As proteínas foram separadas na segunda dimensão utilizando-se SDS-PAGE 12%. Àesquerda dos géis encontram-se os valores que representam a massa molecular de proteínasutilizadas como padrão. ( ) Imagens de referência.

61 61 A reprodutibilidade dos géis em relação ao número total, posição relativa e intensidade dos spots protéicos, dentro de cada grupo foi avalida pela análise de correlação em teste de regressão linear. Os resultados desta análise (Tabela 4) mostram que os géis obtidos apresentam uma alta reprodutibilidade dentro de cada grupo. Tabela 4: Análise de reprodutibilidade dos géis (intragrupo). Cada gel foi relacionado com a imagem de referência do respectivo grupo. T6, T7 e T11 = animais do grupo tratado; C1, C2 e C3 = animais do grupo controle. A análise de fatores (Figura 20) foi utilizada como ferramenta para a delimitação dos grupos a partir das imagens obtidas dos géis. Nesta figura, os géis são representados pelos vetores em azul e os matchs são representados pelas cruzes vermelhas. A proximidade entre os vetores indica que estes, provavelmente, pertencem ao mesmo grupo ou população. A distância entre vetores e, principalmente, seu posicionamento em quadrantes distintos, indica maior probabilidade de diferença entre esses vetores (géis). Como mostra a figura 20, as linhas representativas dos géis das amostras dos grupos controle e tratado agrupam-se em quadrantes diferentes, o que demonstra que há maior probabilidade de diferença no perfil protéico destas amostras.

62 62 Fig. 20: Gráfico de análise de fatores onde há a projeção dos géis analisados para o delineamento dos grupos experimentais. Após as análises pelo software, autentificação por inspeção visual, e normalização dos volumes dos spots, foi realizada a análise quantitativa comparativa. Obtivemos 131 spots que apresentaram diferença de volume significativa entre os grupos. Dentre eles, 24 estavam mais expressos e 15 menos expressos no grupo tratado quando comparados aos spots do grupo controle, 87 estavam presentes apenas no grupo controle e 5 apenas no grupo tratado. Dentre esses spots, 113 foram retirados dos géis e preparados para a identificação protéica IDENTIFICAÇÃO DAS PROTEÍNAS Dentre os 113 spots com diferença de expressão que foram obtidos dos géis, 25 foram identificados (22,12%) utilizando os espectros de massas MS e MS/MS. A figura 21 mostra um esquema

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