UNIVERSIDADE FEDERAL DE CIÊNCIAS DA SAÚDE DE PORTO ALEGRE UFCSPA CURSO DE PÓS-GRADUAÇÃO EM HEPATOLOGIA. Carlos Eduardo Becker

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1 1 UNIVERSIDADE FEDERAL DE CIÊNCIAS DA SAÚDE DE PORTO ALEGRE UFCSPA CURSO DE PÓS-GRADUAÇÃO EM HEPATOLOGIA Carlos Eduardo Becker Utilização da Curva de Melting como Screening para Análise dos Genótipos A, D e F do Vírus da Hepatite B em Pacientes de um Hospital Geral do Sul do Brasil Porto Alegre 2012

2 2 Carlos Eduardo Becker Utilização da Curva de Melting como Screening para Análise dos Genótipos A, D e F do Vírus da Hepatite B em Pacientes de um Hospital Geral do Sul do Brasil Tese submetida ao Programa de Pós- Graduação em Hepatologia da Fundação Universidade Federal de Ciências da Saúde de Porto Alegre como requisito para a obtenção do grau de Doutor Orientadora: Drª Ana Beatriz Gorini de Veiga Co-Orientador: Dr. Ângelo Alves de Mattos Porto Alegre 2012

3 3 Catalogação na Publicação B395u Becker, Carlos Eduardo Utilização da curva de melting como screening para análise dos genótipos A, D e F da hepatite B em pacientes de um hospital geral do Brasil / Carlos Eduardo Becker f. : graf., Il., tab.; 30 cm. Tese (doutorado) Fundação Universidade Federal de Ciências da Saúde de Porto Alegre, Programa de Pós-Graduação em Hepatologia, Orientadora: Prof.ª Drª. Ana Beatriz Gorini de Veiga. Co-orientador: Dr. Ângelo Alves de Mattos. 1. Hepatite B. 2. Vírus da hepatite B. 3. Genótipos. 4. Curva de Melting. I. Título. CDD CDU Bibliotecária Ruth Borges Fortes de Oliveira- CRB 10/501

4 4 DEDICATÓRIA Aos meus pais, Onofre Jorge e Maria Ignez, por terem me transmitido sua força de trabalho e determinação. À minha avó, Holanda, quem destinou sua vida à minha educação, ensinando-me a bravura e superação, sendo meu exemplo de transpor as dificuldades cotidianas. A minha referência em todos os momentos. À Juliana, pelo amor, compreensão, companheirismo e cumplicidade. Sempre presente, me incentiva todos os dias para que eu conquiste todos os meus objetivos de vida.

5 5 AGRADECIMENTOS A Deus, por me amparar nos momentos difíceis, me dar força interior para superar as dificuldades, mostrar o caminho nas horas incertas e me suprir em todas as minhas necessidades. Aos pacientes, sem os quais este trabalho não seria possível. À Universidade Federal Ciências da Saúde de Porto Alegre, pela oportunidade de realizar este Doutorado. À Drª Ana Beatriz Gorini da Veiga, pela orientação, gentileza, colaboração, presteza. Agradeço pelas conversas construtivas que tivemos e pelo conhecimento no desenvolvimento desta Tese. Ao Dr. Angelo Alves de Mattos, pelo apoio, paciência, compreensão, incentivo, amizade, confiança e ensinamentos recebidos por esse que é, sem dúvida, um exemplo de conduta e postura profissional. Ao Dr. Nelson Kretzman, à Drª Fernanda Schild Branco de Araújo, à Drª Lísia Hoppe e à Drª Gabriela Perdomo Coral, pela amizade, ensinamentos, ideias e colaboração incondicional transmitidas durante toda a etapa deste trabalho. Ao Dr. Rafael Sommer e à Drª Sílvia Dal Alba pela busca de informações e auxílio que, sem dúvida alguma, contribuíram para a elaboração deste trabalho. Ao Laboratório Central do Complexo Hospitalar Santa Casa, representado na pessoa do Dr. Carlos Franco Voegeli, pelo auxílio na fase inicial do estudo e na coleta e armazenamento das amostras dos pacientes. Ao Laboratório de Técnicas Especiais do Hospital Albert Einstein, em São Paulo - SP, pela dedicação e colaboração na parte prática.

6 6 Ao Laboratório DB - Diagnósticos do Brasil, em Curitiba - PR, em especial ao seu diretor Dr. Marcelo Ruiz, pelo incentivo e valorização à capacitação dos seus profissionais. Aos professores e pesquisadores do Centro de Biologia Genômica e Molecular da PUCRS que me auxiliaram no desenvolvimento desta Tese. À equipe de Gastroenterologia e Hepatologia do Complexo Hospitalar Santa Casa que permitiu que os pacientes, sob seus cuidados, fossem incluídos neste estudo. E a todas as pessoas que, direta ou indiretamente, contribuíram para a realização e conclusão deste trabalho.

7 1 RESUMO Introdução: O Vírus da Hepatite B (VHB) pode causar hepatite fulminante, cirrose e carcinoma hepatocelular (CHC), sendo uma das causas mais frequentes de doença aguda e crônica do fígado. As variantes genéticas do VHB podem ser determinantes para a evolução da doenças assim como para a eleição da terapêutica. Objetivos: O objetivo deste estudo foi padronizar e avaliar uma metodologia in house, através da utilização da curva de melting de PCR em tempo real (qpcr), como rastreamento para análise dos genótipos A, D e F do vírus da hepatite B em pacientes do Rio Grande do Sul. Metodologia: Foram avaliados 104 pacientes com infecção crônica pelo Vírus da Hepatite B (VHB). O DNA foi extraído com kit comercial, os genótipos e as mutações foram determinados utilizando diferentes protolocos baseados em PCR. Resultados: Foi padronizada uma metodologia baseada em PCR para a análise dos genótipos A, D e F do VHB. A técnica consistiu de uma PCR Nested incluindo uma etapa final de PCR em tempo real Multiplex, utilizando a curva de melting como ferramenta para a definição dos fragmentos. Foi observada uma maior frequência do genótipo D (44,2%), seguido do genótipo A (22,1%) e do genótipo F (3,8%) na amostra analisada. Conclusão: O ensaio padronizado fornece um método rápido e preciso para diferenciar genótipos do VHB mais frequentes no Sul do Brasil A, D e F usando um PCR Nested Multiplex com primers específicos, o qual apresenta potencial aplicação na prática clínica.

8 2 ABSTRACT Introduction: Hepatitis B Virus (HBV) can cause fulminant hepatitis, cirrhosis and hepatocellular carcinoma (HCC), and is one of the most common causes of acute and chronic liver failure. The genetic variants of HBV can be decisive for the evolution of these diseases as well as for the election of therapy. Objectives: The aim of this study was to evaluate an in house methodology based on the melting curve of real-time PCR (qpcr) analysis to screen for genotypes A, D and F of hepatitis B virus in patients of Rio Grande do Sul, Brazil. Methodology: We evaluated 104 patients with HBV chronic infection. The DNA was extracted with a commercial kit, genotypes and different mutations were determined using PCRbased protocols. Results: A PCR-based methodology was standardized for the analysis of genotypes A, D and F of HBV. The technique was based in a Nested PCR with the final step consisting of a Multiplex real-time PCR, using the melting curve as a tool for the differentiation of fragments. We observed a higher frequency of genotype D (44.4%), followed by genotype A (22.2%) and genotype F (3.7%). Conclusion: The standardized test, a Nested PCR-Multiplex qpcr using specific primers, provides a rapid and accurate method for the differentiation of HBV genotypes that are more frequent in Southern Brazil A, D and F. This method can be applied in the clinical practice.

9 3 LISTA DE ABREVIATURAS ALT AST Anti-HBeAg Anti-HBsAg CHC ddntps DNA EtBr EXO I HBcAg HBeAg HBsAg ml Alanina Aminotransferase Aspartato Aminotransferase Anticorpo contra o antígeno HBe Anticorpo contra o antígeno HBs Carcinoma Hepatocelular Di-deoxinucleotídeos Ácido desoxiribonucleioco Brometo de Etídeo Exonuclease I Antígeno Core do VHB Antígeno e do VHB Antígeno de superfície do VHB Mililitros µl Microlitros pb PCR qpcr RNA Pares de base Reação em Cadeia da Polimerase Reação em Cadeia da Polimerase quantitativa em tempo real Ácido ribonucleico

10 4 RS SAP SINAN Tm VHB VHC Rio Grande do Sul Shrimp Alkaline Phosphatase Sistema de Informação de Agravos de Notificação Temperatura de Melting Vírus da Hepatite B Vírus da Hepatite C

11 5 LISTA DE FIGURAS E TABELAS Gráfico 1 - Detecção do VHB no Rio Grande do Sul por faixa etária em Figura 1 - Mapa do Coeficiente de Detecção da Hepatite B, por região (CRS) Tabela 1 Número de casos confirmados de Hepatite B no RS no período Figura 2 - Genoma do VHB... 7 Figura 3 - Gráfico de amplificação de ácidos nucleico por PCR em tempo real Figura 4 - Curvas de Melting. Fragmentos de tamanhos distintos e Tm distintas Figura 5 - Fluxograma do desenvolvimento método-científico Tabela 2 - Descrição dos primers utilizados Tabela 3 - Características Clínicas dos pacientes e Genótipos do VHB Figura 6 - Curvas de Melting para genotipagem do VHB. (A) Curvas de Melting normalizadas. (B) Curvas de Melting derivadas. Genótipos A, D e F Tabela 4 - Características Clínicas e Moleculares dos Pacientes de acordo com o Genótipo VHB Figura 7 - Frequência dos subtipos do VHB... 30

12 6 SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO História Natural da Infecção pelo VHB Epidemiologia do VHB O Vírus da Hepatite B Genótipos do VHB Diagnóstico do VHB Diagnóstico Molecular do VHB PCR em tempo real JUSTIFICATIVA OBJETIVOS Objetivo Primário Objetivos Secundários PACIENTES E MÉTODOS Casuística Métodos Determinação dos Genótipos e das Mutações Extração de Ácidos Nucleicos Reações de PCR PCR Nested para o sequenciamento e para PCR em tempo real Identificação dos Produtos das Reações Reação de Purificação (controle) Reação de Sequenciamento (controle) Análise das Sequências (controle) Análise Estatística RESULTADOS... 26

13 7 6 DISCUSSÃO CONCLUSÃO ANEXOS Protocolo Consentimento Pós-Informação Manuscrito REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS... 62

14 1 1 INTRODUÇÃO A infecção pelo vírus da hepatite B (VHB) é um grave problema de saúde pública mundial(1). A infecção pode ser transmitida através de contato parenteral ou, ainda, transmissão vertical (mãe/filho), podendo levar à doença hepática crônica, incluindo a cirrose e o carcinoma hepatocelular (CHC). Com base na distribuição dos casos de hepatite B, podemos dividir o mundo em três regiões: alta [África, região sudeste da Ásia, incluindo a China, Coréia, Indonésia e as Filipinas; o Oriente Médio, exceto Israel; as ilhas do Pacífico Sul e Ocidental; as áreas no interior da bacia hidrográfica do Rio Amazonas e em certas partes do Caribe (Haiti e República Dominicana)], média (região centro-sul e sudoeste da Ásia, Israel, Japão, regiões leste e sul da Europa, Rússia, na maior parte das áreas ao redor da bacia hidrográfica do Rio Amazonas, Honduras e Guatemala) e baixa endemicidade (Oeste da Europa, América do Norte, Austrália, Nova Zelândia, México e na região sul da América do Sul)(2). Algumas medidas podem contribuir para a diminuição dos índices de infecção pelo VHB, tais como: mudança de comportamento sexual de risco, aumento dos níveis educacionais, teste laboratorial em doadores de sangue, técnicas assépticas na prática clínica e, ainda, aumentando o rastreamento populacional de diagnóstico para infecção pelo VHB(3). As vacinas são também muito eficazes na prevenção da hepatite B e de suas consequências, como a cirrose e o CHC. Desta forma, as políticas públicas de vigilância epidemiológica favorecem o controle e o tratamento das infecções pelo VHB.

15 2 As características moleculares do VHB são responsáveis pelo desenvolvimento não somente da hepatite B aguda, mas também pelas diferentes manifestações da doença hepática crônica, portanto a identificação do genótipo viral contribui para o tratamento adequado e estudo epidemiológico do VHB(4). 1.1 História Natural da Infecção pelo VHB O fígado atua de forma fundamental na manutenção da homeostase metabólica, no processamento de aminoácidos, carboidratos, lipídios e vitaminas da dieta, no metabolismo do colesterol e das toxinas, na produção de fatores de coagulação e no armazenamento da glicose(5). As doenças hepáticas são classificadas geralmente em duas categorias: hepatocelular e colestática (obstrutiva). Nas doenças hepatocelulares (como a hepatite viral ou a doença hepática alcoólica), inflamação e necrose hepáticas predominam como características do dano celular. Dentre as causas mais comuns de doença hepática aguda, o VHB entra em primeiro plano junto com o vírus da hepatite C (VHC). Em relação à doença hepática crônica, o VHB ocupa a quarta posição como fator etiológico(5). A classificação se refere à avaliação da gravidade ou à atividade da doença hepática se aguda ou crônica, ativa ou inativa, e leve, moderada ou grave. Os níveis séricos de aminotransferases são usados como meio conveniente e não-invasivo de acompanhar a atividade da doença. Essas enzimas são liberadas em grandes quantidades no sangue quando há dano nas células hepáticas. Entretanto, nem sempre são confiáveis para exprimir a real dimensão da enfermidade, uma vez que a doença hepática pode não estar acompanhada por necrose(5).

16 3 A injúria ao parênquima hepático, de variadas etiologias, associada com um influxo de células inflamatórias, é um evento denominado hepatite. A cirrose é o resultado do processo inflamatório onde há o estímulo crônico à fibrogênese, com a consequente fibrose difusa e a desarquiteturização do parênquima, com a formação de nódulos(6). A fibrose hepática sempre foi considerada um processo irreversível; contudo, evidências recentes sugerem que possa ser reversível, como demonstrado em alguns pacientes com hepatite crônica viral submetidos a terapias anti-virais(7). As injúrias crônicas ao fígado podem evoluir para a cirrose por mecanismos fisiopatológicos diversos em que há uma persistente tentativa de reconstituição do parênquima, resultando em fibrose e nodulações difusas. Estima-se que, para que ocorram complicações como a disfunção hepatocelular e outras manifestações clínicas, que configuram a descompensação do paciente com doença hepática, aproximadamente 80% a 90% do parênquima hepático deve estar modificado(7). A associação entre doença hepática crônica causada pela infecção pelo VHB e alterações morfológicas das células hepáticas, como os tumores primários, foi reconhecida há mais de 30 anos onde 65% dos pacientes com CHC tinham cirrose(8). Atualmente, estima-se que em 80% dos casos há associação de cirrose com CHC, e consideram-se as alterações nas células indiferenciadas hepáticas como possível evento relacionado ao aparecimento de tumores(9). 1.2 Epidemiologia do VHB A hepatite viral B é uma doença comum e grave causada pelo VHB, um vírus de DNA parcialmente fita dupla, da família Hepadnaviridae. Quatro principais sorotipos (adw, ayw, adr e ayr) e nove menores foram identificados para o antígeno

17 4 de superfície do VHB, o HBsAg. O sequenciamento completo do genoma do VHB levou à identificação de oito genótipos (de A a H), mostrando uma distribuição etnogeográfica diferente para cada um dos genótipos. Os genótipos do VHB também têm sido associados com diferentes desfechos clínicos e com resposta à terapêutica com interferon(10). O VHB é uma das principais causas da cirrose e do CHC. A doença aguda ocorre geralmente quando a resposta imune é bem preservada, enquanto que pacientes com imunodeficiência são mais propensos a desenvolver uma doença crônica, tornando-se uma fonte de transmissão da doença. A probabilidade de que uma infecção pelo VHB se torne crônica depende da idade em que uma pessoa é infectada; além disso, lactantes e crianças jovens são os mais propensos a desenvolver uma infecção crônica(10). Globalmente, estima-se que cerca de um terço da população mundial já tenha sido infectada pelo VHB; 6% são portadores crônicos e mais de pessoas morrem a cada ano de doença aguda ou crônica, secundária à infecção pelo VHB(2). Com base na taxa de portadores do VHB, o mundo pode ser dividido em regiões de endemicidade alta, média e baixa. A grande preocupação está em países de alta endemicidade, especialmente na Ásia e na África, onde as rotas mais comuns de infecção permanecem a transmissão vertical (de mãe para filho) e a transmissão horizontal entre crianças(2). No Brasil, o Ministério da Saúde estima que pelo menos 15% da população já tenha sido contaminada com o VHB, sendo que os casos crônicos correspondem a cerca de 1% da população brasileira e a taxa de mortalidade é de 0,6 por habitantes(11). A literatura médica refere a Região Sul como área de baixa endemicidade; as regiões Centro-Oeste, Nordeste e Sudeste de intermediária

18 5 endemicidade; a região da Amazônia, o estado do Espírito Santo e a região oeste do estado de Santa Catarina constituem regiões de alta endemicidade(11-14). No Estado do Rio Grande do Sul e em Porto Alegre, as notificações de hepatite pelo VHB em 2009 são apresentadas no Gráfico 1 e na Figura 1. Gráfico 1. Detecção do VHB no Rio Grande do Sul por faixa etária em Fonte: Secretaria Estadual da Saúde / RS SINAN/DVE/CEVS/SES-RS. Figura 1. Mapa do Coeficiente de Detecção da Hepatite B, por região (CRS), 2009 (por habitantes). Fonte: Secretaria Estadual da Saúde / RS SINAN/DVE/CEVS/SES-RS. A Tabela 1 mostra o número de casos confirmados de hepatite B no RS no período de 1998 a 2008.

19 6 Tabela 1. Número de casos confirmados de Hepatite B no RS no período Ano Casos confirmados Fonte: MS/SVS Sistema de Informação de Agravos de Notificação SINAN O vírus da Hepatite B O vírus da hepatite B (VHB) possui um nucleocapsídeo icosaédrico e apresenta um envelope externo lipídico. O capsídeo envolve o DNA viral e uma DNA polimerase com atividade de transcriptase reversa. A camada externa contém proteínas envolvidas na entrada e fixação do vírus nas células susceptíveis à infecção. O VHB é um dos menores vírus envelopados conhecidos, embora haja formas pleiomórficas, incluindo filamentos esféricos e sem núcleo (core). Estas partículas não são infecciosas e são constituídas simplesmente de lipídios e proteínas que formam parte da superfície do vírus, isto é, os antígenos de superfície (HBsAg), os quais são produzidos em excesso durante o ciclo de vida do vírus(15).

20 7 A partícula denominada Dane é a partícula viral completa. Sua estrutura é complexa e com um envoltório duplo. O envoltório externo contém proteínas antigênicas denominadas de HBsAg; o interno, junto com o DNA e a enzima DNApolimerase, constitui o core, que apresenta uma outra proteína antigênica o antígeno do core (HBcAg) e um antígeno solúvel, antígeno e do vírus da hepatite B (HBeAg)(16, 17). Figura 2. Genoma do VHB. Fonte: Naito et al.,2001. O genoma do VHB é composto por uma molécula de DNA circular dupla fita descontínua (Figura 2). O genoma contém entre pares de bases (perímetro máximo) e entre pb em sua fita interna. O DNA viral pode ser encontrado no núcleo das células hospedeiras logo após a infecção(18). Existem quatro genes conhecidos no genoma, chamados C, X, P e S. A proteína do núcleo (core) é codificada pelo gene C (HBcAg) e seu códon de início é precedido por outro códon ATG, a partir do qual é codificada a proteína précore. O processamento desta proteína pré-core, por proteólise, produz o antígeno e

21 8 (HBeAg). A DNA polimerase é codificada pelo gene P. O gene S é o que codifica o antígeno de superfície HBsAg. O gene do HBsAg compreende uma extensa fase de leitura aberta dentro da qual existe um códon de início ATG que divide sua sequência em três secções: pré-s1+pré-s2+s, pré-s2+s e S. A função da proteína codificada pelo gene X ainda não é completamente conhecida(19) Genótipos do Vírus da Hepatite B A progressão da doença hepática, assim como a resposta às terapias antivirais, têm sido relacionadas aos diferentes genótipos do VHB(20). O curso da infecção pelo VHB depende de muitos fatores que podem influenciar a interação vírus-hospedeiro, sendo provavelmente de relevância a variabilidade genética do vírus, incluindo os genótipos, os quais podem influenciar a expressão dos antígenos virais(21). São conhecidos oito diferentes genótipos do VHB (A-H) com distinta distribuição geográfica mundial(16). Em estudo anterior de nosso grupo, evidenciamos a presença dos genótipos A, D e F no estado do Rio Grande do Sul(13). No Brasil, os genótipos A e D são mais prevalentes, assim como na Europa, América do Norte, Índia e África; os genótipos B e C são encontrados com maior frequência no Sudeste da Ásia, China e Japão; o genótipo E é restrito à África; o genótipo F é encontrado na população nativa das Américas do Sul e Central; o genótipo G foi descrito na França, Estados Unidos e México; e o genótipo H foi encontrado na América Central(13, 22-24). O comportamento de risco e também a migração e origem étnica podem influenciar a distribuição geográfica dos genótipos(16). Os estudos sobre os diferentes subtipos de VHB de acordo com a distribuição populacional nos diferentes continentes ainda estão incompletos, havendo poucos dados, por exemplo, da

22 9 América do Sul(25, 26). Além disso, a distribuição genotípica do VHB e sua correlação com o curso clínico da doença hepática ainda não estão bem esclarecidos(27). Estudos indicam que o genótipo C promove uma doença hepática crônica com maior gravidade comparado com os demais genótipos. Estudos com pacientes de Taiwan mostraram que a cirrose e o CHC são mais frequentes em portadores do genótipo C do que B(28, 29). O genótipo C é mais prevalente em pacientes HBeAg positivos do que o genótipo B(42). O risco de desenvolver o CHC, além de estar relacionado com o aumento da carga viral dos pacientes, também está relacionado com o genótipo do VHB. No Japão e na China, o genótipo C do VHB está diretamente relacionado com o desenvolvimento do CHC(20, 30). O genótipo D, por sua vez, está associado com maior gravidade da doença hepática quando comparado ao genótipo A e pode também favorecer a ocorrência de CHC em pacientes jovens(17, 31, 32), dado esse relevante para o acompanhamento clínico dos pacientes no estado do Rio Grande do Sul sendo um dos três genótipos presentes neste estado. Uma avaliação geral dos genótipos do VHB nestes pacientes favorece uma melhor conduta no tratamento desta população(13). 1.3 Diagnóstico da Hepatite B Utilizam-se habitualmente marcadores sorológicos como indicadores de diagnóstico e/ou prognóstico de infecção aguda ou crônica por VHB. O marcador mais frequente de infecção por VHB consiste na presença do antígeno de superfície do VHB (HBsAg)(33). No entanto, a utilização deste marcador para monitorar a

23 10 progressão da doença pode ter uma utilidade limitada, pois o vírus é frequentemente alvo de alterações genéticas(13). Foi referido que a capacidade para detectar DNA do VHB no soro possui valor prognóstico para a evolução de infecções agudas e crônicas por VHB. A metodologia pode permitir a detecção do DNA do VHB após o desaparecimento de HBsAg ou a detecção do VHB sem marcadores sorológicos(34). A eficácia da terapêutica antiviral utilizada no tratamento de doentes com VHB também pode ser avaliada por marcadores sorológicos ou por medição da função das enzimas hepáticas(35). Todavia, acredita-se que a medida mais direta e fidedigna replicação viral consiste na quantificação do DNA viral em soro ou plasma. Uma descida rápida e mantida dos níveis de DNA do VHB em doentes submetidos a tratamento constituiu um fator de previsão para um resultado favorável do mesmo. A monitorização dos níveis de DNA do VHB, assim como a identificação dos genótipos, pode predizer o desenvolvimento de resistência à terapêutica. Por conseguinte, um teste quantitativo para a determinação do DNA do VHB constitui uma importante ferramenta que pode ser utilizada em conjunto com outros marcadores sorológicos no tratamento da infecção por VHB. No plasma, o DNA do VHB pode ser identificado através de tecnologias de amplificação de ácidos nucleicos, como é o caso da reação em cadeia da polimerase (PCR)(36, 37) Diagnóstico Molecular do Vírus B O conhecimento dos genomas virais pode revelar variações entre genótipos que podem representar uma predisposição a desenvolver um prognóstico ruim ou até mesmo opções de tratamento que podem ser mais eficazes. Testes de

24 11 diagnóstico moleculares analisam o conteúdo genético para obter informações dos vírus. Estes testes podem analisar sequências de regiões específicas do material genético dos vírus para identificar mutações ou quantificar os níveis de certos materiais genéticos que podem ser expressos(34). Sequências características de ácidos nucleicos no caso do VHB, uma sequência de DNA podem apresentar mutações antigas ou novas, as quais podem fazer com que o paciente desenvolva uma doença hepática crônica de uma maneira mais agressiva. A identificação de uma mudança genética para um comportamento mais agressivo no genoma do VHB ou para uma condição específica pode servir como alerta para a equipe médica e auxiliar na escolha de determinadas condutas, a fim de evitar ou controlar o desenvolvimento ou descompensação da doença hepática. Certos genótipos e mutações podem influenciar, assim, as opções de tratamento, pois afetam a resposta terapêutica, como por exemplo o tratamento com a Lamivudina(38). Algumas terapias possuem respostas distintas se o alvo da droga contém mutações críticas(39). Portanto, esta informação da composição genética do VHB pode ser utilizada para selecionar a melhor estratégia terapêutica para para cada indivíduo e sua infecção de forma personalizada. O diagnóstico molecular é considerado atualmente o método mais adequado para fins de avaliação de tratamento e acompanhamento da replicação viral em sangue periférico. Valores de carga viral acima de cópias/ml indicam replicação ativa, enquanto valores mais baixos indicam paciente portador do vírus, porém com pouca atividade do VHB. A PCR quantitativa realizada previamente ao tratamento, com dados de carga viral, pode ser utilizada na avaliação de prognóstico

25 12 em resposta ao tratamento. A genotipagem do VHB é realizada geralmente por sequenciamento do DNA(13) PCR em tempo real Na biologia molecular, a PCR em tempo real quantitativa (real time PCR ou qpcr) é uma técnica laboratorial baseada PCR para amplificar ácidos nucleicos. A qpcr combina a metodologia de PCR convencional com um mecanismo de detecção e quantificação através da emissão de fluorescência, permitindo o monitoramento da reação em tempo real. Desta forma, a cada ciclo de amplificação são gerados dados, os quais podem ser analisados em tempo real, ao contrário da PCR convencional, em que a análise é realizada somente ao final da reação, geralmente por eletroforese em gel(40). A qpcr permite que os processos de amplificação, detecção e quantificação de DNA sejam realizados em uma única etapa, agilizando a obtenção de resultados, diminuindo o risco de contaminação da amostra e garantindo maior precisão. Os testes diagnósticos para o VHB que envolvem métodos moleculares de amplificação geralmente compreendem as etapas de extração dos ácidos nucleicos de amostras biológicas, seguido da amplificação de um segmento específico e detecção do fragmento amplificado (amplicon)(40).

26 13 Fluorescência Figura 3. Gráfico de amplificação de ácidos nucleico por PCR em tempo real. A detecção da amplificação na qpcr pode estar baseada no uso de sondas fluorescentes específicas para uma região da molécula que está sendo amplificada, ou com o uso de reagentes fluorescentes que se intercalam na molécula de DNA. Dentre estes últimos, o sistema Sybr Green é um dos mais utilizados para detecção do VHB e outros vírus por qpcr(41, 42). O Sybr Green possui ligação altamente específica ao DNA dupla-fita sendo utilizado para detectar o produto da PCR do VHB conforme ele se acumula durante os ciclos da reação. Para todas as reações utilizando este sistema de detecção deve-se realizar a análise da curva de melting como controle de especificidade para o fragmento amplificado de acordo com o tamanho do fragmento(43). A análise de curva de melting permite a identificação do fragmento do VHB amplificado através de uma temperatura específica (temperatura de melting, Tm), podendo também distinguir sequencias de composições semelhantes com bases na diferença de suas temperaturas de dissociação. A Tm é a temperatura na qual

27 14 metade das fitas de DNA está na forma de fitas simples e a outra metade na forma de dupla hélice. A Tm é dependente da composição do DNA, de modo que um aumento do conteúdo de G+C no DNA gera um incremento na Tm ocasionado pelo maior número de ligações de ponte de H(43, 44). No caso do VHB este tipo de análise também pode ser utilizada(36, 42), assim como para o VHC(41). Figura 4. Curva de Melting. Fragmentos de tamanhos distintos e Tm distintas. Outro tipo de PCR, a PCR Multiplex, utiliza iniciadores (primers) múltiplos para a amplificação de vários fragmentos dentro de uma única reação de PCR convencional. No entanto, a sua transferência de uma plataforma convencional para a plataforma da PCR em tempo real confundiu sua terminologia tradicional. O termo PCR Multiplex PCR em tempo real é mais comumente usado para descrever o uso de múltiplas sondas fluorogênicas na discriminação de vários amplicons(45, 46). Melhorias recentes na análise dos fragmentos através de curva de melting permitem a utilização desta metodologia também para o sistema que utiliza o Sybr Green no diagnóstico do VHB. Nesta metodologia os distintos fragmentos possuem Tm diferentes apresentando picos característicos de cada alvo selecionado através da utilização de primers específicos(36, 37, 42).

28 15 2. JUSTIFICATIVA Tendo em vista a gravidade potencial da doença hepática em pacientes com VHB e as características genéticas virais como determinantes do curso da doença hepática, torna-se necessário desenvolver uma metodologia prática, rápida e de baixo custo para o rastreamento das infecções pelo VHB no estado do Rio Grande do Sul.

29 16 3 OBJETIVOS 3.1 Objetivo Primário Estabelecer uma metodologia in house, através da utilização da curva de melting de PCR em tempo real (qpcr), para análise dos genótipos A, D e F do vírus da hepatite B em amostras de pacientes com infecção crônica pelo Vírus da Hepatite B do Complexo Hospitalar Irmandade Santa Casa de Misericórdia de Porto Alegre, Rio Grande do Sul, Brasil. 3.2 Objetivos Secundários Estabelecer um teste molecular único para pesquisa dos genótipos A, D e F do VHB na população do estado do Rio Grande do Sul baseado em PCR Nested qpcr Multiplex; Avaliar a prevalência dos genótipos do VHB em uma população geral; Avaliar a presença das mutações no promotor basal do core e no pré-core e sua associação com a resistência aos antivirais; Avaliar a correlação das mutações estudadas com os genótipos do VHB.

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