JULIANA BIANCA ROCHA DE SOUZA. ESTUDO SOROLÓGICO DE Toxoplasma gundii em BOVINOS DO ESTADO DE RONDÔNIA

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1 Universidade Camilo Castelo Branco Programa de Pós-Graduação em Produção Animal, Campus Descalvado JULIANA BIANCA ROCHA DE SOUZA ESTUDO SOROLÓGICO DE Toxoplasma gundii em BOVINOS DO ESTADO DE RONDÔNIA STUDY SOROLOGICAL IN Toxoplasma gundii IN CATTLE AT THE STATE IN RONDÔNIA Descalvado, São Paulo 2015

2 Juliana Bianca Rocha de Souza ESTUDO SOROLÓGICO DE Toxoplasma gundii em BOVINOS DO ESTADO DE RONDÔNIA Orientador: Prof. Dr. Vando Edésio Soares Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Produção Animal da Universidade Camilo Castelo Branco, como complemento dos créditos necessários para obtenção do título de Mestre em Produção Animal. Descalvado, São Paulo 2015

3 Ficha Catalográfica SOUZA, Juliana B. Rocha de S713E Estudo Sorológico de Toxoplasma gundii em Bovinos do Estado de Rondônia / Juliana B., Rocha de Souza - São José dos Campos: SP / UNICASTELO, f. il. Orientador: Prof. Dr. Vando Edésio Soares Dissertação de Mestrado apresentada no Programa de Pós- Graduação em Produção Animal da Universidade Camilo Castelo Branco, para complementação dos créditos para obtenção do título de Mestre em Produção Animal. I. Título 1. Toxoplasmose. 2. Ingestão. 3. Cistos. 4. Frigorífico.

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6 DEDICO Aos meus pais por me sustentarem nesta jornada com suas orações, confiança, amor e paciência inesgotável. As minhas irmãs e sobrinhos pela paz e tranquilidade que me propiciaram viver nesta caminhada, me incentivando com vossas orações e estando sempre do meu lado. Ao Prof. Vando Edésio Soares, que acreditou na minha capacidade e investiu o seu tempo para que meu sonho se tornasse realidade.

7 AGRADECIMENTOS À Deus por me capacitar e me permitir alcançar esta vitória. A Maeli acadêmica do curso de Medicina Veterinária da Universidade Federal de Rondônia de Rolim de Moura/RO UNIR, que me auxíliou de forma incansável na obtenção das amostras para minha pesquisa. A professora Dr.ª Thaís Rabelo, que me incentivou, mesmo diante das dificuldades, a persistir e desenvolver esta pesquisa de forma adequada. A Cleidiane Magalhães, bióloga que me acompanhou durante todo dificultoso processo da coleta do material, sem medir o cansaço, o sofrimento e os perigos ali vivenciados. Ao professor Dr. Marco Belo que se dispôs em me ajudar no transporte das amostras da pesquisa até o local de análises. A todos os pesquisadores que tiveram envolvidos de forma direta e indireta na obtenção dos resultados esperados da pesquisa. Ao frigorífico que possibilitou a coleta do material principal da pesquisa. A todos os funcionários do frigorífico que direta ou indiretamente me permitiram e me auxiliaram a obter as amostras da pesquisa. Ao José Alber por todo o apoio dedicado à minha pesquisa. A professora Dr.ª Cássia Orlandi, por dispor o seu tempo para finalização da minha dissertação.

8 Quanto mais aumenta nosso conhecimento, mais evidente fica nossa ignorância. (John F. Kennedy)

9 ESTUDO SOROLÓGICO DE Toxoplasma gundii em BOVINOS DO ESTADO DE RONDÔNIA RESUMO Registros atuais ligam a carne bovina à epidemiologia da toxoplasmose, em decorrência da situação desta zoonose no estado de Rondônia, realizou se um estudo sorológico para Toxoplasma gundii em gado de corte no referido estado. No levantamento foram coletadas amostras de soro bovino pertencentes a 41 propriedades distribuídas em 19 municípios e 2 distritos de Rondônia. Os soros foram determinados por reação de Imunofluorescência indireta, objetivando determinar a prevalência do protozoário na região amostrada. Anticorpos contra T. gundii foram encontrados em 5,3% dos bovinos (1.000), o título mais frequente foi o de 1:64 (33), e (1) dos animais apresentou título superior a 1024 (1028). O percentual de 5,3% da infecção toxoplásmica no estado referido ao estudo se como baixo quando comparado com regiões sul, sudeste e centro oeste, porém na análise individual por município, a prevalência alcançou até 16,67%, caracterizando a possibilidade dos bovinos influenciarem na transmissão da toxoplasmose para população rondoniense. A prevalência de anticorpos contra T. gundii registrada no respectivo estudo é um fator positivo para o estado em comparação a outras regiões elencadas no Brasil, pois o estado se encontra no sexto lugar de abate bovino no Brasil, quarto lugar no ranking dos estados exportadores de carne bovina, ou seja, o estado é responsável por 20% da carne exportada no país. Palavras-chave: toxoplasmose, ingestão, cistos, frigorífico.

10 STUDY SOROLOGICAL IN Toxoplasma gundii IN CATTLE AT THE STATE IN RONDÔNIA ABSTRACT Current Records bind to beef epidemiology of toxoplasmosis, due to the situation of this zoonotic disease in the state of Rondônia, held - a serological survey for Toxoplasma gundii in beef cattle in that state. In the survey were collected 1,000 serum samples cattle belonging to 41 properties divided into 19 municipalities and 2 districts of Rondônia. Sera were determined by reaction Indirect immunofluorescence, to determine the prevalence of the parasite in the survey area. Antibodies against T. gundii were found in 5.3% of cattle (1000), the most frequent title was 1:64 (33), and (1) the animals showed superior title to 1024 (1028). The percentage of 5.3% of T. gondii infection in the state referred to the study as low compared to South, Southeast and Midwest, but the individual analysis by municipality, the prevalence reached up to 16.67%, characterizing the possibility of cattle influence in the transmission of toxoplasmosis to rondoniense population. The prevalence of antibodies against T. gundii recorded in their study is a positive for the state compared to other regions listed in Brazil, as the state is in the sixth of cattle slaughter in Brazil, fourth in the ranking of exporting states beef, that is, the state is responsible for 20% of the meat exported in the country. Key words: toxoplasmosis, ingestion, cysts, refrigerator.

11 LISTA DE FIGURAS Figura 1: Ciclo do Toxoplasma gundii e formas de infecção para o hospedeiro intermediário 36.Fonte: Galisteo, Figura 2: Localização dos municípios e distritos amostrados no Estado de Rondônia.40 Figura 3: O mapa representa os municípios e distritos do estado de Rondônia que, tiveram casos positivos e negativos para IgG anti T. gundii, Figura 4: Prevalência de Toxoplasma gundii dos municípios amostrados do Estado de Rondônia. Descalvado, SP;

12 LISTA DE ABREVEATURAS, SIGLAS E SÍMBOLOS. AIDS Síndrome da Imunodeficiência Adquirida BSA Albumina Sérica Bovina Dye-test Teste de corante de Sabin-Feldman ELISA Ensaio Imunoenzimático Indireto EUA Estados Unidos da América HAI Teste de Hemaglutinação Indireta IgA Imunoglobulinas A IgG Imunoglobulinas G IgM Imunoglobulinas M NK Células Natural Killer NO Óxido nítrico PAMPs Patógenos PBS Tampão Salina Fosfato PCR Reação da Cadeia Polimerase ph Potencial Hidrogeniônico PMNs Polimorfonucleares RH Cepa de Toxoplasma gondii TLRs Toll-like UNIR Universidade Federal de Rondônia % Porcentagem > Maior < Menor

13 Sumário 1. Introdução Revisão Bibliográfica Histórico Morfologia Taquizoítos Bradizoítos Esporozoítos Ciclos Ciclo Biológico Assexuada Sexuada Diversidade Biológica do Toxoplasma gundii Mecanismos de Transmissão da Toxoplasmose Transmissão Horizontal Ingestão de oocistos Ingestão de cistos teciduais Ingestão de leite cru Transmissão Vertical Outros Mecanismos de Transmissão Imunidade Resposta imune inata e celular na toxoplasmose Resposta imune humoral na toxoplasmose Fontes de Infecção Bovinos Humanos Toxoplasmose congênita Toxoplasmose adquirida... 33

14 Toxoplasmose em imunocomprometidos Diagnóstico Diagnóstico sorológico Dye-test (teste do corante de Sabin-Feldman) Reação e imunofluorescência indireta Teste Imunoenzimático (ELISA) Teste de hemaglutinação indireta (HAI) Diagnóstico histológico Diagnóstico clínico Profilaxia Objetivos Objetivo geral Objetivos específicos Material e Métodos Área de Estudo Seleção dos rebanhos Localização Coleta das amostras sanguíneas Delineamento Experimental Testes sorológicos Local Confecção de lâminas para realização de exames sorológicos Reação de Imunofluorescência indireta (RIFI) para detecção de anticorpos anti- Toxoplasma gundii Preparo do antígeno Reação de Imunofluorescência indireta RIFI-IgG anti- Toxoplasma gundii Resultados e Discussão... 43

15 6.Conclusões Anticorpos anti-toxoplasma gundii foram registrados em amostras de sorológica de bovinos abatidos em frigoríficos no estado de Rondônia Referências Bibliográficas ANEXO I - Questionário ANEXO II - Comissão de Ética em uso de Animais... 68

16 1. Introdução A toxoplasmose se define como uma zoonose de distribuição mundial que atinge o homem e outros animais de sangue quentes (mamíferos e aves), tanto de produção quanto de estimação, domésticos e silvestres. O protozoário Toxoplasma gundii, é um parasita intracelular obrigatório que tem a capacidade de assumir morfologias múltiplas durante o seu ciclo biológico, de acordo com o hábitat e o estágio evolutivo 20. Os felídeos são representantes fundamentais na transmissão do T. gundii para o homem e outros animais, os felídeos são os únicos hospedeiros que liberam oocistos do parasito, forma esta derivada da fase sexuada do ciclo, limitada ao epitélio intestinal desses animais. As condições climáticas são importantes na fase de esporulação dos oocistos liberados no meio ambiente. Outros animais de sangue quente conseguem manter as fases assexuadas do ciclo, se tornando então, hospedeiros intermediários, transmitindo o parasito quando sua carne serve para alimentação ou por via congênita 20. Formas de infecção pouco citadas são por meio de transplante de órgãos e transfusão de sanguínea. A possibilidade de o homem contrair a infecção por meio de animais de produção é fundamental ao ponto de vista de saúde pública, podendo esclarecer as vias de transmissão e os potenciais reservatórios da infecção. Formas viáveis do T. gundii foram identificadas em carnes e estudos sorológicos tem destacado ampla distribuição da infecção entre os animais produtores de carne 127. Com base em aspectos de morbidade e mortalidade, o T. gundii, juntamente com as bactérias Listeria sp e Salmonella sp., são os três parasitas mais importantes transmitidos por alimentos nos Estados Unidos e Europa. Outro aspecto que deve ser levado em consideração na transmissão da toxoplasmose é o manuseio do produto animal de forma contínua, como durante o preparo da carne para refeição 50. Informações atuais disponíveis não definem a principal via de infecção para humanos. Porém infecção crônica dos animais produtores de carne foi detectada através de sua resposta sorológica, constitui um importante papel na

17 17 manutenção da toxoplasmose entre os carnívoros, incluindo o homem e os felinos 127. Os bovinos estão incluídos entre os hospedeiros mais resistentes ao T. gundii, porém o papel da carne bovina na transmissão da toxoplasmose no estado de Rondônia ainda permanece obscuro. O presente estudo poderá contribuir na determinação animais infectados dentre os bovinos abatidos no estado.

18 18 2. Revisão Bibliográfica 2.1. Histórico A toxoplasmose teve o seu primeiro caso em humanos descrito por Castellani 1-2, em que a vítima foi uma criança do sexo masculino, que apresentava alguns sinais de quadro febril e esplenomegalia 3. Nesta época ainda não se tinha isolado o parasito para observação, o Toxoplasma gundii foi isolado por meio de cortes histológicos em 1923 na cidade de Praga por Janku, do olho de uma criança de 11 meses que apresentava uma condição clinica de hidrocefalia e microftalmia 4. Nicolle e Manceaux em 1908 protocolaram o T. gundii depois de isolar o protozoário do cérebro de um roedor (Ctenodactylus gundii) selvagem na Tunísia, norte da África. No mesmo ano Splendore no Brasil, no estado de São Paulo foi isolou este mesmo protozoário em coelhos de laboratório 5. O gênero do protozoário Toxoplasma se refere a sua forma de meia lua, o específico gundii se refere ao primeiro roedor silvestre onde se isolou o parasita 6. O Toxoplasma gundii pertence ao filo Apicomplexa, ordem Coccidia, caracterizado como protozoário intracelular obrigatório 7. Este tipo de protozoário tem a capacidade de sobrevivência em células humanas e de outros vertebrados 8, 9. Em 1927, foi descrito no município de Rio de Janeiro o registro de um protozoário com características semelhantes ao do T. gundii, o microrganismo foi identificado em cortes histológicos do cérebro e músculos esqueléticos de um recém-nascido. Diante da situação, postulou-se a hipóteses de uma infecção congênita, a qual finalmente registrada por Wolf & Cowen dez anos depois 10. O T. gundii não se relaciona apenas com a infecção em humanos, mas há uma grande distribuição desta patologia em animais do mundo todo. Inquéritos epidemiológicos mostraram que cerca de 90% dos animais domésticos e silvestres avaliados registram a presença de anticorpos para o protozoário 11. A primeira infecção natural por T. gundii em bovinos foi descrita em Ohio, Estados Unidos, os pesquisadores que realizaram o diagnóstico da

19 19 infecção de procedência natural, descreveram também a primeira infecção experimental por T. gundii em bovinos 12. No ano de 1965, foi identificada a participação do gato no ciclo evolutivo do T. gundii, onde se demonstrou a possibilidade do felino eliminar o parasito em suas fezes, mas somente 15 anos mais tarde realizaram a descrição do ciclo sexuado do T. gundii no intestino delgado do gato doméstico 10. Os impactos à Saúde Pública pelo causador desta zoonose posicionam o T. gundii como o coccídeo mais estudado atualmente 13. Os papéis deste parasito e suas várias fontes potenciais de infecção não se tornaram totalmente conhecidos podendo até mesmo variar de população a população Morfologia O Toxoplasma gundii apresenta três formas evolutivas relacionadas aos aspectos de infecção e transmissibilidade: o taquizoítos, bradizoítos e esporozoítos Taquizoítos Esta fase morfológica do parasito se assemelha com uma meia lua com característica de rápida multiplicação, realizada pelo ciclo assexuado parasito, o rápido processo de multiplicação acontece em células nucleadas de hospedeiros intermediários 16, 17. Nesta fase o parasito tem cerca de 2 a 6 micrometros de comprimento e 2 a 4 micrometros de diâmetro, a extremidade apresenta uma característica arredondada anterior aguda 18. Esta forma infectante é composta por células bem desenvolvidas com característica semelhante a uma célula animal, tendo a presença de mitocôndria, retículo endoplasmático, complexo de Golgi e organelas como anéis polares, conoide, roptrias e micronemas com características específicas ao filo. A rápida forma de multiplicação se propaga no organismo hospedeiro por meio de líquidos corporais como o sangue e a linfa 18. O processo de reprodução dos taquizoítos ocorre por endodiogenia, que se caracteriza por brotamento de duas células-filhas no interior de uma célula-mãe, sendo as células-filhas liberadas com a ruptura da célula-mãe 19.

20 20 O taquizoíto tem a capacidade de se alojar no interior de vacúolos citoplasmáticos dos fagócitos, das células hepáticas, pulmonares, submucosas e musculares, o acesso a essas células se dá pela presença de taquizoíto em líquidos orgânicos e excreções 20. A forma de arco do parasita caracteriza sua forma menos resistente, podendo ser destruída com muita facilidade pelas condições ambientais adversas, pela desidratação, variáveis osmóticas e pela tripsina ou pepsina Bradizoítos Os bradizoítos apresentam características morfológicas semelhantes aos taquizoítos, porém com processo reprodutivo lento no interior dos cistos tissulares 22. Essa forma evolutiva tem sido registrada em cistos teciduais de hospedeiros, o que caracteriza a fase crônica da infecção 18. Os tecidos mais vulneráveis a presença de cistos com bradizoítos podem ser do sistema muscular esquelético, nervoso e cardíaco 23, 24. Caso os cistos se mantenham intactos sem rompimento não ocorre reação inflamatória, podendo sobreviver desta forma por durante toda a vida do organismo hospedeiro 25. O vacúolo parasitóforo de uma célula se caracteriza como um bom alojamento para os bradizoítos, pois ao entrar no interior do vacúolo da célula, a membrana celular forma uma capa de tecido tecidual. Essa parede apresenta características resistentes e elásticas, o que possibilita um isolamento do bradizoítos das atividades imunológicas do hospedeiro 26. A característica de resistência à tripsina permite a sobrevivência dos bradizoítos nos tecidos vivos por períodos muito longos. Sua evolução no processo infeccioso caracteriza a fase crônica, porém pode se encontrar cepas de bradizoítos em infecções agudas pelo Toxoplasma gundii Esporozoítos Os esporozoítos são encontrados no interior de oocistos, sendo exclusivo de hospedeiros definitivos. Estes hospedeiros podem ser acometidos por um grande número de oocistos, caso ocorra à ingestão de cistos tissulares. Mas pode se encontrar estes oocistos em fezes de gatos a partir da ingestão em qualquer estágio infectante 1,11,25.

21 21 Os esporozoítos são caracterizados como oocistos, estes imaturos podem ser encontrados nas fezes de felinos que não apresentam imunidade ativa a esta característica infectante do parasito, as células intestinais do felino imunologicamente vulnerável tem a capacidade de produzir oocistos, que são liberados no ambiente ainda imaturo. Na infecção primária os gatos podem liberar aproximadamente 100 milhões de oocistos no ambiente, podendo contaminar água, pastagem e solo. Os oocistos encontrados no ambiente apresentam característica esférica e quando maduros realizam o processo de esporulação, onde eclodem originando dois esporocistos, com quatro esporozoítos cada 11,27-28, Ciclos Ciclo Biológico O ciclo biológico do T. gundii é heteróxeno, estabelecido por duas fases: assexuada e coccidiana ou sexuada. A fase assexuada se caracteriza pela reprodução de taquizoítos e bradizoítos, podendo ocorrer nos linfonodos ou em diversos tecidos dos hospedeiros incompletos ou completos não imunes. A fase Coccidiana ou sexuada é o período em que ocorre a produção de oocistos, sendo um processo que acontece exclusivamente no vacúolo parasitóforo no citoplasma das células do epitélio intestinal de gatos ou felídeos não imunes Assexuada Essa fase se classifica como fase extraintestinal, como capacidade de acometer todos os hospedeiros completos ou incompletos vulneráveis a infecção. O processo se inicia após a ingestão de alimentos contaminados por oocistos maduros contendo esporozoítos ou cistos de bradizoítos e taquizoítos. A contaminação pode ocorrer com a ingestão de água e alimento contaminados por oocistos, carnes com bradizoítos ou leite e sangue com taquizoítos 26. Esta fase proliferativa se caracteriza inicialmente como uma infecção aguda, a qual resulta de um rápido desenvolvimento do parasito na forma de taquizoítos no interior da célula do hospedeiro. Este parasito se multiplica de

22 22 forma acelerada infectando todas as células nucleadas por meio da corrente sanguínea e linfática. Essa disseminação caracteriza a infecção aguda da toxoplasmose, este tipo de infecção pode ocasionar o surgimento de um quadro polisintomático, onde sua gravidade pode ser definida pela quantidade de formas infectantes adquiridas, tipo de cepa do parasito e da susceptibilidade do hospedeiro. Neste estágio da doença fetos ou indivíduos com sistema imune comprometido podem chegar a óbito. Depois do processo de intensa multiplicação do parasito, o sistema imune inicia o processo de fagocitose onde vários protozoários são eliminados do sangue, da linfa e das vísceras, reduzindo o parasitismo no organismo hospedeiro. Nessa captura realizada pelo sistema imunológico alguns taquizoítos se refugiam dentro dos tecidos das células de defesa, multiplicando lentamente na transformação de taquizoíto em cistos formando bradizoítos, neste período caracteriza se a fase crônica da infecção. Os bradizoítos se diferenciam dos taquizoítos no processo lento de multiplicação e pela presença de proteínas específicas que os mesmos desenvolvem. O processo de multiplicação é realizado por endodiogenia que lhes possibilita permanecer em estado de latência em meio a célula do hospedeiro por longos períodos 18, Sexuada Esta fase se caracteriza como enteroepitelial, onde bradizoítos penetram em células epiteliais do intestino delgado ou no cólon do felídeo. Essa fase se inicia quando um felídeo realiza a ingestão de qualquer uma das formas evolutivas do T. gundii 29. O processo sexuado não se inicia logo após a ingestão, seu inicio se dá alguns dias após a infecção, onde merozoítos formam os macrogametócitos (feminino) e microgametócitos (masculino). Nos macrogametas não há presença de flagelos, onde os mesmos ficam móveis no interior da célula hospedeira, a fecundação ocorre quando os microgametas flagelados saem da célula hospedeira atingem a luz do intestino e são atraídos pelos macrogametas em outra célula. A formação do zigoto acontece com a união

23 23 dos dois núcleos nas células da parede intestinal após realizarem a síntese de uma parede cística. Estes zigotos são caracterizados como oocisto não esporulado, que migram par luz intestinal com o rompimento da célula hospedeira 30, 31. Os oocistos não esporulados são eliminados nas fezes dos felídeos no período de cinco a dez dias posterior a ingestão de qualquer forma evolutiva. A reprodução por esporogonia ocorre no ambiente, de 1 a 5 dias após a liberação de oocistos não esporulados, neste processo dentro do oocisto ocorre à formação dois esporocistos e quatro esporozoítos no interior, esta etapa só acontece sob temperaturas e oxigenação em condições e concentrações ideais. Este ciclo se completa com a ingestão de oocisto esporulado por um hospedeiro intermediário 30, 31. Em diversas regiões no mundo o gato doméstico é tido como o principal tido como hospedeiro definitivo desta zoonose, os animais de sangue quente se caracterizam apenas como hospedeiros intermediários deste protozoário As características morfológicas do parasito se relacionam com suas formas de contágio. Na forma evolutiva oocistos o parasito é liberado no ambiente por meio das fezes de felídeos, sendo ingeridos posteriormente por animais de sangue quente quando presentes, água e alimentos contaminados. Quando ingerido por meio de animais de produção, o protozoário se encontra na sua forma de cisto tecidual bradizóito, em caso de infecção aguda este pode ser transmitido através transfusão de sangue e no leite de animais produtores. As etapas da forma e evolutiva e de contágio do parasito estão representadas na Figura Diversidade Biológica do Toxoplasma gundii Estudos realizados na década de 80 com o objetivo de determinar as cepas deste parasito mostraram a evidência de que este organismo apresenta duas linhagens clonais ligadas a isolado virulento e de baixa virulência. As estratégias utilizadas para se chegar a tais linhagens envolveram técnicas biológicas, bioquímicas e moleculares 37. Atualmente foi realizada uma caracterização genotípica de diferentes isolados do patógeno por meio de métodos moleculares 38. Esses métodos

24 24 moleculares mostram as similaridades antigênicas, morfológicas e semelhanças na capacidade de infectar diversos hospedeiros 39. Figura 1: Ciclo do Toxoplasma gundii e formas de infecção para o hospedeiro intermediário 36.Fonte: Galisteo, Para verificar a virulência de cepas de T. gundii observa-se a mortalidade de camundongos infectados com inóculos graduais do parasito e o período de sobrevivência dos que resistem à infecção. O isolado é classificado como virulento e avirulento baseando em dois critérios: 1º: virulentas, são cepas que provocam sintomas agudos e morte em camundongos em uma semana; 2º: baixa virulência são cepas que não provoca sintomas evidentes nos camundongos, porém são cronicamente afetados, apresentando cistos teciduais no cérebro 37. Virulência se caracteriza como a capacidade de um organismo invadir e colonizar células causando graves lesões ao hospedeiro 40. Com base neste critério, alguns pesquisadores realizaram alguns estudos de caracterização de oito cepas de T. gundii isoladas no Brasil, estes estudos mostraram a existência de heterogeneidade de virulência entre elas 41.

25 25 O isolamento de isolado virulento de T. gundii circulante na natureza é pouco conhecido 42. O que se tem identificado é que cepas de alta virulência encontradas no meio ambiente não produzem oocistos, já as produções de cistos teciduais em camundongos infectados experimentalmente são induzidas pela administração de sulfadiazina Estudos realizados sobre a diversidade biológica do T. gundii mostraram que suas linhagens podem ser classificadas em três grupos: clonais genotipicamente semelhantes, tipo I (virulenta), II e III (não virulentas ou com baixa virulência). A toxoplasmose humana apresenta uma predominância de cepas do tipo II, enquanto as cepas do tipo III se tornam mais freqüentes em animais O comportamento biológico dos grupos clonais do T. gundii, apresenta algumas características específicas, onde isolados I e II têm se associado à infecção congênita e a cepa III à infecção animal. As observações do comportamento biológico do parasito têm envolvimentos importantes na epidemiologia, gravidade da doença, manifestações clínicas e eficácia ao tratamento 49. Em estudos realizados no Brasil 41, provou-se que as cepas brasileiras apresentam uma recombinação genética onde há um envolvimento dos genes dominantes com alelos típicos de cepas dos tipos I, II e III na maioria loci examinados Mecanismos de Transmissão da Toxoplasmose O Ciclo biológico do Toxoplasma gondii se define em três estágios evolutivos, classificados como taquizoítos, bradizoítos (cistos) e esporozoítos (oocistos esporulados). As formas evolutivas deste protozoário são consideradas infectantes aos hospedeiros intermediários e definitivos 13. O Toxoplasma gundii pode infectar o organismo dos hospedeiros por uma transmissão horizontal ou vertical Transmissão Horizontal Ingestão de oocistos O oocisto esporulado forma em que o protozoário se encontra no estágio infectante, eliminado pelos felinos por meio de suas fezes,

26 26 contaminando solos, água e alimentos 23. Surtos de toxoplasmose estão associados ao tipo da fonte contaminada por oocistos. A água quando contaminada gera uma distribuição coletiva da contaminação 50. A ingestão de alimentos contaminados com oocistos esporulados pode ser um dos fatores responsáveis pela prevalência da infecção por T. gundii 23,51. Estudos ressaltam que infecções toxoplásmicas em indivíduos adultos ocasionada pela ingestão de oocistos esporulados tem uma patogenia mais delicada que as infecções induzidas pela ingestão de cistos teciduais 11, Ingestão de cistos teciduais O Toxoplasma gundii é comumente encontrado na forma de cistos em tecidos de animais produtores de carne e a ingestão dos mesmos crus ou malcozidos tornam-se um importante veículo na transmissão da toxoplasmose 11. Surtos de toxoplasmose registrados na literatura estão relacionados com a ingestão de carnes ou condimentos contaminados, os registros relacionados com a distribuição da infecção apresentam uma variabilidade de acordo com os hábitos alimentares e culturais das diferentes populações humanas O processamento realizado com as aves após o abate diminuir os riscos deste animal na transmissão da toxoplasmose. A prevalência nestes animais é baixa, sua carne é congelada e quando consumida é bem cozida 52. Alguns estudos apontam o sal como um inibidor no desenvolvimento de cistos teciduais de T. gundii, embora após um período de 48 horas não houve registros de cistos presentes em linguiça seca 55. Experimentos realizados na década de 90 mostraram a prevalência de formas viáveis de T. gundii em 67 amostras cárneos prontos para consumo (salames e similares) por meio da reação da cadeia polimerase (PCR), apontando falha no processo de cura Ingestão de leite cru O leite de hospedeiros intermediários (ovinos, caprinos e bovinos) pode apresentar taquizoítos; forma infectante do Toxoplasma gundii. Este tipo de

27 27 infecção se caracteriza durante a pré-lactação, onde o leite pode ser contaminado dentro da glândula mamária com cistos do protozoário abrigados nas células mamárias. Esses cistos são secretados junto com o leite, no processo de eliminação 57. Os taquizoítos são uma forma do T. gundii não sensíveis à ação de enzimas com atividade proteolítica e eliminada no processo de digestão gástrica, porém evidências trazem a possibilidade da sua penetração pela mucosa do esôfago, atingindo a circulação sanguínea e linfática antes de atingir a região estomacal 13. O processo de pasteurização destrói o Toxoplasma, este processo vem sendo recomendado especialmente no tratamento de leite destinado a pessoas imunologicamente mais susceptíveis a toxoplasmose que os adultos 13, Transmissão Vertical A transmissão vertical ocorre por via placentária, quando a fêmea contrai a infecção durante a gestação, por meio de qualquer estágio do parasito 1. A transmissão materna fetal apresenta três fatores que aumentam o risco, estando associado à parasitemia materno inicial ou recorrente, maturidade da placenta e sistema imune materno competente a resposta ao Toxoplasma 58. Em uma transmissão vertical o T. gundii se multiplica na placenta atingindo posteriormente os tecidos fetais. A infecção transplacentária pode se desenvolver em qualquer estágio da gestação, porém o acometimento do feto será mais severo na idade gestacional mais precoce Outros Mecanismos de Transmissão A transmissão da toxoplasmose também pode ocorrer também de forma direta através da inalação de oocistos esporulados. Outras vias transmissão são caracterizadas por transfusão de sangue e de componentes do sangue 59, transplantes de órgãos 60 e acidentes laboratoriais 61. Segundo Montano as mulheres estão mais vulneráveis a se infectar pelo T. gundii, uma vez que manipulam carne crua no preparo das refeições e o contato com as fezes do gato ao recolhê-las 58.

28 Imunidade A via normal para uma infecção pós-natal causada pelo T. gundii é a via oral, para que o parasito estabeleça um quadro infeccioso, necessariamente ele precisa vencer as barreiras físicas e químicas do sistema digestório. O T. gundii não se classifica como um parasita entérico, o que o obriga realizar uma proliferação inicial e invadir o epitélio intestinal para então disseminar nos tecidos mais profundos Resposta imune inata e celular na toxoplasmose A resposta imune celular é o elemento chave na defesa contra a toxoplasmose, durante a fase aguda da infecção os mecanismos inatos são estimulados pelo hospedeiro influenciando a ativação dos mecanismos de defesa adaptativa. A invasão do T. gundii no organismo hospedeiro estimula a ativação das linhagens celulares, como macrófagos, neutrófilos e células dendríticas 26. Quando o T. gundii invade os enterócitos, começa a ocorrer mudanças fisiológicas e morfológicas, permitindo as células a secretarem moléculas citotóxicas como o óxido nítrico (NO) 63. As respostas dos eritrócitos à infecção ocorrem pela secreção de quimiocinas e citocinas as quais atraem leucócitos polimorfonucleares (PMNs), macrófagos, células dendríticas e células Natural Killer (NK) para o local da infecção, as primeiras células a chegaram no local da infecção são os neutrófilos 62. As células polimorfonucleares no local da infecção estimulam a ativação dos macrófagos e das células dendríticas. A ativação inicial do sistema imune desenvolve funções importantes durante a infecção por T. gundii. Inicialmente o sistema imune limita a replicação dos taquizoítos antes da ativação da imunidade celular, posteriormente ocorre um desenvolvimento direto de uma resposta de células T por direcionar a diferenciação do precursor de células Th em células Th1 efetoras 64. Os receptores das células da imunidade inata são capazes de reconhecer padrões moleculares associados à patógenos (PAMPs), como exemplo tem-se os receptores Toll-like (TLRs). Alguns estudos sobre TLRs mostraram que esses receptores têm um importante papel no desencadeamento inicial da resposta imune celular contra o T. gundii 65.

29 29 A sinalização intracelular de TLRs pode ativar as moléculas MYD88 (principal adaptadora na sinalização TLRs), a maioria dos receptores Toll-like usa MYD88 para enviar os sinais dentro da célula do hospedeiro Através da via TLR/MYD88, o T. gundii estimula a produção de IL-12 por leucócitos PMNs, macrófagos, células dendríticas 66. Testes realizados com camundongos demonstraram que os receptores Toll-like (TLR) são importantes na resistência do hospedeiro contra o T. gundii. A mortalidade dos camundongos foi associada a um alto número de parasitas e a baixos níveis de citocinas pró-inflamatórias. A ativação de macrófagos se mostrou falha na ausência de MYD A resposta imune desenvolvida pelo hospedeiro pode variar de acordo com a cepa de T. gundii. Estudos mostraram que cepas virulentas desenvolvem infecções letais, por estimular a produção elevada de citocinas pró-inflamatórias, prejudicando o hospedeiro ao lesar tecidos parasitados ou normais. Animais infectados por cepas avirulentas conseguem imunologicamente controlar a replicação dos parasitos por produzirem níveis moderados de citocinas pró-inflamatórias provocando alterações teciduais mínimas Resposta imune humoral na toxoplasmose As imunoglobulinas M (IgM) são os primeiros anticorpos a serem produzidos pelo organismo hospedeiro após a infecção pelo T. gundii. Após um período de 3-10 dias de infecção pode se detectar no plasma a presença dessas imunoglobulinas, condição esta independe da cepa do parasito, espécie do hospedeiro, sexo ou idade 69. Como ativadoras do sistema complemento, as IgM se destacam como as mais eficientes, sua estrutura apresenta um ótimo processo de aglutinação e têm um alto nível de citotoxidade. As proteínas de superfície deste parasito são os antígenos alvos dessas imunoglobulinas 70. As imunoglobulinas M estão envolvidas na resposta de infecção aguda podendo continuar na fase crônica 71. As imunoglobulinas G (IgG) são a segunda classe de imunoglobulinas a participar no processo defesa humoral contra a toxoplasmose, os principais pontos de ataque de IgG são os antígenos de superfície do T. gondii 70. A

30 30 concentração de IgG reduz após a fase aguda da infecção, permanecendo baixa e estável durante toda a vida do indivíduo infectado 72. Em caso de toxoplasmose, as imunoglobulinas A (IgA) podem ser identificadas no trato digestivo e no plasma de animais e humanos 70. A persistência dessas imunoglobulinas em caso de toxoplasmose permanece por seis a sete meses, porém pode variar em quantidade ou duração em adultos e recém-nascidos infectados por via congênita 71. Determinar a presença de IgA é um fator importantíssimo para o diagnóstico da toxoplasmose aguda, uma vez que se torna raro encontrar essas imunoglobulinas na fase crônica da doença 73. A primeira linha de defesa do hospedeiro contra o T. gundii é mediada por anticorpos. A ação das imunoglobulinas se iniciam quando os taquizoítos rompem as células infectadas e as IgA realizam uma lise cística com a presença do sistema complemento evitando uma multiplicação celular. Os anticorpos também facilitam a ação do sistema complemento aumentando a capacidade de fagocitose pelos macrófagos Fontes de Infecção Bovinos Os primeiros relatos de toxoplasmose em bovinos foram descritos nos Estados Unidos por Sanger et al 12. Em estudos de casos naturais e induzidos observados na década de 80, não foram associadas causas de aborto e morte neonatal à infecções ocasionadas pelo T. gundii 1. Atualmente estudos descrevem a positiva suscetibilidade do gado bovino a infecção, sendo resistente à infecção induzida por T. gundii, não manifestando nem um sinal clínico 1, Os bovinos apresentam poucas manifestações clínicas quando infectados, sendo a forma natural de contaminação de herbívoros por oocistos. Rebanhos quando acometidos por infecção de T. gundii, podem estar associados a contaminação por ingestão de pastagens, ração, silagem e água contaminadas por oocistos. A alimentação de animais em locais contaminados por dejetos de felídeos pode elevar o risco da infecção A presença de oocistos na pastagem é a principal fonte de contaminação para bovinos 78.

31 31 O manejo e as condições higiênicas aplicadas na criação de bovinos de corte e leite associam algumas diferenças consideráveis, porém tais associações não determinam diferenças em relação ao comportamento do bovino nos padrões da ocorrência da toxoplasmose 79. Relacionando o aspecto infectante de Toxoplasma gundii, observa-se que sua resistência é menor com relação a prevalência em vacas no período de gestação ao se comparar com outras espécies como, ovelhas, porcas e cadelas gestantes 80. Estudos comprovaram que cistos teciduais podem permanecer viáveis em músculos e vísceras de bovinos durante toda a vida após infecção experimental. Os animais se mantem saudáveis, podendo manifestar alguns sintomas de leve anorexia e diarreia 74. O isolamento do parasita em bovinos não se caracteriza como fácil, mesmo diante de tal dificuldade, já houve identificação do parasita na retina e diafragma de bovinos. Já a transmissão congênita foi comprovada pela presença de parasitos em fetos de vacas gestantes 81. Os anticorpos séricos para o T. gundii são encontrados mundialmente em bovinos 80 e a soroprevalência em bovinos como em outras espécies pode ser variável de acordo com a região 79. A variabilidade da soroprevalência foi demonstrada em estudos realizados nos estados da Bahia e Mato Grosso, sendo neste último, estimada em 71%, enquanto na Bahia foi registrada uma prevalência de 11,83% para T. gundii em bovinos abatidos 5, 82. A frequência de estudos sobre a prevalência de anticorpos anti-t. gundii em bovinos no Brasil com positividade, foram realizadas nos estados de Minas Gerais, Paraná, São Paulo e Rio Grande do Sul 134,135. A elevada prevalência de soro-reagentes em bovinos mostra que esta espécie animal pode atuar como fonte de infecção não apenas por alimentação direta, mas também na manipulação de cortes bovinos crus ou malcozidos por funcionários de frigoríficos ou cozinheiros 79,136.

32 Humanos A toxoplasmose em humanos depende muito da via de transmissão, a mesma pode ser adquirida ou congênita 83,20. A infecção por T. gundii é muito comum, porém a manifestação clínica está quase limitada a indivíduos imunocomprometidos, sendo que a maioria dos casos de infecção em indivíduos imunologicamente competentes é assintomática Toxoplasmose congênita Toxoplasmose congênita é consequente da transferência transplacentária do Toxoplasma gundii para o concepto, podendo ser decorrente de uma infecção primária materna no período gestacional ou de reativação da infecção durante a gestação 84. As consequências ao feto possuem variações dependentes da exposição ao parasito, da virulência da cepa, do genótipo do parasito, do período de gestação e do tratamento prénatal A infecção primária do T. gundii em período gestacional é causa reconhecida de abortos em humanos, mortes neonatais e defeitos físicos e mentais nas crianças sobreviventes 87, 56,88. As complicações mais graves são relatadas quando a transmissão vertical ocorre no inicio da gestação no período da organogênese. Os taquizoítos transmitidos por via placentária invadem todos os órgãos fetais, porém persistem as lesões do sistema nervoso central (encefalomielite) e da retina (retinocoroidite). Em caso de infecções crônicas, as mães não contaminam o feto durante a gravidez 20. A toxoplasmose congênita pode ocasionar diversas consequências como: retardo mental severo, leve ou moderado; redução da visão e da audição. Cerca de 10% das crianças sobreviventes apresentam as três consequências clássicas da toxoplasmose congênita: hidrocefalia, retinocoroidite e calcificação intracraniana 87, 13. Uma das lesões mais frequente da toxoplasmose congênita é a retinocoroidite, esse tipo de lesão provoca uma inflamação na retina e necrose, resultando no rompimento da camada pigmentada e consequente infiltração de células inflamatórias. Essa evolução da doença resulta na formação de um tecido de granulação que invade o humor vítreo 83.

33 33 O período gestacional é um fator muito importante nas consequências da transmissibilidade da toxoplasmose congênita, quando a transmissão ocorre no terceiro trimestre da gravidez os efeitos no feto são menos consequentes, as crianças geralmente são assintomáticas ao nascer, podendo durante o seu desenvolvimento apresentar sintomas clínicos e deficiências neurológicas, visuais e auditivas 89. Devido à gravidade da toxoplasmose congênita, é de fundamental importância que o pré-natal se inicie no primeiro trimestre da gestação, o que permite uma identificação precoce de casos agudos de toxoplasmose gestacional. Sendo diagnosticada precocemente, o tratamento pode apresentar maior eficácia na redução de sequelas em recém nascidos 90, 17,91. O ministério da Saúde recomenda o inicio do tratamento com a administração de espiramicina, intercalando ou não com sulfadiazina, pirimetamina e ácido folínico, de acordo com o período de gestação e infecção 92. As maiores preocupações são voltadas para gestantes, devido à seriedade da infecção congênita podendo ser muitas vezes grave e até letais Toxoplasmose adquirida A infecção por T. gundii em indivíduos imunocompetentes é de caráter assintomático, sendo detectada somente quando há uma investigação específica em uma população em estudo 13. Quando os sintomas se tornam aparentes são leves e temporários, raramente são severos e permanentes 95. Os sintomas característicos da toxoplasmose após o nascimento envolvem aumento dos linfonodos na região cervical ou axilar, febre baixa, cefaleia, mialgia, artralgia e sensação de fadiga 53, 96. Os primeiros sintomas começam a surgir por volta dos 5 a 20 dias pós-infecção 20. A toxoplasmose ocular é uma evolução séria da forma adquirida da protozoose 97,56. O desenvolvimento da toxoplasmose ocular atinge a retinia, provocando o processo de retinite necrosante com lesões de aspectos ovais e circulares 96. A evolução do quadro pode provocar uma retinocoroidite, ocasionando a cegueira total ou parcial. A deficiência imunológica na retina permite com que os cistos continuem seu desenvolvimento no globo ocular mesmo após o individuo adquirir a imunidade 98. A toxoplasmose ocular requer

34 34 muita atenção, pois pode estar associado a surtos de origem alimentar ou hídrica 99,100. A forma adquirida da infecção humana por T. gundii ocorre por meio da ingestão de cistos bradizoítos presentes em carnes ou condimentos e por meio da ingestão de alimentos contaminados por oocistos esporulados, os quais são oriundos de fezes de gatos ou cães contaminados 101, 102, 8,103. A relação da carne bovina à cadeia epidemiológica na transmissão da toxoplasmose ainda é pouco conhecida, portanto estudos que possam determinar animais infectados entre bovinos abatidos exibirão com mais clareza essa ligação 74, 137. A infecção por toxoplasma também pode ser adquirida por transfusão sanguínea 104, transplante de órgãos 105, acidentes laboratoriais 89 ingestão de leite contaminado por taquizoítos 106. Nos Estados Unidos realizou-se uma pesquisa com um grupo de indivíduos pertencente a uma denominação evangélica (Adventista do sétimo dia), que não eram adeptos a carne em suas dietas, sendo detectado um menor risco de infecção por T. gundii, quando comparados a população em geral 107. Estudos comprovam que formas viáveis do parasito podem estar presentes nos músculos de diversos animais e testes sorológicos evidenciam a distribuição da infecção em animais destinados ao abate para o consumo de carne 138. Em áreas endêmicas, a água tem sido uma das principais fontes de toxoplasmose para humanos Toxoplasmose em imunocomprometidos Estudos recentes trazem evidências de que o T. gundii está relacionado a infecções com progressão neurológica e evolução a óbito, em indivíduos com sistema imune debilitado pela ação do câncer ou pela ação da síndrome da imunodeficiência adquirida (AIDS). A evolução da toxoplasmose em indivíduos imunocompetentes estimulou a comunidade científica a observar a ação do protozoário nestes organismos 110, 111,112. Infecções crônicas com características assintomáticas, em indivíduos com depressão imunológica ocasionada por diversos fatores etiológicos ou

35 35 terapias imunodepressoras (transplante de órgão) tornam se infecção aguda de rápida evolução, apresentando sinais clínicos de encefalite aguda fatal 20, Diagnóstico A base do diagnóstico da toxoplasmose envolve a detecção do parasito por meio de exames histológicos, ensaios de cultivos celulares, pela reação ou cadeia pela polimerase (PCR) e meio de testes sorológicos que detectam anticorpos específicos 114. As manifestações clínicas induzidas pelo T. gundii não são específicas, sendo necessário um diagnóstico diferencial, para qualquer uma das formas clínicas da toxoplasmose Diagnóstico sorológico O método inicial para diagnóstico da toxoplasmose se dá por meio de testes sorológicos para demonstração de anticorpos IgG e IgM ,115. A sorologia pode ser demonstrada pelo título anterior de anticorpos de anti-t. gundii em soros pareados ou por elevados título sérico de anticorpos numa única amostra de soro. Caso não ocorra a comprovação de títulos anterior ou de títulos elevados não se descarta o diagnóstico de toxoplasmose 103. Os testes de sorologia utilizados para diagnóstico de T. gundii são divididos em dois métodos específicos de acordo com o antígeno que utilizam: teste com uso de microrganismos intactos (Dye-test e RIFI) e teste com uso de proteínas oriundas do rompimento do parasito (ELISA, fixação de complemento e hemaglutinação indireta) Dye-test (teste do corante de Sabin-Feldman) Este teste corante de Sabin-Feldman foi o primeiro teste sorológico utilizado para o diagnóstico da toxoplasmose 118. O teste Dye-test é uma técnica que utiliza parasitos vivos, para confirmação da toxoplasmose. O processo baseia-se na adesão de anticorpos na superfície de taquizoítos viáveis, com posterior fixação do complemento e ruptura da parede celular. A ação do anticorpo sobre parasita tira a capacidade do parasito reter azul de metileno 114. O Dye-test é o teste mais específico no diagnóstico sorológico de toxoplasmose na espécie humana, para as demais espécies o teste de reação

36 36 de Sabin-Feldman não se caracteriza como o específico para infeção de toxoplasmose 119. Em bovinos este teste não é específico devido a ocorrência natural da globulina sérica, provavelmente IgM, que favorece falsos resultados 80, Reação e imunofluorescência indireta A reação de imunofluorecência indireta (RIFI) é utilizada no diagnóstico da toxoplasmose como padrão ouro. Por meio de estudos de Ishizuka, 1978 pode se comprovar que a prova de Imunofluorescência indireta tem eficácia semelhante à prova de Sabin-Feldman, a qual era considerada padrão na avaliação de anticorpos anti - T. gundii. Essa técnica utiliza lâminas de vidro com taquizoítos mortos, que são incubadas com soros diluídos a investigar. A segunda incubação envolve antisoro anti-imunoglobulina, conjugado isiotiocianato de fluoresceína. A leitura da prova envolve conhecimento, o que requer pessoas aptas para leitura Teste Imunoenzimático (ELISA) Essa prova é bem específica e faz o uso de reagentes estáveis, que possibilita testar vários animais ao mesmo tempo podendo ser automatizada descartando os riscos de manipulação A reação (ELIZA) se baseia na incubação de soros a serem examinados, numa única diluição, com antígenos presentes nos poços da placa de poliestireno. Após este processo ocorre a adição do conjugado anti-igg vinculado a uma enzima, resultando em uma reação colorimétrica medida pelo espectrofotômetro Teste de hemaglutinação indireta (HAI) Essa prova é de baixa sensibilidade em relação às outras provas sorológicas, outra característica que permite com que a prova esteja sempre na metodologia de várias pesquisas é o baixo custo por não necessitar conjugado de anti-igg específico e por apresentar uma especificidade adequada Este teste se baseia na fixação de antígenos oriundos da ruptura do taquizoíta, usando as hemácias como suporte, produzindo aglutinação visível 114.

37 Diagnóstico histológico O diagnóstico de cortes histológico de T. gundii é um processo difícil devido o corte reduzido feito do tecido animal. Outra dificuldade se da pelo processo de diferenciação dos cistos de T. gundii de cistos de outros protozoários como Sarcocystis spp. e Neospora caninum. A coloração adotada nesta histopatologia é a hematoxilina-eosina 126. Os cortes histológicos feitos com a técnica de imunoperoxidase, com uso do anti-soro para T. gundii apresenta boa sensibilidade e especificidade Diagnóstico clínico O caráter assintomático da toxoplasmose em indivíduos imunocompetentes, dificulta o diagnóstico clínico, em 10% a 20% dos casos, sendo os sinais clínicos mais comuns caracterizados por inchaço de um ou vários linfonodos. A toxoplasmose ocular congênita ou adquirida, que evolui para uma retinocoroidite pode ser diagnóstica por exame oftalmológico, com associação a testes sorológicos complementares Profilaxia As medidas profiláticas para animais de produção se volta à boas práticas de manejo desses animais, evitando sua exposição a oocistos 127. Reduzir a incidência de T. gundii em fazendas e granjas é um processo complicado, pois há diversas fontes de infecção nestes locais 11. Manipular animais de produção requer algumas medidas para reduzir o potencial zoonótico de T. gundii. As medidas necessárias são: evitar o contato de gatos e roedores com placenta ou fetos abortados, manter estoques de alimentos e rações fora do alcance de gatos, assim como evitar acesso de gatos em instalações de criação de animais a fim de destacar a presença de fezes do felino. Além dessas medidas, não tocar nos olhos ou mucosas ao manipular carne crua e fazer assepsia correta das mãos após a manipulação de carne crua são importantes para redução potencial 122. Os cistos do T. gundii podem ser eliminados com o congelamento de - 20ºC e aquecimento superior a 65ºC, porém o cozimento só se torna útil se atingir o tempo necessário permitindo que o aquecimento entre em contato com