ENGENHARIA DE TECIDOS PARA APLICAÇÕES CARDIOVASCULARES
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- Rodrigo Schmidt Wagner
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1 ENGENHARIA DE TECIDOS PARA APLICAÇÕES CARDIOVASCULARES -Aplicações cardiovasculares -Válvulas cardíacas -Próteses vasculares (grafts) - Miocárdio Fátima Vaz
2 ENGENHARIA DE TECIDOS PARA APLICAÇÕES CARDIOVASCULARES 1º Transplante coração Barnard American Heart Association : EUA 1997, só 2300 doentes em conseguiram coração novo 2001, doentes em espera Substituição com dispositivos mecânicos ou orgãos artificiais limitada - risco de infecção - tromboembolismo - durabilidade finita substitutos biológicos provenientes de Engª de Tecidos
3 1933 células c/ tumores de ratos colocadas na cavidade abdominal de porco não foram destruídas pelo sistema imunitário 1975 colocação de células do pâncreas em membranas semipermeáveis (diabéticos) fabrico de pele para doentes queimados ou com úlceras diabéticas 2001 cerca de 2500 cientistas e montante de 450 milhões de dólares Método mais comum = células + matriz Sistema aberto cultura in vitro de células isoladas + células são colocadas num suporte (sintéctico ou natural) + colocação do sistema célula/matriz no doente Limitação = volume de tecido que pode ser implantado e sobreviver é limitado pela distância de difusão das moléculas de nutrientes, trocas gasosas e remoção de detritos Sistema fechado células estão isoladas através de membrana permeável aos nutrientes e gases, mas estão protegidas da resposta imunitária
4 Suportes: naturais colagénio, HA, alginatos.. sintécticos (controla-se resistência, tempo de degradação, porosidade e microestrutura definir formas e tamanhos; biocompatíveis e bioabsorvíveis suporte do crescimento celular Ex: PGA, PLA e PLGA Em aplicações cardíacas PHA (polihidroxilalcanos) Células devem proliferar facilmente e capacidade se diferenciarem em vários tipos de células com funções diferentes Origem das células: Autólogas células do próprio doente: podem ser isoladas e crescer in vitro (Ex: músculos esqueleto endoteliais. Outras proliferam pouco em cultura Alogénicas dador humano, mas geneticamente diferente Sinegénicas dador humano, geneticamente idêntico Xenogénicas dador de espécie diferente (porco) Mais usadas células fetais
5 APLICAÇÕES CARDIOVASCULARES EUA nº total de implantes anual válvulas cardíacas (mecânicas e biológicas) pacemakers próteses vasculares Bypass (= oxigenadores ou cardiopulmonar bypass) Outros sistemas Bombas intra-aorta Dispositivos ventriculares 400 Corações artificiais 17
6 Coração artificial deve bater 35 a 40 milhões de vezes/ano Sangue: 5 a 6 litros/minuto Coração totalmente artificial Ex: polímero + Ti - dispositivos electromecânicos (converte energia eléctrica em acção mecânica) - formação de trombos Dispositivo ventricular assistido o coração do doente não é removido; em algumas semanas o dano cardíaco pode ser reparado e não ser necessário transplante Problemas : Tecido do coração não se regenera; cicatrizes (enfarte do miocárdio) = zonas mortas Vaso sanguíneo que alimenta o ventrículo é bloqueado parte do músculo cardíaco (=miocárdio) é privado de sangue morte de células
7 VÁLVULAS CARDÍACAS -Substituição de válvulas cardíacas EUA = num total mundial crianças nos EUA nascem com malformações cardíacas novas válvulas Há 4 válvulas cardíacas: -2 válvulas no canal atrioventricular AV: tricúspida (trifolheto) e mitral (bifolheto) -2 válvulas na saída do ventrículo válvulas aortica e pulmonar (trifolheto)
8 Tipos de células das válvulas cardíacas: -VICS valvar intersticial cells propriedades contrácteis e propriedades de excreção -VECS valvar endocardial cells manter superfície não trombogénica Matriz extra celular: MEC protegida/enrolada por monolayer de células VEC Componentes da MEC = moléculas de colagénio, elastina, proteoglicanos e glicoproteínas propriedades físicas e mecânicas
9 Camada da componente da MEC função Válvula Atrialis elastina recuperação das válvulas AV durante o fecho Fibrosa colagénio resistência à tracção Esponjosa proteoglicanos formação de camada hidratada resistência à compressão Ventricularis elastina retenção da est. de colagénio na válvula aorta e recuperação das válvulas arteriais durante o fecho
10 Válvulas cardíacas: mecânicas ou biológicas (implantadas: 55% mecânicas e 45% biológicas) Válvulas mecânicas: elastómero de silicone, ligas cobalto-crómio, titânio, carbono pirolítico, PTFE Tromboembolismo em 2-5% dos pacientes terapia continua de anticoagulantes - PTFE=aro exterior - Carbono pirolítico=aro interior - Ligas Co-Cr=restante Si adicionado ao carbono isotrópo para aumentar resistência mecânica e ao desgaste
11 Válvulas biológicas: Feitas de materiais de origem biológica (não requerem anti-coagulantes): a partir de cadáveres humanos a partir de tecidos de outras espécies (Ex: suínos ou bovinos) problemas (deterioração ao fim de 10 anos e calcificação)
12 Nenhuma destas válvulas tem capacidade de crescer doentes mais novos têm de ser reoperados tentativa de válvula viva substituta válvula ideal = (living artificial heart valve alternative) = LAHVA: - não trombogénica - não obstrutiva - resistente a infecções - quimicamente inerte - durabilidade elevada - fácil de introduzir
13 2 métodos (nos últimos 6 anos) Válvulas xenogénicas acelulares com adição de células ou permitindo o crescimento para o interior de células exteriores Bader et al: Removeram células de válvulas de porco Crescimento de células humanas in vitro Colocação das células na matriz acelular c/ este método evita-se a calcificação e outros problemas provocados pelas células xenogénicas Outro método removem-se as células fazem válvula biológica compósita com várias unidades (folhetos..) 2. Engenharia de tecidos
14 2. Engenharia de tecidos Transplante de células autólogas num suporte biodegradável na forma de válvula cardíaca: válvula pode crescer evitam-se problemas de infecções e trombogénicos Mayer et al iniciaram esta abordagem há 6 anos: 1º -ovelhas: suportes de PGA+ miofibroblastos+ células endoteliais de animais implantadas em folhetos nas válvulas arteriais (pulmonar) 2º repetiram o procedimento sem células e o folheto degradou-se em 8 semanas 3º usaram células da parede arterial Desenvolvimentos de outros autores: fibroblastos humanos+ células endoteliais de bovino em suportes de PGA diferentes tipos de suportes: PGA ou PHA ou P4HB = poli4-hidroxibutirato -PGA dá origem a folhetos demasiado rígidos; PHA ou P4HB têm melhor adesão celular - válvula trifolheto a partir de PHA poroso e células vasculares foi implantado
15 válvula trifolheto a partir de PHA poroso e células vasculares foi implantada na posição arterial (pulmonar) - NÃO SE FORMARAM TROMBOS/Coágulos - Funcionamento 5 meses - Muito trabalho a desenvolver óptima fonte de células, melhor suporte
16 Próteses vasculares (grafts) vasos sanguíneos = blood vessels Próteses vasculares: biológicas sintécticas Biológicas- Ex: retirar artéria abaixo do joelho e usar em bypass coronário, renal ou de artérias periféricas Maior duração que próteses sintécticas Ex: pacientes/ano USA Sintécticas é necessário usar em casos: 1) substituir ou bypass da aorta que ficou estreita ou sofreu aneurisma 2) performance insatisfatória das homopróteses 3)se não houver veia para prótese coronária ou outra artéria 4) problema de trombose
17 Sintécticas PTFE (TEFLON) ou DRACON PTFE: -boa resistência à tracção (resiste à pressão sanguínea) -baixa incidência de trombose - usado para próteses com diâmetros 4mm; caso contrário riscos de coagulação do sangue DRACON: -usado para locais com diâmetros superiores a 4mm -é o material mais usado em próteses vasculares -impregnado com colagénio -forma-se cápsula fibrosa à volta da prótese -usa-se heparina para evitar coagulação de sangue- trombose Engenharia de tecidos -
18 Artérias (diâmetros 3 a 4 mm) 1)Artérias- pequeno diâmetro trombos bloquear sangue fonte de células: células autólogas aceites pelo sistema imunitário, mas por exemplo, as células endoteliais não estão disponíveis em grande quantidade - células estaminais promissoras a longo prazo - células alogénicas as células musculares podem ser usadas, mas as células endoteliais têm de ser alteradas para serem aceites pelo sistema imunitário Manipulação das células por engenharia genética melhorar a aceitação imunitária
19 Engenharia de tecidos próteses vasculares vasos sanguíneos: Enxertos sintécticos com células endoteliais Vasos sanguíneos em colagénio Vasos sanguíneos auto-construídos Polímero sintéctico biodegradável Tecidos acelulares
20 Enxertos sintécticos com células endoteliais Enxertos sintécticos de diâmetro reduzido (3-4 mm) nunca foram bem sucedidos, ao contrário dos de diâmetro grande 6-10mm) (coágulos) Células endoteliais são colhidas da camada interior das veias periféricas Células são colocadas no interior de enxertos sintécticos de Dracon (PET) ou PTFE formam-se ligações entre as células e os enxertos sintécticos Monocamada de células endoteliais camada anti -trombogénica Células endoteliais Limitações: - sobrevivência e proliferação de células a longo prazo - os enxertos não são degradáveis e não se adaptam bem a longo prazo ao vaso sanguíneo
21 2. Vasos sanguíneos em colagénio ( Weinberg e Bell) gel de colagénio + células musculares + células endoteliais (não têm resistência mecânica) tecido tubular = 1ª camada de fibroblastos e colagénio+ 2ª camada de células musculares e colagénio 3ª camada de células endoteliais colocado num anel de DRACON (conferir resist.)
22 -Colagénio é o substracto ideal para a adesão celular, mas o gel tem baixa resistência mecânica; sem o suporte de Dracon rompem a pressão de 10 mm Hg - Dracon limita a adaptação biológica; tentar não usar estes suportes - aumentar a concentração de fibrilas de colagénio pressões de 110 mm Hg - limitações até hoje só 225 mm Hg, o que ainda não é aceitável para cirurgia de substituição de artérias
23 3. Vasos sanguíneos auto-construídos (L Heureaux et al) várias folhas enroladas 1º folha de células musculares é enrolada num mandril 2º enrolada uma folha de fibroblastos Tubo é colocado em cultura 8 semanas produção de mais células endoteliais; fibroblastos produzem matriz de proteínas melhor resistência pressão 2000 mmhg limitações longo tempo de cultura período de cultura das folhas celulares = 5 semanas período de cultura do conjunto = 8 semanas
24 4. Polímero sintéctico biodegradável implantação de células em polímeros biodegradáveis (Nicklason et al) estrutura de suporte de ácido poliglicólico PGA com células musculares da aorta de suínos o conjunto é colocado em cultura por várias semanas as células produzem grandes quantidades de proteínas que vão formar a matriz e ao mesmo tempo há a degradação do polímero 8 semanas de cultura em bioreactor (fluxo pulsado) e adição de células endoteliais histologia revelou fibras de colagénio e elastina pressões superiores a 2000 mmhg devido ao elevado teor de colagénio implantados em suínos- resistem mecanicamente Limitações desenvolvimento in vitro é muito longo e dispendioso e as células endoteliais podem não resistir ; se ficar polímero residual reacções inflamatórias
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26 5. Tecidos acelulares enxertos/suportes acelulares que após o implante vão recrutar células existentes na vizinhança do tecido Desvantagem migração das células in vivo não muito conhecido está longe da aplicação clínica Vantagem: - díficil isolar e expandir células humanas autólogas -as manipulações in vitro podem aumentar o risco de contaminação Badylak mucosa intestinal = camada de colagénio com 100 µm de espessura -Boas propriedades mecânicas -Pressão de rotura = 3517 mmhg -Implantado em artéria carótida canina (7 em 8 enxertos permaneceram desobstruídos após 120 dias de implantação - após 28 dias formação de camadas de células endoteliais problema: não há camada de células endoteliais no interior do enxerto para impedir a formação de coágulos
27 Trabalhos em curso: comparação dos diferentes métodos de semear células diferentes suportes poliméricos (PGA+PHA). vários tipos de células tipos de bioreactores Shin oka et al : - 1º implante de artéria pulmonar feita por Engª de tecidos em ser humano -Criança de 4 anos : suporte = PlA reforçado com fibras de PGA c/ 12 milhões de células e 10 dias em cultura -Reconstruir a artéria pulmonar com sucesso
28 MIOCÁRDIO Vaso sanguíneo que alimenta o ventrículo é bloqueado parte do músculo cardíaco (=miocárdio) é privado de sangue morte de células mal-formações congénitas Desenvolvimento através de Engª de tecidos de enxerto autólogo e contráctil Transplante directo de células para o miocárdio - Ex: cardiomiocitos fetais integrados em miocárdio de ratos - Ex: cardiomiocitos fetais em tecidos conjuntivos formam tecido contráctil - Usar células autólogas injectadas na zona do enfarte Sementes de células em suporte biodegradável - Suportes de PGA ou PLA porosos ou polímeros gelatinosos - Ex: células fetais cardiomiocitos de ratos em implantes porosos: as células sobrevivem, mas não há grandes melhorias na função ventricular No futuro usar células estaminais
29 traqueia Abordagens futuras 3 direcções: 1. uso e desenvolvimento de sistemas de cultura in vitro (bioreactores) 2. uso e desenvolvimento de tecnologias de microprocessamento para criar tecidos vascularizados e orgãos 3. Investigação na procura de células estaminais potentes e indiferenciadas
30 Uso e desenvolvimento de sistemas de cultura in vitro (bioreactores) -Obter microambiente dinâmico in vitro para produzir tecido com características estruturais e funcionais -Controlar fluidos, promover transferência de massa entre nutrientes e resíduos -Aplicação de fluxo pulsado (Estimulação hidrodinâmica) melhor qualidade do que estático produção de maior quantidade de colagénio maior resistência mecânica
31 2. Uso e desenvolvimento de tecnologias de microprocessamento para criar tecidos vascularizados e orgãos -fabricar tecidos grandes e orgãos (orgãos complexos ainda não é possível fazer) - Vascularização a longo prazo -tentativas: suporte polimérico tridimensional biodegradável por impressão directa e implante de células, mas não existe microcirculação = capilares (10 µm de diâmetro) tecnologia micro Microelectromechanical systems =MEMS - MEMS usada em circuitos integrados * permite imprimir estruturas complexas (árvores) em sílicio * estas estruturas são os moldes para as réplicas em PLGA * onde se depositam células endoteliais * fabrico de fígado (microvasculatura)
32 3. Investigação na procura de células estaminais potentes e indiferenciadas -Embora as células autólogas sejam excelentes fontes de células, não são totalmente diferenciadas e têm uma capacidade decrescente de proliferação (hepatócitos e cardiomiocitos) -células com maior capacidade de proliferação = CÉLULAS ESTAMINAIS - Células estaminais pluripotentes foram recentemente isoladas de tecidos fetais humanos - Muitos tecidos adultos têm células estaminais: - Ex: células ovais do fígado podem-se diferenciar e tornarem-se potentes progenitoras de células - Ex: célula satélite do esqueleto, da medula podem diferenciar-se em condições de cultura diversas
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