PONTIFÍCIA UNIVERSIDADE CATÓLICA DE MINAS GERAIS EFEITO DO FATOR DE CRESCIMENTO EPIDERMAL (EGF) EXÓGENO NA MOVIMENTAÇÃO ORTODÔNTICA EM RATOS:

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1 1 PONTIFÍCIA UNIVERSIDADE CATÓLICA DE MINAS GERAIS EFEITO DO FATOR DE CRESCIMENTO EPIDERMAL (EGF) EXÓGENO NA MOVIMENTAÇÃO ORTODÔNTICA EM RATOS: AVALIAÇÃO HISTOQUANTITATIVA RENATA KARINA GOMES CIMINI SADDI Belo Horizonte 2004

2 2 RENATA KARINA GOMES CIMINI SADDI EFEITO DO FATOR DE CRESCIMENTO EPIDERMAL (EGF) EXÓGENO NA MOVIMENTAÇÃO ORTODÔNTICA EM RATOS: AVALIAÇÃO HISTOQUANTITATIVA Dissertação apresentada ao curso de Mestrado da Faculdade de Odontologia da Pontifícia Universidade Católica de Minas Gerais. Área de concentração: Ortodontia. Orientador: Dr. José Bento Alves. Belo Horizonte 2004

3 3 Dedico esta dissertação, fruto de muita fé e trabalho, aos meus pais Sônia e Darcy e ao meu marido Jean Joseph, que fizeram seus os meus sonhos e me apoiaram incondicionalmente em todos os momentos, sempre acreditando que eu saberia chegar ao meu destino.

4 4 AGRADECIMENTO ESPECIAL Agradeço a Deus, que se faz presente em todos os momentos da minha vida, guiando todos os meus passos. Agradeço principalmente por ter colocado no meu caminho, como meu orientador, o professor Doutor José Bento Alves, que, com maestria e paciência, me iniciou no caminho da pesquisa. À sua esposa, Dra. Marlene, que juntamente com ele abriram as portas de sua casa para me receber nos finais de semana para que pudéssemos finalizar este nosso trabalho.

5 5 AGRADECIMENTOS Aos meus pais, por sempre me apoiarem e acreditarem no meu potencial, dando-me suporte emocional e financeiro para que eu chegasse ao meu objetivo. Ao Jean, que esteve ao meu lado em todos os momentos desta caminhada, apoiandome e vivendo comigo as angústias e vitórias. Aos meus irmãos Keyla e Tadeu, que sempre acreditaram em mim. À minha avó Jacy, à minha sogra Yvone e à tia Geta, minhas intercessoras. Às minhas sobrinhas Jéssica e Luana, ao meu cunhado Aldair por entenderem minha ausência. Ao amigo professor Antônio Barbosa da Silveira, por suas sugestões na redação deste trabalho. Ao professor Wellington Pacheco, que me incentivou a buscar os meus sonhos. Aos professores Hélio Brito e Tarcísio Junqueira, nossos exemplos de dedicação ao ensino. Aos professores do COP Ênio Mazzieiro, Heloísio Resende Leite, Bernardo Quiroga Souki, Armando Lima, José Maurício Barros Vieira, José Eymard Bicalho, Júlio Brant, Henrique Tôrres, Flávia Mourão e Flávio Almeida, pela amizade, conhecimento e dedicação para que obtivéssemos o melhor do curso. Ao professor Eustáquio Afonso Araújo, exemplo de dedicação à Odontologia. Ao professor Roberval de Almeida Cruz, por sua determinação em formar novos mestres. Aos meus colegas de turma: Antônio, pelo carinho e dedicação ao curso. André, pela amizade e pelo incentivo a todo o momento.

6 6 Max, pelo carinho, tranqüilidade e sinceridade. Karen e Simone, pela amizade, pelo apoio, pela solidariedade, tornando mais suave o nosso convívio diário. Adauto, Sérgio e Leandro, pela convivência agradável. Ludimila, Cássio, Jordana, Lívia, Milena e Valéria, pela amizade e pelo companheirismo. À professora Gerluza, que abriu as portas do laboratório de Morfologia do ICB UFMG. Ao professor Pietro Ciancaglini, por sua contribuição fundamental para a elaboração deste trabalho. A Ana Cristina Aguiar, Suzana Cruz, Cristiane, Marcelo e Polyanna pela disponibilidade em me ajudar. Aos funcionários da administração do COP: Ana Paula, Angélica, Edna, Denise, Roberto, Silvânia e Vitório, pela paciência, carinho e disponibilidade. Às funcionárias da Clínica de Ortodontia, Andreza, Antônia, Cida, Luzia, Mara, Mariângela, Poliana e Raquel, pela compreensão, paciência, carinho e prontidão em nos atender. Aos pacientes, pela paciência e confiança. Ao Fundo de Incentivo à Pesquisa FIP -, por viabilizar economicamente a realização deste trabalho. A Solange e ao Rafaelo, pelo carinho com que atenderam aos meus pedidos. Aos animais que doaram suas vidas pela ciência. A todas as pessoas que, de certa forma, concorreram para a realização e elaboração deste trabalho, meus sinceros agradecimentos.

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8 8 RESUMO O processo de remodelação óssea envolve um mecanismo complexo, mediado por uma cascata de eventos moleculares, nos quais participam moléculas sinalizadoras, tais como fatores de crescimento e seus receptores. Fatores de crescimento são citocinas que têm função biológica importante na diferenciação e multiplicação celular. A participação de fatores de crescimento em vários processos biológicos, incluindo reparo e remodelação óssea, evidencia que a utilização de fatores de crescimento exógenos pode facilitar o processo de remodelação óssea durante a movimentação ortodôntica. Este trabalho tem como objetivo avaliar os efeitos da administração do fator de crescimento epidermal EGF na movimentação ortodôntica e fornecer subsídios para o entendimento dos mecanismos biológicos, mediados por fatores de crescimento, na referida movimentação. Foram selecionados 30 ratos Holtzman, machos, com peso corporal variando entre 237e 390 g. Após a instalação dos dispositivos ortodônticos e a administração local de EGF carreado pelos lipossomas, os animais foram sacrificados após cinco dias. As maxilas foram moldadas, e, por meio de medições feitas nos modelos de gesso, foi quantificada a movimentação ortodôntica. Fragmentos de maxilas foram processados para técnicas histológicas e histométricas, e foi quantificado o número de osteoclastos presentes durante a movimentação ortodôntica. Os resultados histométricos mostraram aumento do número de osteoclastos no processo de remodelação óssea no subgrupo no qual foi administrado o EGF durante a movimentação ortodôntica, e os resultados da quantificação da movimentação dentária mostraram um aumento estatisticamente

9 9 significante neste grupo. Concluiu-se que o EGF promove aumento do recrutamento de osteoclastos durante a fase inicial da movimentação ortodôntica e aumenta a quantidade de deslocamento dentário, e que os lipossomas foram efetivos no carreamento do EGF para o local desejado.

10 10 ABSTRACT Bone remodelling is a complex process regulated by several mediators. Cytokines and growth factors have significant effects on bone cell metabolism. Growth factors are cytokines with important biological function, such as activating cellular proliferation and or differentiation. The role of growth factors on several processes, such as bone repair and remodelling, shows up that the use of exogenous growth factors may enhance bone remodeling during the tooth movement. The purpose of this study is to asses the effect of the EGF exogenous carried by lyposomes in the tooth movement and provides subsidies for the understanding of the biological mechanisms mediated by growth factors. The sample consisted of 30 male animals of the Holtzman strain that were sacrificed at the end of five days. The histometric data revealed an increased number of osteoclast on the remodeling process on the EGF group. The tooth movement quantization showed a statistically significant increase of tooth movement in the same group. It suggests that the EGF increased the osteoclastic differentiation and migration and accelerated tooth movement. The lyposomes showed to be effective on carrying EGF to the sites where it is requested.

11 11 LISTA DE FIGURAS Figura 1 Recrutamento e diferenciação de osteoclastos Figura 2 Ciclo da remodelação óssea Figura 3 Estrutura do EGF Figura 4 Vias de sinalização do EGF. IGF1-R - receptor do fator de crescimento semelhante a insulina-1; GPCR- proteína G duplo receptora; MMP- metaloproteinases da matriz; HB-EGF- receptor do ligante do fator de crescimento epidermal heparina Figura 5 Interação entre o EFGR e a via de sinalização da COX-2. Proteína Mitogênica Ativadora quinase-quinase (MAPKK); Proteína Mitogênica Ativadora quinase (MAPK); tirosina residual (TYR); cicloxigenase-2 (COX-2); fatores de transcrição nuclear (C-myc, C- fos, C-jun) Figura 6 Estrutura do lipossoma Figura 7 Preparação do lipossoma Figura 8 Animal posicionado na mesa operatória Figura 9 Ilustração da instalação do aparelho para movimentação dentária Figura 10 Aparelho instalado Figura 11 Medição da força ortodôntica Figura 12 Representação esquemática do movimento experimental da banda elástica Figura 13 Seringa de precisão Hamilton Figura 14 Coleta da amostra: maxila dissecada Figura 15 Paquímetro usado para as medições da quantidade de movimentação dentária. Paquímetro Digimess-Brasil Figura 16 Medição da quantidade movimentação dentária Figura 17 Adaptação do desenho esquemático de Waldo e Rothblatt (1954), para mostrar a área avaliada histométricamente Figura 18 Retículo + Fotomicrografia... 68

12 12 LISTA DE GRÁFICOS Gráfico 1 Representação gráfica da variação do peso corporal dos animais do grupo I Gráfico 2 Número de osteoclastos por área nos diferentes subgrupos estudados Gráfico 3 Correlação entre a quantidade de deslocamento dentário e número de osteoclastos ( Análise de Spearman)... 81

13 13 LISTA DE TABELAS Tabela 1 Caracterização dos ratos quanto ao peso inicial e final do grupo I Tabela 2 Comparação dos pesos iniciais e finais de todos os subgrupos do grupo II Tabela 3 Caracterização das medidas descritivas da quantidade de deslocamento dentário do grupo I Tabela 4 Análise descritiva da quantidade de deslocamento dentário nos diferentes tratamentos.do grupo II Tabela 5 Avaliação da diferença da quantidade de deslocamento dentário entre os subgrupos considerando-se o tratamento Tabela 6 Análise descritiva das medidas do grupo I e dos subgrupos S/Trat e Banda EGF/Lipo Tabela 7 Avaliação da diferença da quantidade de deslocamento dentário entre o grupo I e os subgrupos S/Trat e Banda/EGF/Lipo Tabela 8 Análise descritiva do numero de osteoclastos nos diferentes tratamentos. Avaliados segundo valores das médias, medianas, minimo e máximo Tabela 9 Comparação do número de osteoclastos entre os diferentes tratamentos, considerando-se o lado controle e experimental. 79

14 14 LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS BMP EGF EGFR FGF GPCR M-CSF proteína morfogenética do osso fator de crescimento epidermal receptor do fator de crescimento epidermal fator de crescimento fibroblástico proteína G duplo receptora fator de crescimento formador de colônia de macrófago HB-EGF receptor do fator de crescimento epidermal-heparina IGF LUV MAPK fator de crescimento semelhante a insulina vesícula unilamelar grande proteína mitogênica ativadora quinase MAPKK proteína mitogênica ativadora quinase-quinase MLV NITI PBS PDGF PGE 2 PGs SUV 7*) TNF TYR VEGF vesícula multilamelar grande liga de níquel-titânio solução salina tamponada fator de crescimento derivado de plaqueta prostaglandina E Prostaglandinas vesícula unilamelar pequena fator de crescimento fibroblástico fator de crescimento de necrose tumoral tirosina residual fator de crescimento vascular endotelial IL-1 interleucina 1 COX 2 cicloxigenase 2

15 15 SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO REVISÃO DA LITERATURA Biologia do periodonto Ligamento Periodontal Cemento Tecido ósseo e o processo da remodelação óssea Biologia do movimento ortodôntico Movimento ortodôntico Modelo experimental em ratos Drogas na movimentação ortodôntica Citocinas e fatores de crescimento Carreadores de substâncias lipossomas OBJETIVOS Objetivo geral Objetivo específico MATERIAL E MÉTODO Seleção dos animais Divisão da amostra Preparação das drogas Pesagem dos animais Anestesia dos animais Inserção e ativação dos dispositivos ortodônticos Administração das drogas... 60

16 Sacrifício dos animais e moldagem final Quantificação do movimento Preparação dos espécimes Análise histométrica Análise estatística RESULTADOS Variação de peso dos animais Análise da quantidade de deslocamento dentário Quantidade histométrica contagem de osteoclastos DISCUSSÃO CONCLUSÃO PERSPECTIVAS REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS... 93

17 17 1 INTRODUÇÃO

18 18 1 INTRODUÇÃO Os aspectos biológicos do movimento dentário têm sido avaliados dentro do programa de Mestrado em Ortodontia da PUC Minas. Nessa linha de pesquisa, foram concluídas quatro dissertações sob a orientação do professor Dr. José Bento Alves. A abordagem da ação de fatores de crescimento constitui, sem dúvida, uma nova perspectiva de integração da área básica com a prática clínica. O osso está em constante remodelação (HILL & ORTH, 1998), e o turnover ósseo ocorre graças à atividade celular dos osteoblastos, osteócitos, macrófagos e clastos (FRANCISCHONE et al., 2002). A remodelação óssea e o movimento dentário resultante são processos complexos regulados por vários mediadores e, em ortodontia, esses processos são iniciados pela aplicação da força mecânica (YOKOYA et al., 1997). Trabalhos recentes revelaram que citocinas e fatores de crescimento têm efeitos significantes no metabolismo celular ósseo (UEMATSU et al., 1996b; GAO et al., 2002; KOHNO et al., 2003). O estresse mecânico parece produzir respostas bioquímicas e estruturais em uma variedade de tipos de células in vivo e in vitro. Numa fase precoce da movimentação dentária, ocorre uma resposta inflamatória caracterizada por vasodilatação periodontal e migração dos leucócitos para fora dos capilares do ligamento periodontal (DAVIDOVITCH et al., 1988). Um grande número de agentes estimulantes de células ósseas têm sido identificados, tais como paratormônio, hormônio tireoidiano, calcitonina, testosterona, esteróides, 1,25-dihidroxivitamina D 3, prostaglandinas, endotoxinas, fatores ativadores de osteoclastos e uma variedade de drogas que interagem com

19 19 transporte de minerais e de enzimas ou com síntese de proteínas (DAVIDOVITCH, 1979). O mecanismo de reabsorção óssea pode ser influenciado também pela liberação de mediadores inflamatórios. A prostaglandina E (PGE) e a interleucina I (IL)-1 interagem com as células ósseas, a LQWHUOHXFLQD estimula a reabsorção óssea e induz a proliferação de osteoclastos, o fator de necrose tumoral (TNF)-. estimula a reabsorção óssea e a multiplicação de células ósseas, a interleucina 6 e a 2- microglobulina potenciam a ligação do fator de crescimento semelhante à insulina I (IGF-I) às células ósseas, resultando em formação óssea, e o fator de crescimento epidermal (EGF) acelera a erupção dos incisivos em animais recém-nascidos e é importante na proliferação celular (UEMATSU et al., 1996). O fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) tem a capacidade de induzir a diferenciação de osteoclastos funcionais e a neovascularização (BOOTH et al., 1998; RABIE et al., 2002; KOHNO et al., 2003). Os fatores de crescimento possuem efeitos sobre células da mesma classe (fatores autócrinos) ou sobre células de outra classe, dentro do tecido (fatores parácrinos), e estão presentes na circulação, podendo agir como reguladores sistêmicos do metabolismo esquelético ou ser produzidos localmente. Possuem ação direta e importante tanto no crescimento celular como na aposição e reabsorção óssea e, possivelmente, na fisiopatologia das disfunções ósseas (HILL & ORTH, 1998). Levando em consideração que, como ortodontistas, objetivamos uma movimentação dentária mais rápida, com formação óssea de qualidade e diminuição do tempo de tratamento, julgamos que a pesquisa sobre a avaliação do efeito da administração dos fatores de crescimento durante a movimentação ortodôntica experimental oferece base científica para sua utilização na prática ortodôntica.

20 20 2 REVISÃO DE LITERATURA

21 21 2 REVISÃO DE LITERATURA Para melhor compreensão, este capítulo foi dividido em: Biologia do Periodonto; Biologia do Movimento Ortodôntico; Citocinas e Fatores de Crescimento; e Lipossomas. 2.1 BIOLOGIA DO PERIODONTO O periodonto, definido como tecido de suporte e revestimento dos dentes, consiste em gengiva, ligamento periodontal, cemento radicular e osso alveolar, o qual se divide em osso alveolar propriamente dito e processo alveolar (LINDHE & KARRING, 1999; TEN CATE, 2001) Ligamento Periodontal O ligamento periodontal é composto por um tecido conjuntivo frouxo, ricamente, vascularizado e celular, que une o cemento radicular à lâmina dura do osso alveolar propriamente dito. Comunica-se com os espaços medulares do osso alveolar através dos canais de Volkmann, sendo composto por fibras colágenas e células como fibroblastos, osteoblastos, cementoblastos, osteoclastos, células

22 22 mesenquimais indiferenciadas, células epiteliais e nervosas. O ligamento periodontal, intimamente ligado à lâmina dura, torna possível a distribuição e a absorção de forças produzidas durante a função mastigatória e a deglutição através do osso alveolar, que é viscoelástico e resistente a deslocamentos (ROBERTS et al., 1981; LINDHE & KARRING, 1999). Os fibroblastos são células predominantes do ligamento periodontal que possuem a função de regeneração do aparato de suporte dentário, podendo se diferenciar em cementoblastos ou em osteoblastos, dependendo das condições às quais estão submetidos, pois migram através dos tecidos, ao longo das fibras colágenas para o cemento ou para o osso. São capazes de degradar e sintetizar colágeno simultaneamente, e, utilizando essa capacidade, controlam a remodelação de colágeno dentro do ligamento periodontal (TEN CATE, 1976; TEN CATE, 2001). Nos tecidos periodontais com função normal, há um turnover moderado de células, no qual há um equilíbrio entre a morte por apoptose e a proliferação celular (TEN CATE, 2001). As fibrilas do ligamento periodontal estão incluídas em uma substância fundamental amorfa, que contém glicosaminoglicanos, sais, proteoglicanas, glicoproteínas e água. A compressão deste faz com que o fluido tissular seja comprimido para fora da área, mas a substância fundamental permanece no tecido fibroso (REITAN & RYGH, 1996; TEN CATE, 2001). Estendem-se, continuamente, do dente ao osso alveolar propriamente dito. Os feixes individuais seguem um curso ligeiramente ondulado que permite ao dente mover-se em seu alvéolo (mobilidade fisiológica) (LINDHE & KARRING, 1999; TEN CATE, 2001).

23 Cemento O cemento radicular é um tecido mineralizado, especializado, que recobre as superfícies radiculares dos dentes. Não contêm vasos sangüíneos e linfáticos, sendo constituído de fibras colágenas e cristais de hidroxiapatita (LINDHE & KARRING, 1999). Desempenha diferentes funções, insere as fibras do ligamento periodontal à raiz e contribui para o processo de reparo, após danos à superfície radicular. Não exibe períodos alternados de reabsorção e aposição, mas aumenta de espessura durante toda a vida, pela deposição sucessiva de novas camadas, consideravelmente mais pronunciada na porção apical da raiz do que na porção cervical (LINDHE & KARRING, 1999) Tecido ósseo e o processo da remodelação óssea O osso é um tecido dinâmico que sofre remodelação constantemente (HILL et al., 1998). É um tecido conjuntivo mineralizado, especializado, formado basicamente por matriz orgânica constituída por proteínas colágenas, como colágeno tipo I (28%), e não colágenas, como osteocalcina, osteonectina, sialoproteína, fosfoproteína, proteínas específicas (5%), totalizando 33%, e por fração inorgânica composta por vários elementos minerais entre eles o cálcio, o fósforo, o magnésio, e o sódio, agrupados sob a forma de cristais de hidroxiapatita (67%) (TEN CATE, 2001).

24 24 Macroscopicamente, pode-se observar no osso, tanto em secções transversas quanto longitudinais, uma camada externa mais compacta, chamada de osso cortical, circunscrevendo a parte interna ou cavidade medular, que in vivo é preenchida por medula óssea amarela ou vermelha. Nessa cavidade medular, podese observar ainda uma rede reticular, extremamente porosa, de tecido mineralizado, que constitui o osso esponjoso ou trabecular (TEN CATE, 2001). Do ponto de vista histológico, o osso pode ser classificado como: osso não lamelar embrionário, osso imaturo e osso maduro (osso lamelar) (TEN CATE, 2001). Revestindo o osso compacto, encontra-se uma membrana externa, de tecido conjuntivo, com potencial osteogênico, o periósteo, que possui duas camadas diferentes e contíguas. A camada mais externa, onde se encontram os fibroblastos, é mais fibrosa, dá suporte às fibras de Sharpey que penetram na camada interna e se inserem no osso. Já a camada interna é mais celular, possui os osteoblastos e está em contato íntimo com a superfície óssea (TEN CATE, 2001; CONSOLARO et al., 2001). Internamente, o osso é revestido pelo endósteo, que também apresenta potencial osteogênico, e é formado por uma fina camada reticular de células ósseas que cobre todas as paredes internas do osso, incluindo as trabéculas, estabelecendo a separação física entre a superfície óssea interna e a medula óssea (TEN CATE, 2001). O processo alveolar origina-se do folículo dentário, em íntima associação com o desenvolvimento e a erupção dos dentes, e é gradualmente reabsorvido quando os dentes são perdidos (LINDHE & KARRING, 1999; TEN CATE, 2001). Os principais componentes celulares encontrados no osso são osteoblastos, osteoclastos e osteócitos (TEN CATE, 2001).

25 25 Os osteoblastos são reconhecidos como as células que controlam a formação e a reabsorção óssea, no ciclo de remodelação óssea (SANDY, 1992; TEN CATE, 2001). São células uninucleadas, derivadas de células mesenquimais multipotentes, geralmente consideradas diferenciadas de células precursoras, os pré-osteoblastos, que sintetizam colágeno e proteínas ósseas não colagenosas (matriz orgânica, osteóide). São responsáveis pela mineralização do tecido ósseo. Constituem uma camada celular sobre a camada óssea, formando uma membrana óssea que controla o fluxo de íons dentro e fora do osso (TEN CATE, 2001). Quando o osso não está sendo formado, a camada de osteoblastos torna-se inativa e é chamada de células de revestimento. O núcleo de tais células torna-se achatado, formando uma camada de menos de 0,1µm de espessura. Essa camada de células mantém sua ligação com os osteócitos criando, assim, um sistema que controla a homeostase mineral e assegura a vitalidade óssea. Pré-osteoblastos, e em menor extensão, os osteoblastos, exibem altos níveis de fosfatase alcalina. Esta enzima, a qual é usada experimentalmente como marcador citoquímico, distingue o osteoblasto do fibroblasto. Funcionalmente, acredita-se que o fosfato liberado parece contribuir para o início e progressivo crescimento dos cristais de minerais ósseos (TEN CATE, 2001). Os osteoblastos, nos seus diferentes estágios de diferenciação, podem produzir fosfatase alcalina, colágeno tipo I, osteocalcina, osteopontina, fatores de crescimento, citocinas, fatores estimulantes de colônias, colagenase, TIMP (tecido inibidor de metaloproteinases) e ativador de plasminogênio (SANDY, 1992; TEN CATE, 2001).

26 26 Estes fatores autócrinos e parácrinos, os quais incluem os fatores de crescimento, ajudam a regular o metabolismo celular (TEN CATE, 2001). Os osteoblastos secretam também, vários tipos de proteínas morfogenéticas do osso (BMP) incluindo a BMP2, BMP7, fator de crescimento transformador beta 7*) IDWRU GH FUHVFLPHQWR VHPHOKDQWH à insulina (IGF-I e IGF-II), fator de crescimento derivado de plaquetas (PDGF) e fator de crescimento fibroblástico beta )*)$FRPELQDção dos IGF-I, TGF-H3'*)SDUHFHDXPHQWDUDYHORFLGDGHGH formação e reparo ósseo, e parece ser muito importante no futuro da terapia dentária (TEN CATE, 2001). Os hormônios mais importantes no metabolismo ósseo são o hormônio da paratireóide, 1,25 dihidroxivitamina D, calcitonina, estrógeno, e os glicocorticóides (TEN CATE, 2001). Os osteócitos, que representam o estágio terminal de diferenciação da linhagem dos osteoblastos, são células que foram incorporadas dentro da nova matriz óssea formada. Durante esse processo, as células tornam-se menores, com poucas organelas celulares, e mantêm contato entre si e com os osteoblastos, através de prolongamentos celulares (SANDY, 1992; TEN CATE, 2001). Os osteoclastos são macrófagos multinucleados originados da fusão de células mononucleares de origem hematopoiética (TSAY et al., 1999; RODY et al., 2001). São células assimétricas que apresentam a região da borda irregular, que se liga à superfície óssea, onde a atividade de reabsorção ocorre. Devido ao seu tamanho, podem ser facilmente identificadas à microscopia de luz. São identificadas citoquimicamente pelo processo do fosfatase ácida resistente ao tartarato (TRAP) positivo, o que as distingue de células gigantes. Normalmente, são encontradas na

27 27 superfície óssea, ocupando depressões criadas por eles, chamadas de lacunas de Howship (TEN CATE, 2001). A regulação do desenvolvimento dos osteoclastos é carreada por numerosas substâncias, tais como hormônios, citocinas, fatores de crescimento e constituintes da matriz óssea (TEN CATE, 2001). No ciclo da remodelação óssea normal, ocorre reabsorção osteoclástica, uma fase reversa, seguida por formação de novo osso para reparar o defeito. Inicialmente, a ativação dos osteoblastos que revestem a superfície óssea, dá-se através do hormônio da paratireóide (PTH), hormônio do crescimento (GH) e interleucina-1 (IL-1), que produzem uma cascata de sinais, com a liberação de citocinas tais como, IL-1, IL -6, IL -11, fator de crescimento estimulante de colônias de macrófagos (M-CSF), fator de crescimento de necrose tumoral (TNF), e fator de crescimento transformador beta (TGF- TXH SURPRYHP R UHFUXWDPHQWR GH osteoclastos e seus precursores (HILL & ORTH, 1998; TEN CATE, 2001). Esses sinais intercelulares aumentam o recrutamento e a diferenciação de células multinucleadas, originadas das células do tecido hematopoiético (HILL & ORTH, 1998). Várias moléculas são de grande importância para a regulação da diferenciação dos osteoclastos, como o fator de transcrição PU-1, expresso nos precursores dos osteoclastos, necessário para os estágios iniciais da diferenciação dos osteoclastos e monócitos, enquanto outros fatores de transcrição, incluindo o c- fos e NFkB desempenham um papel essencial na estimulação e diferenciação dos precursores em osteoclastos maduros. A formação e ativação dos osteoclastos dependem também do contato entre os precursores de osteoclastos e células mesenquimais da medula óssea. Essas células secretam a citocina M-CSF, que é essencial para diferenciação de ambos, osteoclastos e macrófagos, a partir de um

28 28 precursor comum. Na superfície de uma célula mesenquimal, uma molécula chamada ligante do RANK (RANKL) interage com outro receptor, presente na superfície celular do precursor do osteoclasto, chamado RANK (receptor ativador do fator nuclear Kappa B), promovendo a sua diferenciação em osteoclasto maduro. A interação RANK-RANKL pode ser bloqueada por outra molécula chamada osteoprotegerina (OPG), que é um falso ligante para o receptor RANK e que age como um potente inibidor da formação osteoclástica (CHAMBERS, 2000; MENAA et al., 2000; RODAN & MARTIN, 2000; RALSTON, 2002) (Fig 1). Células Hematopoiéticas Célula do tecido conjuntivo Macrófago Pré-osteoclastos Osteoclasto Maduro Próton H+ Enzimas Proteolíticas Regulados pelos: Hormônios calciotrópicos Citocinas Hormônios esteróides FIGURA 1 Recrutamento e diferenciação de osteoclastos. IL-3 = interleucina -3; M-CSF= fator de crescimento estimulante de colônia de macrófagos; GM-CSF= fator de crescimento estimulante de colônias de macrófagos e granulócitos; OPG= osteoprotegerina; RANK = receptor do ativador do fator nuclear kappa B; RANKL= ligante do receptor de ativador do fator nuclear kappa B. FONTE: Adaptação de RALSTON, 2002 Na fase de reabsorção ocorre, inicialmente, a aderência dos osteoclastos, na superfície óssea, através de sua borda franjada. A formação dessa borda depende

29 29 da presença da c-src, uma proteína sinalizadora de membrana. O meio acidificado pela ação do próton H+ desmineraliza o osso (hidroxiapatita) e expõe a matriz orgânica; ocorre, então, a degradação desta matriz exposta pela ação de enzimas como catepsina B e fosfatase ácida. A anidrase carbônica II também participa na regulação da atividade osteoclástica. Após a reabsorção induzida pelos osteoclastos, componentes da matriz, comr7*)h,*)-i, colágeno, osteocalcina, outras proteínas e componentes minerais são liberados no micro-ambiente. Os fatores de crescimento liberados pela reabsorção contribuem para o recrutamento de novos osteoblastos para a superfície óssea. Nessa fase, chamada reversa, os osteoclastos desaparecem (apoptose), e com a degradação da matriz orgânica, os fatores de crescimento que estavam seqüestrados no micro-ambiente são liberados inibindo os osteoclastos e estimulando os osteoblastos a iniciarem um novo processo de síntese de colágeno e mineralização do tecido osteóide (TEN CATE, 2001; RALSTON, 2002). Após esse processo, os osteoblastos tornam-se achatados, formando uma camada de células de revestimento em repouso. Alguns osteoblastos diferenciam-se em osteócitos e ficam submersos na matriz óssea. No final do ciclo de remodelação, sob circunstâncias ideais, a quantidade de osso formado deverá ser igual à quantidade de osso reabsorvido (TEN CATE, 2001; RALSTON, 2002) (Fig. 2).

30 30 Osteoclasto - recrutamento - Diferenciação - Ativação Osteoblastos em repouso Mineralização Fase de repouso Fase de Reabsorção Fase de formação Osteoclastos - apoptose Fase reversa Síntese de matriz Osteoblasto - Recrutamento - Diferenciação - Ativação FIGURA 2 Ciclo da remodelação óssea. FONTE: adaptação de RALSTON, BIOLOGIA DO MOVIMENTO ORTODÔNTICO Movimento Ortodôntico Desde 1911, no seu clássico trabalho, Oppenheim demonstrou que a reação das estruturas de suporte ao stress não ocorria devido à elasticidade, compressão ou extensão do osso, mas sim, devido a uma série de mudanças no tecido ósseo, caracterizadas por áreas de deposição e reabsorção, mediadas pela tensão e