Controlo da Qualidade em Vinhos

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1 Controlo da Qualidade em Vinhos Alergéneos em Vinhos CVRVV Porto, 23/02/2011 R-Biopharm AG An der neuen Bergstraße Darmstadt, Germany

2 A R-Biopharm Empresa alemã produtora de testes de análise e diagnóstico Presente em Portugal na área alimentar através da Ambifood Sede em Darmstadt Gama de produtos Constituintes Resíduos GMO BSE / Animal ID Microbiologia / Higiene Alergéneos

3 A Ambifood Fundada em 2001 Áreas Alimentar, Ambiental, Industrial Fornecedora de métodos de análise e diagnóstico Equipamentos Missão Contribuir para a competitividade do tecido empresarial nacional

4 ALERGENEOS 1. Introdução O que é alimento para alguns, pode ser veneno para outros Titus Lucretius Carus (99-55 B.C.) Poeta Romano e autor de De Rerum Natura (On the Nature of the Universe)

5 Reacções Adversas aos Alimentos Reacção Adversa Reacção Não-Tóxica Reacção Tóxica Reacção Psicossomática Imunológica Alergia Alimentar Não-Imunológica Intolerancia Alimentar IgE induced not IgE induced enzymopathy pharmacological not defined Bruijnzeel-Koomen C. et al., Allergy 59: 623, 1995

6 Alergia Alimentar alergeneos, presentes nos alimentos causam reacções adversas no sistema imunitário das pessoas alérgicas Quase todos os alergeneos são proteinas As reacções alérgicas são causadas pela presença de anticorpos IgE Acredita-se que cerca de 25% das pessoas possam apresentar uma reacção alérgica a algum alimento Apenas 2-3% duma reacção alérgica real consegue ser provada

7 Maiores alergéneos Crianças Leite 70% Ovos 40% Amendoim 5% Trigo 4% Adultos Amendoim 23% Peixe, marisco 10% Leite 7% Ovo 4% Portugal Leite, Peixe, Ovos, Cereais 5 a 10% população Source: Weißbuch Allergien in Deutschland (Allergies in Germany) Source: Sociedade Portuguesa de Alergrologia e Imunologia Clinica >90% alergias causadas pelo Big 8 Amendoim Leite Ovos Peixe Crustáceos Nozes Soja Cereais

8 2. Legislação Rotulagem União Europeia 13/2000/EC : rotulagem alimentar 89/2003/EC : rotulagem dos alergeneos 2005/26/EC: alergeneos isentos de rotulagem 2007/68/EC: alteração da lista do 2005/26/EC 1266/2010: rotulagem de vinhos, Junho 2012 Austrália Food Standard SO2, Caseínas e sais K, Ovo, Leite e Frutos Secos Canadá Healt Canada a partir de 4/08/12 Cola de peixe, Ovo, Leite, Caseína

9 Australia (The Code 2000) Canada (Health Canada 2008) China (Food & Environ-mental Hygiene Dept. 2005) EU (EU directives ) Japan (Ministry of Health 2001) ** South Africa (Foodstuffs, Cosmetics & Disinfectants Act 1972) United States (FALCPA 2004) Gluten (Cereals) X X X X X X X Crustacean X X X X X X Molluscs X X Egg X X X X X X X Fish X X X X X X Shellfish X Peanut X X X X X X X Soybean X X X X X X Milk X X X X X X X Tree nuts * X X X X X X Sulfites X X X Sesame X X X Celery X Mustard X X Lupine X Buckwheat X * Almond, brazil nut, cashew, hazelnut, macadamia, queensland nut, pecan, pine nuts, pistachios, walnut ** Abalone, squid, salmon roe, shrimp/prawn, oranges, crab, kiwifruit, beef, tree nuts, salmon, mackerel, soybeans, chicken (poultry), pork, mushrooms, peaches, yams, apples and gelatin

10 3. Testes de análise em Vinhos Enzimáticos Sulfitos, Cobre, Ferro,Tartárico Açucares. Álcoois Ácidos Contaminantes OTA Alergéneos Ovo Leite Lisosima Gluten Histamina Outros Brettanomyces

11 3. Testes de determinação de Alergéneos qualitative PCR quantitative, suited for automation ELISA semiquantitative, qualitative Lat. Flow Tests ELISA Dip Stick RIDASCREEN / RIDASCREEN FAST RIDA QUICK / BIOAVID PCR GEN-IAL / SureFood Enzimatico Boehringer/Roche ou Enzytec

12 FUNDAMENTOS do MÉTODO

13 Anticorpos proteinas, que pertencem ao grupo das globulinas (imunoglobulinas, Ig) Existem em todos os animais Presentes no sangue, outros fluidos (saliva, etc.) e em muitos tecidos. Altamente especificas na detecção de estruturas definidas nos antigeneos com terminações Fab. Quase todas as moléculas podem actuar como antigeneo Há 2 tipo de anticorpos usados: - monoclonal e policlonal.

14 Anticorpos Como detectar as suas reacções? Os anticorpos são muito pequenos para serem vistos Nem as suas reacções com os antigeneos podem ser vistas Desenvolveram-se métodos para visualizar a reacção precipitação Marcação radioactiva Marcação fluorescente Marcação por enzimas

15 Marcação por enzimas Anticorpos podem acoplar-se a enzimas (ex. Glucoseoxidase, Fosfatase Alcalina, Peroxidase, etc.) estas enzimas podem catalizar a reacção originando um produto colorido método: Imunohistologia EIA Ensaio Imuno Enzimático

16 EIA Sandwich ELISA Competitive ELISA EIA ENSAIO IMUNO ENZIMÁTICO Sistema onde a reacção anticorpo/antigeneo é visualizada pela mudança de cor, promovida por uam enzima acoplada ao anticorpo ou ao antigeneo. a cor pode ser desenvolvida como uma cor soluvel numa fase liquida (microplaca EIA) ou um precipitado insoluvel numa superficie (fase solida EIA) ou num tecido (imunohistoquimica) A tecnologia EIA é usada para detecção/determinação de antigeneos e anticorpos A detecção pode ser: sandwich EIA ou competitivo EIA

17 Sandwich ELISA Principio do método Sandwich ELISA Sandwich ELISA

18 Sandwich ELISA Sandwich ELISA Após a adição do padrão ou da amostra ocorre a ligação anticorpo-analito. Um segundo anticorpo marcado, especifico para a determinação, é adicionado e também se liga ao analito, formando uma ligação tipo sandwich. Depois adicionase o substrato que reage com a enzima originando uma coloração, que é directamente proporcional à concentração do analito.

19 A gama RIDASCREEN FAST

20 Procedimento ELISA RIDASCREEN FAST procedimento (I) 1 A1 ml vinho + 19 ml sol. extração quente 2 Mix vortex 3 Filtrar ou centrifugar

21 Procedimento ELISA RIDASCREEN FAST procedimento (II) 4 Colocar os poços no suporte 1/amostra 5 Adicionar 100 µl de cada padrão ou amostra por poço

22 Procedimento ELISA RIDASCREEN FAST Assays procedimento (III) 6 Incubar10 min e limpar os poços 7 Lavar e bater vigorosamente contra papel absorvente 8 Adiconar 250 µl sol lavagem (3x)

23 Procedimento ELISA RIDASCREEN FAST procedimento (IV) 9 Diluir o conjugado 10 Adicionar 100 µl conjugado 11 Incubar 10 min ambiente

24 Procedimento ELISA RIDASCREEN FAST procedimento (V) 12 Lavar (3 x), Adicionar 100 µl substrato-/cromogéneo 13 Incubar 10 min no escuro ambiente 14 Adicionar 100 µl stop solution

25 Procedimento ELISA RIDASCREEN FAST procedimento (VI) 15 Medir a 450 nm. Usar RIDA SOFT Win para cálculo resultados OD

26 RIDA WIN

27 Testes Kits LOD (ppm) LOQ (ppm) Critérios OIV* (ppm) LOD LOQ RIDASCREEN FAST Casein 0,24 0,5 <0,5 1 RIDASCREEN FAST Lysosime 0,02 0,05 <0,5 1 RIDASCREEN FAST Ei/Egg Protein 0,27 0,5 <0,5 1 RIDASCREEN Gliadin AOAC OM 1,5 2,5 Outros: Recuperações 80 / 105% Sem interferentes *Resolução OIV/OENO 427/210

28 VALIDAÇÕES Aplicação RIDASCREEN FAST Ei/Egg (I) 2 amostras vinho tinto (Pinot noir and St. Laurent) clarificadas com ovo em pó. Medição do teor em ovo ao longo de diferentes etapas: Am. J. Enol. Vitic. 62:3 (2011)

29 VALIDAÇÕES Aplicação RIDASCREEN FAST Ei/Egg (II) Amostras de vinhos alemães e italianos recolhidos no mercado. Uma amostra de vinho italiano continha a concentração de 1.7 mg/kg ovo. N=10 Standard OD (450 nm) Egg concn (mg/l) Calibrator Calibrator Calibrator Am. J. Enol. Vitic. 62:3 (2011)

30 VALIDAÇÕES Validação RIDASCREEN FAST Ei/Egg Differentes materiais (extrato clara de ovo, ovo em pó (NIST) clara ovo em pó adicionadas a vinho tinto Recuperações entre %

31 VALIDAÇÕES Validação RIDASCREEN FAST Casein Diferentes materiais como leite em pó e UHT foram adicionados a vinho tinto. Recuperações entre %

32 VALIDAÇÕES Validação RIDASCREEN FAST Casein Caseina dissolvida em PBS-buffer contendo urea e adicionada a vinho tinto. Recuperações entre % A caseina adicionada diretamente ao vinho precipita, logo as recuperações serão mais baixas.

33 VALIDAÇÕES Validação RIDASCREEN FAST Lysozym (I) Adicionada a vinho branco e tinto lisozima liofilizada Sigma (L6876). Recuperações entre %

34 Validação RIDASCREEN FAST Lysozym (II) Usadas duas preparações comerciais em vinho tinto e branco 1.) LALLZYME Lyso-easy (Lallemand) solução pronta a usar 22% solução, sem aditivos, TA / 6 meses especifica para gram-positivo (LAB) usada em várias etapas (no mosto para reduzir as LAB e no final da fermentação alcoólica fermentação malolática). 2.) BactiCare (Erbslöh) produzida a partir da clara do ovo

35 Validação RIDASCREEN FAST Lysozym (II) Resultados: Recuperações entre %

36 EIL FAPAS EIL 2791, Jun/Jul 2011, Ovo em bolo

37 EIL FAPAS EIL 2789, Abr 2011, Caseína em baby-food

38 EIL FAPAS EIL 2799, Nov 2011, Glúten, Caseína e Ovo em bolo

39 Conclusão Estamos convictos que os testes da gama RIDASCREEN para a determinação de caseina ovo lisosima São métodos robustos e confiáveis para determinar concentrações residuais de agentes de tratamento do vinho

40 Saúde!... e obrigado pela vossa atenção.

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