DETERMINAÇÃO DE UM TEMPO DE EQUILÍBRIO E GRADIENTE DE TEMPERATURA NO BENEFICIAMENTO DO SÊMEN SUÍNO

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1 Universidade Estadual do Ceará Pró-Reitoria de Pós-Graduação e Pesquisa Faculdade de Veterinária Programa de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias FAVIANO RICELLI DA COSTA E MOREIRA DETERMINAÇÃO DE UM TEMPO DE EQUILÍBRIO E GRADIENTE DE TEMPERATURA NO BENEFICIAMENTO DO SÊMEN SUÍNO Fortaleza, Ceará Dezembro de 2002

2 Universidade Estadual do Ceará Pró-Reitoria de Pós-Graduação e Pesquisa Faculdade de Veterinária Programa de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias FAVIANO RICELLI DA COSTA E MOREIRA DETERMINAÇÃO DE UM TEMPO DE EQUILÍBRIO E GRADIENTE DE TEMPERATURA NO BENEFICIAMENTO DO SÊMEN SUÍNO Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias da Universidade Estadual do Ceará, como requisito parcial para a obtenção do grau de Mestre em Ciências Veterinárias. Área de concentração: Reprodução e Sanidade animal Orientador: Dr. Ricardo Toniolli Fortaleza, Ceará Dezembro de 2002

3 Universidade Estadual do Ceará Pró-Reitoria de Pós-Graduação e Pesquisa Faculdade de Veterinária Programa de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias DETERMINAÇÃO DE UM TEMPO DE EQUILÍBRIO E GRADIENTE DE TEMPERATURA NO BENEFICIAMENTO DO SÊMEN SUÍNO FAVIANO RICELLI DA COSTA E MOREIRA Aprovada em 06/ 12/ 2002 Banca Examinadora: Prof. Dr. Ricardo Toniolli Orientador Profa. Dra. Lúcia Daniel Machado da Silva Co-orientadora/Examinadora Profa. Dra. Edna Kotzias-Bandeira Examinadora Fortaleza, Ceará Dezembro de 2002

4 DEDICATÓRIA Aos meu pais, Fábio e Vilani, por me darem o apoio e serem exemplos de vida para que pudesse alcançar mais esta vitória. À minha namorada Paula Vivianne pelas palavras de incentivo e companheirismo.

5 AGRADECIMENTOS A Deus, por ter me concedido a existência, razão e a serenidade suficiente para cumprir mais esta etapa na minha vida profissional. Aos meus pais, Fábio e Vilani Moreira, por serem os meus maiores incentivadores, sempre me orientado e indicando o melhor caminho a seguir. Ao meu irmão, Fábio Jr., e demais familiares pelo apoio incondicional. À Paula Vivianne, pela paciência, amizade e companheirismo em todos os momentos. Ao meu orientador e hoje amigo Ricardo Toniolli pela confiança e incentivos recebidos. Aos meus amigos, hoje Mestres, Ana Beatriz Graça Duarte e Jorge Luiz Ferreira pelos conselhos e apoio. À toda equipe do Laboratório de Reprodução Suína e Tecnologia do Sêmen: em especial à Roberta Nogueira Chaves pelas horas e dias ajudando-me no trabalho e Michelle Costa e Silva, sempre alegrando o ambiente. Sem esquecer de Rodrigo Morais Fabrício Pessoa, Elton Vasconcelos, Paola Capibaribe, Cristina Vidal, Fabrícia Vasconcelos, Fernanda Ribeiro, Mayrá Lobato, Daniel Barros, Camila Oliveira, Gabriela Quieroga, Idsadora Machado e Dennis Diderot sempre postos ajudar. Aos meus amigos Aníbal Ballarotti e José Luiz Castro Aguiar Filho pela convivência harmoniosa, onde sempre que precisei pude contar com eles. Ao departamento de Medicina Veterinária da Escola Superior de Agricultura de Mossoró pelas inúmeras liberações para que pudesse concluir este mestrado. Aos meus colegas do mestrado, em especial a Sâmia Nogueira, Ana Paula Moreira, Jociery Vergara e Kenio Patrício sem esquecer de Isaac Neto, Rosa Patrícia Salles, Ana Lourdes Vasconcelos, Regiane Rodrigues, Annira Aquino e Annice Aquino sempre solícitos. Aos amigos e colegas que consegui fazer em Fortaleza, por me ensinarem o valor do companheirismo e da gratidão. Aos funcionários do setor de suinocultura da UECE (Sra. Rocilda, Sr. Tabosa, Sr. Raimundo, Alíssio e Dinho) pela disposição sempre em ajudar.

6 Por fim, aos animais, razão maior da nossa profissão, sempre nos ensinando o verdadeiro valor e sentido da vida. Muito obrigado.

7 RESUMO O avanço tecnológico vivenciado pela suinocultura reflete-se no desenvolvimento de técnicas de melhoramento das condições de criação dos animais, através da otimização de variáveis produtivas e reprodutivas. Neste sentido, o presente trabalho buscou dentro da biotécnica da inseminação artificial desenvolver uma tecnologia de conservação do sêmen suíno, refrigerado a 17 ºC, a fim de manter a qualidade seminal do espermatozóide. Para tanto, foram desenvolvidos três diferentes protocolos experimentais, com o intuito de haver uma continuidade, buscou-se trabalhar com a incubação do sêmen após a diluição (Artigos 1 e 2) e antes da diluição (Artigo 3). Os parâmetros qualitativos de análise foram o vigor (0-5), a motilidade (0-100%) e as alterações acrossomais (0-100%) dos espermatozóides. Os dados foram analisados através dos testes Mann-Whitney, para o vigor e a motilidade; e o teste t de student, para as alterações morfológicas, todos ao nível de significância de 5%. Nos trabalhos com incubação pós-diluição, evidenciou-se que a incubação do sêmen diluído não aumentou o tempo de viabilidade dos espermatozóides. Porém, se o sêmen for utilizado no dia de coleta, a incubação preserva um maior número de células com índices de vigor e motilidade. Outra observação importante foi a determinação do momento da diluição como o ponto crítico durante o processamento do sêmen suíno. No trabalho com o sêmen in natura, evidenciaram-se resultados estatisticamente significativos da influência positiva que a incubação dos espermatozóides no seu próprio plasma seminal traz sobre a qualidade do ejaculado. Neste experimento, encontrou-se como melhor resultado a incubação do sêmen puro no seu próprio plasma seminal a 25 ºC por 1 hora. Os resultados obtidos nestes experimentos abrem como perspectivas a necessidade de se delimitar com exatidão as modificações pelas quais os espermatozóides passam durante o processo de incubação, principalmente com o sêmen in natura, a fim de que se possa aumentar o tempo de conservação das doses inseminantes e difundir a biotécnica de inseminação artificial no nordeste brasileiro. Palavras-chave: Sêmen, in natura, suíno, incubação, refrigeração.

8 ABSTRACT The growing advanced technology within pig raising reflects on the developing techniques of improving the animal breeding conditions through the various improving productions and reproductions. Therefore, this work searched in the biotechnique of artificial insemination the development of a technology to preserve the swine semen cooled at 17 ºC to maintain the seminal quality of the spermatozoa. Therefore, three different registered experiments were made with the aim to have a continuity wich made the work with the incubation of the semen after a dilution (Articles 1 and 2) and before the dilution (Article 3). The qualitative parameters of analysis were the vigour (0-5), the motility (0-100%) and the acrossome alterations (0-100%) of spermatozoa. The results were analyzed through Mann-Whitney test (5%), for the vigor and the motility and the student test t about the morphology alterations, all important level of 5%. When worked with incubation after the dilution which showed that incubation of the diluted semen did not increase the time of spermatozoa viability. However, if the semen is used on the day of collection, the incubation preserve a larger numbers of cells with vigour and motility. Another important observation was the determination of the dilution moment, which was the critical point during the swine semen process. Working with the in natura semen, showed important statistic results and positive influence that the quality of this semen incubation in its own seminal plasma improved. This experiment, showed the best incubation of pure semen in its own seminal fluid, at 25 ºC in one hour. The obtained results from these experiments open perspectives and necessity, to label with precision, the modifications which the spermatozoa pass during the incubation process, specialy, with the in natura semen, to increase the preservation time of the inseminated doses, and spread the biotechnical knowledge of artificial insemination to the northeastern brazilian. Keywords: Semen, in natura,swine, incubation, cooling.

9 SUMÁRIO Introdução 01 Revisão de literatura 03 1) Importância da inseminação artificial na cadeia produtiva suinícola 03 2) Estágio atual da inseminação artificial suína 03 3) Alterações da membrana plasmática espermática durante o resfriamento 05 4) A influência do resfriamento gradual sobre a qualidade espermática suína 08 5) A importância do plasma seminal no processo de incubação 11 Justificativa 13 Objetivos 14 Objetivo geral 14 Objetivos específicos 14 Experimentos realizados Artigo 1 15 Artigo 2 23 Artigo 3 44 Conclusões 58 Perspectivas 59 Referências bibliográficas 60 Anexos 66

10 INTRODUÇÃO A suinocultura brasileira apresenta potencial para um crescimento bastante significativo, quando comparado a outros países, os quais não possuem o tamanho territorial, o clima tropical e a aptidão natural ao desenvolvimento da agropecuária. Isto se evidencia pelo fato da carne suína ser a mais consumida no mundo (DESCHAMPS et al., 2000). A suinocultura moderna dispõe de várias maneiras para otimizar a criação de animais baseados em fatores e padrões produtivos e reprodutivos. Atualmente, as principais tecnologias de produção são baseadas na moderna genética, nutrição separada por sexo e por fase de crescimento, desmame precoce, controle informatizado da produção e a inseminação artificial, onde esta última já é uma biotécnica reprodutiva bem estabelecida e aplicada nas criações (SOBESTIANISKY et al., 1998). Tal biotécnica está atualmente difundida em muitos países como uma ferramenta de aplicação comercial, amplamente utilizada na suinocultura (BORTOLOZZO & WENTZ, 2002). Pequenos, médios e grandes produtores recorrem a esta prática como técnica usual de manejo reprodutivo, buscando elevar a eficiência do rebanho e otimizar o retorno econômico da atividade pecuária, através da introdução de material genético de alto valor, além de diminuir o risco de transmissão de doenças, reduzir os espaços e custos pela diminuição do número de reprodutores (SOLTI & WEKERLE, 1995 e SCHEID, 1997), aumentando a eficiência reprodutiva e diminuindo os custos por cobertura/fêmea (DESCHAMPS et al., 2000). Atualmente, 24,1 milhões de matrizes são inseminadas no mundo, o que representa 48 % das fêmeas alojadas (WEITZE, 2000). A viabilidade do sêmen suíno é inferior àquela encontrada em outras espécies animais (BWANGA et al., 1992). Isto se deve à sua sensibilidade, tanto ao envelhecimento quanto ao choque térmico, devido à fragilidade do seu acrossomo (PURSEL et al., 1972 e MIES FILHO, 1987). Vários trabalhos foram desenvolvidos no sentido da obtenção de um diluidor e um método que viabilize e preserve o sêmen por um período superior a três dias (WEITZE, 1990 a e b), mantendo ainda as suas condições qualitativas (vigor, motilidade e morfologia) necessárias para a inseminação, bem como, taxas aceitáveis de fertilidade.

11 Dentre estas pesquisas para se aumentar o tempo de conservação da dose de sêmen, está a incubação e a taxa de refrigeração do ejaculado, onde, diminuir-se-ia a sensibilidade do espermatozóide ao choque térmico (frio - KOTZIAS-BANDEIRA, 1999), através de um abaixamento lento da temperatura entre os patamares de 35 e 17 C, fornecendo ao espermatozóide uma maior resistência de quando diluídos e refrigerados de maneira direta (WATSON & PLUMMER, 1990). A utilização deste abaixamento lento já é realizada em protocolos de congelação do sêmen suína (PAQUIGNON et al., 1987), no entanto, com relação ao sêmen refrigerado à temperatura de 17 C, a utilização de um abaixamento lento ainda não foi definida entre os pesquisadores. A partir de agora será realizada uma breve revisão de literatura, onde serão levantados pontos de interesse para um embasamento das discussões sobre o trabalho.

12 REVISÃO DE LITERATURA 1) IMPORTÂNCIA DA INSEMINAÇÃO ARTIFICIAL NA CADEIA PRODUTIVA SUINÍCOLA Com o crescimento econômico, a necessidade de geração de maiores riquezas fez com que o mundo inteiro se desenvolvesse. Na tentativa de reduzir os custos envolvidos na cadeia produtiva, aumentar o padrão genético e a qualidade do produto, foi introduzida a inseminação artificial (IA) na suinocultura (CASTAGNA et al., 2001). No Brasil, a IA em escala comercial foi introduzida somente a partir de 1975, principalmente na região sul do país, devido a uma forte concentração de criadores com alto nível de tecnificação e taxas elevadas de produtividade (SCHEID, 1992). No país, o uso desta biotécnica em grande escala é relativamente recente, sendo que aproximadamente 50% das fêmeas alojadas em granjas tecnificadas são inseminadas artificialmente (WENTZ et al., 2000). O crescente aumento do uso da IA, particularmente desde 1990, deve-se ao fato de que o maior domínio da técnica propicia uma maior demanda por suínos de alta qualidade genética, fazendo com que estes animais possam ter uma maior produtividade, principalmente, no beneficiamento de suas carcaças com índices cada vez menores de gordura (Suíno Light) (JOHNSON et al., 2000). A utilização da IA promove uma série de vantagens quando comparada com a monta natural. Dentre estas vantagens, os ganhos advindos da melhoria genética são os que possuem a maior importância. Como exemplo desta melhoria, é possível citar o maior rendimento de carne e, conseqüente aumento na bonificação da carcaça, melhoria na eficiência alimentar, maior ganho de peso e otimização de instalações (CASTAGNA et al., 2001). 2) ESTÁGIO ATUAL DA INSEMINAÇÃO ARTIFICIAL SUÍNA A qualidade espermática é essencial para o sucesso da IA, sendo também influenciada por vários parâmetros genéticos e ambientais, tais como: idade, individualidade, luminosidade (sêmen), temperatura (coleta e conservação), manejo,

13 nutrição, frequência de coleta e diluidores utilizados. O cuidado com estes parâmetros está correlacionado com a presença de uma ou mais anormalidades no ejaculado (BONET et al., 1993). Atualmente, o diluidor mais rotineiramente utilizado na preservação do sêmen suíno, e que apresenta os melhores resultados de vigor, motilidade e morfologia, além de uma melhor relação custo-benefício é o diluidor de Beltsville (BTS - PAQUIGNON et al., 1987; BLICHFELD et al., 1988; JOHNSON et al., 2000). Ele fornece um ambiente nutritivo e adequado (acidez e osmolaridade), podendo o sêmen com ele diluído ser utilizado por até 3 (três) dias após a coleta, quando conservado em temperaturas entre ºC (ALTHOUSE et al., 1998). Apesar das inúmeras vantagens apresentadas sobre a IA, dentre as espécies de interesse comercial, provavelmente, os suínos são os que apresentam as maiores dificuldades quanto ao uso desta biotécnica (CASTAGNA et al., 2001). As principais limitações enfrentadas para o uso da IA (quando comparadas às demais espécies domésticas) podem ser resumidas em: a) O sêmen suíno é sensível a baixas temperaturas, fazendo com que o armazenamento da dose seja comprometido; b) Devido à temperatura de armazenamento e aos componentes habituais dos diluentes de sêmen, a dose inseminante pode se tornar fonte de crescimento bacteriano; c) Baixo rendimento de doses inseminantes e fêmeas servidas por ejaculado; d) A meia vida espermática dentro do trato genital feminino é inferior a um dia; e) A variabilidade da duração do estro podendo ser de 12 a mais de 96 horas, inviabiliza uma única inseminação; f) Existe uma grande variação no momento da ovulação, sendo que esta ocorre normalmente dentro do estro, impossibilitando, no atual estágio de conhecimento, a utilização de somente uma inseminação por cio.

14 3) ALTERAÇÕES DA MEMBRANA PLASMÁTICA ESPERMÁTICA DURANTE O RESFRIAMENTO Como com outras espécies animais, nas quais a conservação do sêmen é rotineiramente realizada, a refrigeração do sêmen contribui na preservação da sua longevidade pela diminuição da atividade metabólica da célula espermática, a qual leva a uma significativa redução do consumo de energia (ALTHOUSE et al., 1998). O espermatozóide suíno é particularmente sensível à refrigeração, com menor tolerância à queda de temperatura do que é observado nos espermatozóides de outras espécies domésticas, como o garanhão ou o touro. Esta sensibilidade ao choque térmico é caracterizada por uma irreversível perda da permeabilidade seletiva e integridade da membrana plasmática, levando a uma perturbação do metabolismo espermático e conseqüente morte da célula (ALTHOUSE et al., 1998). No choque térmico, o principal dano se dá na membrana plasmática, a qual sofre alterações, resultando no extravasamento do conteúdo celular de forma irreversível. Esta é a explicação para o fato do espermatozóide bovino ser menos sensível ao choque térmico que o suíno, ou seja, a organização e composição da sua membrana celular externa torna a sua membrana plasmática mais consistente (JOHNSON et al., 2000). Outras organelas como as mitocôndrias e o acrossomo são afetados também pelo choque térmico (WATSON & PLUMMER, 1990). Vale salientar que ao se reportar aos efeitos do choque térmico sobre a organização da membrana, entenda-se resfriamento e reaquecimento, os quais, comprometem as associações lipídio-lipídio e lipídio-proteína, interferindo na função e integridade da mesma (PARKS & GRAHAM, 1992). A comunicação entre a célula e o meio externo é mediada pela membrana plasmática. O modelo proposto do mosaico fluido demonstra que a comunicação poderia ser afetada pela habilidade das moléculas dentro da membrana de interagir com cada outra e com o citoplasma e/ou meio extracelular (CAVIN & BUHR, 1989). A membrana plasmática é essencial para a célula, ela a envolve, define seus limites, mantendo as diferenças entre o citosol e o meio extracelular. As propriedades biológicas e biofísicas das membranas, incluindo a dos espermatozóides, são determinadas pela sua

15 composição molecular. A membrana plasmática é de especial interesse nas ciências clínica e animal por causa da fusão de suas membranas durante o resfriamento e o congelamento (PARKS & GRAHAM, 1992). Admite-se que as membranas dos espermatozóides ajustamse ao modelo do mosaico fluido, com proteínas integrais dispersas através de uma bicamada de lipídios polares (SINGER & NICHOLSON, 1972; PARKS & GRAHAM, 1992). Por serem estruturas dinâmicas e fluidas, a maior parte das moléculas da membrana plasmática são capazes de mover-se no plano da mesma, com as moléculas lipídicas dispostas como uma dupla camada contínua. Essa bicamada lipídica fornece a estrutura básica da membrana e atua como barreira impermeável à passagem da maioria das moléculas hidrossolúveis. As moléculas de proteínas dissolvidas na bicamada lipídica intermediam a maioria das outras funções da membrana. As membranas celulares são assimétricas, ou seja, a composição de lipídios e proteínas das faces externa e interna são diferentes umas das outras (ALBERTS et al., 1997 apud NASCIMENTO et al., 1998). A composição lipídica da membrana, quando sofre os efeitos do choque térmico, é afetada através da alteração de sua fluidez. Com a temperatura baixa, há a restrição do movimento lateral dos fosfolipídeos de membrana resultando numa transição da fase fluida para a de gel (BUHR et al., 1994; WATSON, 1996 apud JOHNSON et al., 2000). Devido às diferenças de temperatura de transição para os diferentes lipídeos de membrana, separações de fase podem ocorrer, onde as proteínas tornar-se-iam agrupadas irreversivelmente (DE LEEUW et al., 1990). A partir do relato das pesquisas, têm-se como premissa que a resposta particular de cada membrana celular à baixa temperatura está intrinsecamente relacionada com a composição da membrana de cada célula (JOHNSON et al., 2000), já que existe mudança lipídica na membrana espermática durante o trânsito epididimário e em eventos pré-fertilização. Por esta razão é que estas mudanças lipídicas estão associadas com a sensibilidade do espermatozóide ao choque térmico (BUHR et al., 1994), nas diversas espécies animais (JOHNSON et al., 2000). Outro fator que influencia o comportamento termotrópico da membrana é a percentagem de colesterol. A taxa de colesterol/fosfolipídios no espermatozóide suíno é muito baixa, sendo ainda o colesterol distribuído de forma assimétrica, estando mais presente na camada externa que na interna da membrana. Esta combinação poderia render, especialmente na camada interna, uma maior vulnerabilidade ao choque térmico. A

16 reorganização da célula pós-choque interfere no aumento da permeabilidade (extravasamento de cátions e enzimas), redução na atividade enzimática e difusão controlada dos processos da membrana e mudanças no movimento lateral nos canais iônicos (DE LEEUW et al., 1990). As moléculas de colesterol aumentam as propriedades de barreira da membrana plasmática, diminuindo a mobilidade de fosfolipídios, conseqüentemente a bicamada lipídica fica menos deformável. Desse modo, o colesterol inibe possíveis transições de fase (DARIN-BENNET & WHITE, 1978). Um modelo de ação do colesterol é citado por CROSS (1998), onde, com a sua ausência, ocorre a exposição de um receptor para manose na superfície espermática. Foi proposto que o receptor funciona em uma interação com a zona pelúcida do óvulo. Isto, devido ao fato de se saber que: 1) manose e proteínas manosiladas interferem com a união do espermatozóide com a zona pelúcida, induzindo à reação acrossomal, e 2) a zona pelúcida contém manose. Ainda que os ácidos graxos e os fosfolipídios da membrana determinem o comportamento da mesma, as diferenças mais marcantes estão no tipo de fosfolipídios encontrados entre os espermatozóides do varrão e o touro, onde, no suíno encontra-se uma baixa percentagem de fosfatidilcolina e altas percentagens de fosfatidiletanolamina e esfingomielina (JOHNSON et al., 2000). Em conseqüência do choque térmico, lesões irreversíveis são observadas especialmente no acrossomo com desprendimento e perda de conteúdo (PURSEL et al., 1972; NASCIMENTO, 2001). Quanto maior o desconforto, maior a percentagem de células lesadas, especialmente quando se usa diluidores salinos como o BTS e o KIEW. O choque térmico causa perda de proteínas, redução de motilidade e do metabolismo e aumento de permeabilidade da membrana plasmática, acarretando desequilíbrio iônico, com maior concentração dos íons Ca ++, Na ++ e Zn ++ intracelularmente e uma perda de K ++ e Mg ++ (WATSON, 1996 apud NASCIMENTO, 2001; HUO et al., 2002). A membrana plasmática da cabeça do espermatozóide suíno recém ejaculado mostra mudanças únicas na sua fluidez, que são dependentes do Ca ++ e da temperatura, onde, processos como a criopreservação alteram esta característica (BUHR et al., 1994).

17 Segundo DE LEEUW et al. (1990), as principais alterações na célula espermática devido ao resfriamento são: 1) Alterações morfológicas a) Rompimento da membrana plasmática b) Degeneração do acrossomo c) Danos mitocondriais 2) Alterações bioquímicas a) Perda da permeabilidade seletiva da membrana a.1) Retenção intracelular de íons sódio e cálcio a.2) Perdas de íons magnésio e potássio a.3) Liberação de enzimas a.4) Liberação de fosfolipídios b) Decréscimo da atividade respiratória e da glicólise b.1) Redução dos níveis de ATP b.2) Perda da motilidade c) Degeneração do DNA Por outro lado, a viabilidade das células após o resfriamento e o reaquecimento é determinada pela: a) Taxa de resfriamento; b) Duração da incubação durante a queda de temperatura; c) A temperatura final atingida; d) Aditivos; e) Maturação espermática. 4) A INFLUÊNCIA DO RESFRIAMENTO GRADUAL SOBRE A QUALIDADE ESPERMÁTICA SUÍNA O sêmen suíno é caracterizado pela baixa viabilidade quando armazenado por um período superior a cinco dias (JOHNSON et al., 2000; YOSHIDA, 2000). Neste sentido, várias são as tentativas de se aumentar este tempo de conservação, entre as quais, pode-se citar: a composição dos diluidores (FLOWERS, 1992; TONIOLLI, et al., 1996; KUSTER

18 & ALTHOUSE, 1999; MOREIRA et al., 2000), a temperatura de conservação (POLGE, 1956; PURSEL et al.,1973a), a taxa de diluição (PEREZ-MARCOS et al., 1991) e diferentes curvas de abaixamento de temperatura empregadas entre a coleta e a conservação do sêmen (BUHR et al., 1994; MOREIRA et al., 2001a). As quedas rápidas e diretas (sem incubação em temperaturas intermediárias) da temperatura (35 à 17 ºC) causam perdas à qualidade dos espermatozóides, enquanto que o abaixamento lento (com incubação em temperaturas intermediárias) fornece resistência à célula espermática (WATSON & PLUMMER, 1990). A determinação da taxa de resfriamento para os espermatozóides de diversas espécies é assunto importante para a sobrevivência espermática no sêmen diluído e resfriado. O sêmen suíno diluído e mantido por várias horas a 37 ºC ou à temperatura ambiente pode mostrar problemas que comprometem a sua fertilidade (NASCIMENTO et al., 1998). Segundo SILVA FILHO (1994) apud NASCIMENTO et al. (1998), o choque térmico caracteriza-se pela presença de espermatozóides com movimentação atípica, perda prematura de motilidade e energia, maior permeabilidade de membranas e perda de moléculas e íons intracelulares. A diferença entre espécies quanto à susceptibilidade já é fator conhecido. Além disso, existem também diferenças entre indivíduos da mesma espécie, bem como entre ejaculados do mesmo animal (PURSEL et al., 1973a) O fato do espermatozóide suíno ser muito sensível ao choque térmico é bastante conhecido, isto ocorre quando o ejaculado fresco é rápida e diretamente resfriado até a temperatura de conservação (15 ºC), a qual resulta em perda da viabilidade de um número maior de espermatozóides (JOHNSON et al., 2000). Os danos celulares resultantes da rápida refrigeração são comuns, onde o sinal mais óbvio verificado no espermatozóide é uma irreversível perda da sua motilidade (WATSON & PLUMMER, 1990). No sêmen suíno, esta perda ou diminuição da motilidade é manifestada imediatamente após a ejaculação, onde as células tornam-se progressivamente menos sensíveis ao choque térmico por um período de poucas horas (PURSEL et al., 1972; WATSON, 2000). O sêmen suíno incubado à temperatura ambiente no seu próprio plasma seminal torna-se resistente ao choque térmico por até 16 horas pós-ejaculação (TAMULI &

19 WATSON, 1994 apud WATSON, 2000). POLGE (1956) relata que o espermatozóide da fração rica do sêmen tolera uma refrigeração lenta e é mais resistente ao choque térmico do que os espermatozóides no ejaculado total. O desenvolvimento da resistência durante a incubação é influenciado pelo ph, diluição e composição do diluidor (BWANGA, 1991). Segundo NASCIMENTO (2001), o dano ocasionado pelo choque térmico é mais perceptível nos espermatozóides recém ejaculados, os quais são mais sensíveis ao choque térrmico do que aqueles incubados a 30 ºC por um período de 4 a 7 horas. PURSEL et al. (1972), também estudando o efeito do abaixamento gradual da temperatura, observaram que os espermatozóides suínos incubados de 25 à 30 ºC por horas tornam-se muito mais resistentes a baixas temperaturas. Assim como a resistência ao choque térmico, observou-se que a percentagem de espermatozóides móveis e com integridade acrossômica foram maiores, nos ejaculados que sofreram um resfriamento gradual em relação ao rápido (WEBER, 1989 apud WATSON & PLUMMER, 1990). Neste mesmo raciocínio, WATSON & PLUMMER (1990) mostraram que a proporção de células mostrando alterações morfológicas (membrana plasmática, acrossomo) foi maior nos ejaculados que foram submetidos a um choque térmico mais intenso. Pelos dados dos presentes autores, a partir de 30 ºC (temperatura de diluição), o sêmen foi mantido a 24, 16, 8, 4 e 0 ºC, e nestas temperaturas a percentagem de membrana plasmática intacta foi de 86; 73,5; 11; 0 e 0%, respectivamente, mostrando que no choque térmico (rápido) há o decréscimo na qualidade seminal dos varrões. É possível minimizar os efeitos do choque térmico, incubando o sêmen na diluição de 1: 1 por 24 horas e a 15 ºC. Porém, deve-se levar em consideração que na incubação por longo período há o envelhecimento dos espermatozóides e o aumento da atividade metabólica que podem comprometer o poder fecundante do espermatozóide (NASCIMENTO, 2001). Portanto, o abaixamento gradual da temperatura até a faixa final de estabilização (15-17 ºC) é uma situação que pode minimizar os malefícios provocados pelo choque térmico. Segundo WEBER (1989) apud NASCIMENTO (2001), um rápido abaixamento da temperatura do sêmen diluído, de 35 para 15 ºC, leva a uma significativa perda da motilidade, enquanto que uma taxa de refrigeração lenta (volumes de 100ml) a passos de 10ºC confere uma resistência ao espermatozóide suíno contra o choque térmico. Ao mesmo

20 tempo, uma pré-incubação de pelo menos 24 h antes de um possível abaixamento da temperatura a níveis abaixo de 15 ºC fornece, também, resistência ao choque térmico. Segundo PETROUKINA et al. (1997), citado por JOHNSON et al. (2000), o estudo da interação da membrana-meio-temperatura durante a incubação e conservação do sêmen poderia aumentar os conhecimentos de como prevenir ou reduzir os efeitos da refrigeração. 5) A IMPORTÂNCIA DO PLASMA SEMINAL NO PROCESSO DE INCUBAÇÃO Segundo MAXWELL & JOHNSON (1999), conseguiu-se gestação em ratas pela monta natural, após a retirada da próstata ou das glândulas vesiculares, mas não através da retirada de ambas as glândulas. Conforme os mesmos autores, sabe-se que durante algum tempo, o plasma seminal possui uma função na promoção da fertilidade, à parte de sua função como diluente e veículo para o espermatozóide, exercendo um efeito estimulante na motilidade espermática no momento da ejaculação. Isto se deve à ativação do espermatozóide pela presença de substâncias específicas nas diferentes secreções das glândulas anexas. A composição do plasma seminal inclui componentes inorgânicos, aminoácidos, peptídeos, proteínas de alto e baixo peso molecular, variando com a espécie, intervalo entre coletas e saúde do animal (MAXWELL & JOHNSON, 1999). As pesquisas de CATT et al. (1997) apud MAXWELL & JOHNSON (1999) de que o BTS poderia manter a viabilidade do espermatozóide do varrão e do carneiro, com ou sem a adição do plasma seminal, sugere que simples componentes metabólicos ou iônicos e protéicos, podem se constituir nos mais importantes componentes do plasma seminal, para a manutenção da viabilidade celular. ASHWORTH et al. (1994) apud MAXWEEL & JOHNSON (1999) mostraram que o espermatozóide do ovino morre rapidamente após extensiva diluição na ausência do plasma seminal, mas que a motilidade é mantida quando o meio diluidor é suplementado com uma quantidade de 10% de plasma seminal homólogo. A afirmação de VISHWANATH & SHANNON (1997) e MAXWELL & JOHNSON (1999) de que a função do plasma seminal como um meio de suporte para o espermatozóide é pelo menos ambíguo se não contraditório, é devido aos vários trabalhos na literatura que discorrem sobre a importância do plasma in vivo e in vitro.

21 Em algumas espécies, a fertilidade tem sido melhorada após a diluição com plasma seminal (rato e coelho). Mudanças na composição do plasma seminal após a remoção das glândulas sexuais acessórias podem ter uma ação negativa sobre a fertilidade (rato, hamster, camundongo). Em contraste, alguns estudos demonstram uma redução na fertilidade após a exposição do espermatozóide ao plasma seminal (suíno, bovino, caprino, ovino, eqüino, coelho e humano). A variação da concentração de, provavelmente proteínas do plasma seminal, está associada com a melhoria (rato e coelho) ou não (suíno, bovino, caprino, ovino, eqüino, coelho e humano) da fertilidade espermática. O fato da maior parte do plasma seminal não acompanhar o espermatozóide durante o seu trânsito até o local de fecundação no trato reprodutivo feminino sugere que a remoção é necessária para a aquisição da capacidade fertilizante, e isto pode ser um importante fator no processo de capacitação (MAXWELL & JOHNSON, 1999). O plasma seminal tem sido associado com a susceptibilidade ao choque térmico, devido provavelmente, às ligações de proteínas básicas da membrana celular espermática, onde os fatores de proteção e sensibilidade são apontados como funções do plasma (BWANGA, 1991). In vivo, o plasma seminal influencia a fisiologia dos espermatozóides, aumentando a sua motilidade, sua estabilidade de membrana e sua capacidade para resistir à descondensação prematura da cromatina. In vitro, a remoção do plasma seminal por centrifugação, é praxe nos protocolos de criopreservação. Porém, com o sêmen na forma refrigerada, esta assertiva parece não encontrar respaldo entre os pesquisadores (PURSEL et al., 1972; TAMULI & WATSON, 1994 apud RODRIGUEZ-MARTINEZ & ERIKSSON, 2000). Em ovinos, segundo BARRIUS et al. (2000), os danos estruturais na membrana plasmática de espermatozóides causados pelo choque térmico parecem ser revertidos após serem incubados com proteínas presentes no plasma seminal, tais proteínas parecem restaurar as características funcionais da membrana plasmática dos espermatozóides após serem submetidos ao choque térmico.

22 JUSTIFICATIVA A redução de custos dentro de qualquer segmento econômico é uma meta constantemente perseguida. A suinocultura, inserida no agronegócio brasileiro, é vista como atividade altamente produtiva e tecnificada. A inseminação artificial, utilizada como ferramenta para diminuir os custos da atividade e melhorar o rendimento dos animais busca aliar as necessidades do setor produtivo com as pesquisas realizadas nos centros universitários e de pesquisa. O curto período de preservação da dose inseminante suína impede a disseminação da biotécnica para regiões distantes das principais centrais produtoras de sêmen. Isto ocorre, uma vez que, os protocolos atuais de preparo das doses utilizam como rotina o abaixamento rápido ou direto do ejaculado entre as temperaturas de 37 e 15 ºC. O tempo de estabilização gradual do sêmen, já utilizado quando se congela os espermatozóides, tende a conservar por um período mais prolongado o poder fecundante do ejaculado suíno utilizado na inseminação artificial, sendo este fato uma ferramenta suplementar para a difusão da biotécnica entre os criadores do nordeste brasileiro, promovendo um melhoramento genético do rebanho suíno. O melhor conhecimento das técnicas de beneficiamento do sêmen contribuirá para uma maior expansão tecnológica da suinocultura, podendo incrementar a produtividade numérica e ponderal do rebanho, propiciando ao sistema produtivo e particularmente aos suinocultores cearenses, uma melhor estabilização da relação custo/benefício.

23 OBJETIVOS Geral Desenvolver uma tecnologia de conservação do ejaculado suíno refrigerado a 17 ºC que possa manter a qualidade seminal in vitro por um período superior a três dias. Específicos ¾ Verificar quais as faixas de temperatura de maior sensibilidade para o espermatozóide suíno; ¾ Identificar qual a melhor relação entre temperatura e tempo de estabilização do sêmen suíno diluído, visando uma menor queda nos valores de vigor, motilidade e alterações morfológicas; ¾ Avaliar a influência da incubação do sêmen in natura no processo de conservação; ¾ Gerar condições para uma conservação mais prolongada de dose de sêmen, sem prejuízo de sua qualidade in vitro;

24 ARTIGO 1 TEMPOS DE EQUILÍBRIO NO PROCESSAMENTO DO SÊMEN SUÍNO Faviano Ricelli da Costa e Moreira; Ricardo Toniolli; Ana Beatriz Graça Duarte. Revista Brasileira de Reprodução Animal, v.25, n.3, p , 2001.

25 TEMPOS DE EQUILÍBRIO NO PROCESSAMENTO DO SÊMEN SUÍNO Moreira, F. R. C.; Toniolli, R.; Duarte, A. B. G. Universidade Estadual do Ceará UECE RESUMO O espermatozóide suíno é bastante sensível ao envelhecimento e ao choque térmico e um fator que pode torná-lo mais resistente é a utilização de uma técnica de abaixamento gradual de temperatura. Portanto, o presente trabalho objetivou encontrar uma metodologia de resfriamento gradual a fim de conservar o poder fecundante do espermatozóide. Para tanto, foi utilizado o sêmen de quatro reprodutores, que foram divididos entre seis lotes. Lote A: Sêmen diluído à 35 ºC e colocado à 17 ºC ; Lote B: Diluição à 35 ºC, 25 ºC por 30 min e posto à 17 ºC; Lote C: Diluição à 35 ºC, 25 ºC por 1 h e posto à 17 ºC; Lote D: Diluição à 35 ºC, 25 ºC por 2 h e posto à 17 ºC; Lote E: Diluição à 35 ºC, 25 ºC por 4 h e posto à 17 ºC; Lote F: Diluição à 35 ºC, 25 ºC por 6 horas e posto à 17 ºC. Após estes tratamentos todos os lotes foram estocados durante sete dias, dos quais quatro foram de análise (D0, D1, D4 e D7), onde a cada dia de análise, fizeram-se leituras de vigor e motilidade aos 5 e 120 min. de incubação à 37 ºC. Não houve diferenças estatísticas entre os lotes do experimento, porém, quando analisado o comportamento dos lotes, notou-se que o lote E foi o que se apresentou de forma mais regular, porém, estes dados não demonstraram significativamente que os períodos de incubação resultam em melhorias da viabilidade espermática, apenas perspectivas para que novos experimentos possam confirmar esta tendência de aumento da resistência. Palavras Chaves: Sêmen, Suíno, Tempos de equilíbrio EQUILIBRIUM TIME ON SWINE SEMEN MANAGEMENT SUMMARY The swine spermatozoa is sensible to cold shock and aging and a factor that can become the spermatozoa more resistant is the utilization of a slower cooling, therefore the aim of this study was find a metodology of slower cooling to conserv the spermatozoa fecundant

26 potential. For this, the semen from four boars was utilized, and divided in six treatments (Trial A: Semen extended at 35 ºC and stored at 17 ºC; Trial B: Semen extended at 35 ºC, 30 min at 25 ºC and stored at 17 ºC; Trial C: Semen extended at 35 ºC, 1h at 25 ºC and stored at 17 ºC; Trial D: Semen extended at 35 ºC, 2h at 25 ºC and stored at 17 ºC, Trial E: Semen extended at 35 ºC, 4h at 25 ºC and stored at 17 ºC; Trial F: Semen extended at 35 ºC, 6 h at 25 ºC and stored at 17 ºC). After this treatments, all trials was stored for seven days, and each day of analysis(d0, D1, D4, and D7), the vigor and motility was measured at 5 and 120 min. of incubation at 37 ºC. No statisticals differences was found, but was observed that behavior of trials with incubation, in special, the Trial E showed more regular behavior. The datas presented here didn t shown that incubation periods result in better viability of spermatozoa, only perspectives that new experiments could confirm this tendency of a increase of resistance. Key Words: Semen, Swine, Equilibrium Time INTRODUÇÃO A suinocultura moderna dispõe de várias maneiras para otimizar a criação de animais baseados em padrões produtivos e reprodutivos. Na vanguarda das tecnologias utilizadas está a inseminação artificial, a qual já é uma biotécnica bem estabelecida e aplicada (Sobestiansky et al, 1998), apesar da menor viabilidade do sêmen suíno em relação a outras espécies (Bwanga et al., 1992). Isto se deve ao fato do espermatozóide do varrão ser muito sensível ao envelhecimento e ao choque térmico, principalmente devido à fragilidade do seu acrossomo (Mies Filho, 1987; Pursel et al., 1972). Esta é a razão pela qual a inseminação artificial suína é realizada em sua grande maioria com o sêmen na forma líquida à temperatura entre 15 e 20 ºC, conservado por até 5 dias (Johnson et al, 2000). Porém, quando o processamento do sêmen é realizado por várias horas, o espermatozóide adquire uma resistência gradual ao choque térmico (Pursel et al., 1973a). O abaixamento de temperatura (35 para 15 ºC) do sêmen leva a uma significativa perda da motilidade, enquanto que a refrigeração lenta fornece uma resistência ao ejaculado (Johnson et al., 2000). O presente trabalho teve por objetivo estabelecer um protocolo de

27 abaixamento de temperatura no processamento do ejaculado suíno a fim de conservar o seu poder fecundante. MATERIAL E MÉTODOS O trabalho foi executado no Laboratório de Reprodução Suína e Tecnologia do Sêmen (LRSTS) da Universidade Estadual do Ceará UECE. Foram utilizados 22 ejaculados coletados pela técnica da mão enluvada, sendo o ejaculado diluído em no diluidor de Beltsville (BTS) e dividido entre 6 lotes: Lote A: Constituiu-se o lote controle, onde o sêmen diluído em BTS à 35 ºC geladeira à 17 ºC; Lote B: Sêmen diluído em BTS à 35 ºC 25 ºC por 30 minutos geladeira à 17ºC; Lote C: Sêmen diluído em BTS à 35ºC 25 ºC por 1 hora geladeira à 17ºC; Lote D: Sêmen diluído em BTS à 35 ºC 25 ºC por 2 horas geladeira à 17 ºC; Lote E: Sêmen diluído em BTS à 35 ºC 25 ºC por 4 horas geladeira 17 ºC; Lote F: Sêmen diluído em BTS à 35 ºC 25 ºC por 6 horas geladeira à 17 ºC. Cada lote foi repartido em 4 tubos de ensaio com capacidade para 5 ml. Cada tubo teve um total de 70 x10 6 sptz em 2 ml de volume (diluidor mais sêmen). De acordo com a concentração de cada ejaculado, volumes diferentes de diluidor foram utilizados para completar os 8 ml que é o volume final de cada lote, respeitando-se a mesma concentração em cada lote. O dia de coleta foi considerado dia zero (D0), sendo o sêmen conservado por 7 dias, dos quais quatro foram de análise (D0, D1, D4 e D7). A cada dia de análise foram retirados os tubos equivalentes a cada lote e incubados em banho-maria à 37 ºC. Após 5 e 120 minutos foram feitas análises do vigor (0-5) e motilidade espermática (%). A análise estatística foi feita através do cálculo das médias e desvios-padrões, nos quais foi utilizado o teste de Mann Whitney (5%) através do programa estatístico STAT VIEW. RESULTADOS E DISCUSSÃO Os dados com relação ao vigor espermático, tanto aos 5 quanto aos 120 minutos de incubação, não mostraram diferenças estatísticas entre as médias dentro de cada dia de análise (Tabelas 1 e 2), exceto no D1, onde, aos 120 minutos de análise o lote D apresentou, estatisticamente, melhores resultados. No entanto ao se analisar o

28 comportamento do sêmen obtido pela diferença dos valores no primeiro dia de análise (D0) e o último dia (D7), observa-se que, principalmente aos 5 minutos, as amostras que tiveram um abaixamento de temperatura durante 4 (Lote E) e 6 horas (Lote F), demonstraram uma queda de valores de forma mais gradual quando comparado com os dados do lote A ou controle. Isto evidencia que este abaixamento gradual permite um ganho de resistência ao espermatozóide suíno, embora no D7, os valores obtidos tenham sido semelhantes, porém, o modo como os lotes chegaram ao último dia de análise demonstra uma melhor resistência adquirida dos Lotes E e F. Já para a motilidade, esta situação aparece de maneira mais evidente (Tabelas 3 e 4), embora, também, não tenha havido diferenças significativas, exceto no D1, onde o lote D mostrou, estatisticamente, resultados mais favoráveis que os demais e no D4, onde, o lote E apresentou-se melhor que os demais, ambos para as leituras efetuadas aos 120 minutos de análise. A ausência de diferenças significativas também pode ser atribuída ao alto desvio padrão encontrado nas amostras. Zou e Yang (2000), ao estudarem a resistência do sêmen suíno frente a diferentes temperaturas, observaram que o espermatozóide, mantido a temperaturas de 20 e 15 ºC, conservam a motilidade quando submetidos a tempos de até oito horas, o que também vem corroborar os dados obtidos neste trabalho, embora a temperatura de estabilização utilizada tenha sido de 25 ºC. Uma importante questão é que mesmo não havendo diferenças estatísticas, observou-se que os lotes com incubação de 2 e 4 horas, foram os que apresentaram maior regularidade e melhores resultados com relação ao comportamento médio da motilidade e do vigor espermático. Baseados nos dados, pode-se concluir que a técnica de abaixamento gradual da temperatura de conservação do sêmen suíno não alterou, estatisticamente, os valores de viabilidade espermática. No entanto estudos mais aprofundados fazem-se necessários para que se possa estabelecer uma real relação entre a curva de abaixamento de temperatura e a resistência adquirida pelos espermatozóides.

29 TABELA 1. Vigor espermático aos 5 minutos de incubação em diferentes tempos de equilíbrio. D0 D1 D4 D7 Média Diferenças (D0 D7) Lote A 3,2 ± 0,6 a 2,9 ± 1,1 a 1,8 ± 1,4 a 1,8 ± 1,4 a 2,4 1,4 Lote B 3,1 ± 0,8 a 2,4 ± 1,5 a 2,5 ± 1,2 a 1,9 ± 1,2 a 2,5 1,2 Lote C 3,2 ± 0,8 a 2,6 ± 1,1 a 2 ± 1,5 a 1,8 ± 1,4 a 2,4 1,4 Lote D 2,9 ± 0,9 a 3 ± 0,6 a 2,3 ± 1,2 a 1,8 ± 1,4 a 2,5 1,1 Lote E 2,8 ± 1,0 a 3 ± 0,7 a 2,6 ± 0,9 a 1,8 ± 1,4 a 2,6 1,0 Lote F 2,8 ± 0,9 a 2,4 ± 1,3 a 2,3 ± 1,2 a 2,1 ± 1,2 a 2,4 0,7 Letras diferentes demonstram diferenças significativas nas colunas ( p < 0,05) TABELA 2. Vigor espermático aos 120 minutos de incubação em diferentes tempos de equilíbrio. D0 D1 D4 D7 Média Diferenças (D0 D7) Lote A 2,8 ± 0,9 a 2,5 ± 1,2 a 1,5 ± 1,2 a 1,7 ± 1,3 a 2,1 1,1 Lote B 2,6 ± 1,1 a 2 ± 1,4 a 2,1 ± 1,1 a 1,7 ± 1,3 a 2,1 0,9 Lote C 2,8 ± 0,9 a 2,2 ± 1,0 a 1,8 ± 1,2 a 1,6 ± 1,3 a 2,1 2,2 Lote D 2,6 ± 1,1 a 2,7 ± 0,8 b 2,1 ± 1,1 a 1,7 ± 1,2 a 2,3 0,9 Lote E 2,5 ± 1,1 a 2,4 ± 1,0 a 2,2 ± 1,0 a 1,6 ± 1,4 a 2,2 0,9 Lote F 2,6 ± 1,2 a 2 ± 1,3 a 2,0 ± 1,2 a 1,7 ± 1,3 a 2,1 0,9 Letras diferentes demonstram diferenças significativas nas colunas ( p < 0,05)

30 TABELA 3. Motilidade espermática aos 5 minutos de incubação em diferentes tempos de equilíbrio. D0 D1 D4 D7 Média Diferenças (D0 D7) Lote A 68 ± 15 a 60 ± 28 a 33 ± 33 a 34 ± 30 a Lote B 67 ± 19 a 50 ± 34 a 48 ± 29 a 36 ± 28 a Lote C 67 ± 19 a 53 ± 27 a 38 ± 31 a 37 ± 31 a Lote D 62 ± 22 a 65 ± 15 a 49 ± 29 a 37 ± 33 a Lote E 57 ± 25 a 65 ± 23 a 51 ± 25 a 35 ± 31 a Lote F 61 ± 23 a 50 ± 32 a 48 ± 30 a 40 ± 29 a Letras diferentes demonstram diferenças significativas nas colunas ( p < 0,05) TABELA 4. Motilidade espermática aos 120 minutos de incubação em diferentes tempos de equilíbrio. D0 D1 D4 D7 Média Diferenças (D0 D7) Lote A 60 ± 21 a 54 ± 29 a 29 ± 29 a 35 ± 29 a Lote B 56 ± 27 a 43 ± 32 a 44 ± 29 a 37 ± 29 a Lote C 62 ± 22 a 47 ± 29 a 37 ± 28 a 33 ± 29 a Lote D 57 ± 27 a 56 ± 23 b 43 ± 27 a 33 ± 27 a Lote E 51 ± 26 a 53 ± 27 a 50 ± 26 b 33 ± 30 a Lote F 55 ± 27 a 40 ± 29 a 44 ± 30 a 33 ± 32 a Letras diferentes demonstram diferenças significativas nas colunas ( p < 0,05)

31 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS BWANGA C. O., MWANGA A; ROFRIGUEZ-MARTINEZ H Post thaw motility, acrosome morphology and fertility of deep-frozen boar semen package in plastic puc-bags. In: Cong. Anim. Reprod., The Hagne, , JOHNSON, L. A., WEITZE, K. F., FISER, P., MAXWELL, W. M. C. Storage of boar semen. Anim. Rep. Sci., 62: , MIES FILHO, A. Inseminação artificial. 6º ed. Porto Alegre. Sulina, v.2, 1987 PURSEL, V. G., JOHNSON, L. A., RAMPACEK, G. B. Acrossome morfology of boar spermatozoa incubated before cold shock. J. Anim. Sci., v.34 n.2, p , PURSEL, V. G., JOHNSON, L. A., SCHUMAN, L. L. Fertilizing capacity of boar semen stored at 15ºC. J. Anim. Sci., v.37, n.2, SOBESTIANSKY, J., WENTZ, I., SILVEIRA, P. R. S., SESTI, L. A. C. Suinocultura Intensiva: Produção, manejo e saúde do rebanho. Brasília : Embrapa-SPI, 388 p. il., 1998 ZOU, C. X., YANG, Z. M. Evaluation on sperm quality of freshly ejaculeted boar semen during in vitro storage under different temperatures. Theriogenology, 53: , 2000.

32 ARTIGO 2 SÊMEN SUÍNO REFRIGERADO À 17 ºC EM DIFERENTES TEMPOS E TEMPERATURAS DE EQUILÍBRIO Faviano Ricelli da Costa e Moreira 1,2, Ricardo Toniolli 1, Roberta Nogueira Chaves 1, Ana Beatriz Graça Duarte 1, Jorge Luiz Ferreira 1 1 Escola Superior de Agricultura de Mossoró, Departamento de Medicina Veterinária, Mossoró-RN. 2 Universidade Estadual do Ceará, Laboratório de Reprodução Suína e Tecnologia do Sêmen, Fortaleza-CE. Este artigo será submetido ao periódico Arquivo Brasileiro de Medicina Veterinária e Zootecnia

33 SÊMEN SUÍNO REFRIGERADO A 17 ºC EM DIFERENTES TEMPOS E TEMPERATURAS DE EQUILÍBRIO Moreira, F.R.C. 1,2, Toniolli, R. 1, Chaves, R.N. 1, Duarte, A.B.G. 1, Ferreira, J.L. 1 1 Escola Superior de Agricultura de Mossoró, Departamento de Medicina Veterinária, Mossoró-RN. 2 Universidade Estadual do Ceará, Laboratório de Reprodução Suína e Tecnologia do Sêmen, Fortaleza-CE. RESUMO A qualidade seminal do ejaculado suíno varia de acordo com o tempo e a temperatura em que o sêmen permanece antes de atingir a faixa final de estabilização (17 ºC). Portanto, o presente trabalho teve por objetivo avaliar o efeito da incubação do sêmen sobre a qualidade espermática, bem como, verificar quais as faixas de temperatura de maior sensibilidade para o espermatozóide suíno. Foram utilizados 57 ejaculados, provenientes de 06 varrões, que foram divididos em 05 tratamentos a seguir: Tratamento A: Sêmen foi diluído a 35 ºC e levado a 17 ºC por 11 dias (controle); Tratamento B: Sêmen diluído a 35 ºC, em seguida a 30 ºC por 4 horas e após este período a 17 ºC por 11 dias; Tratamento C: Sêmen diluído à 35 ºC, em seguida à 25 ºC por 4 horas e após este período a 17 ºC por 11 dias; Tratamento D: Sêmen diluído a 35 ºC, em seguida a 30 ºC por 1 hora, posteriormente a 25 ºC por 4 horas e após este período a 17 ºC por 11 dias; Tratamento E: Sêmen diluído a 35 ºC, a 30 ºC por 1 hora, posteriormente à 25 ºC por 1 hora, e ainda a 20 ºC por 4 horas e após este período a 17 ºC por 11 dias. Foram analisadas as características de vigor, motilidade e morfologia, com resultados comparados pelos testes de Mann- Whitney (vigor e motilidade) e t de Student (morfologia), todos a 5% de probabilidade. Os resultados obtidos mostraram que tanto para o vigor, quanto para a motilidade, houve um comportamento similar, onde no D0, o Tratamento E foi o que apresentou melhores resultados em relação ao tratamento controle (p<0,05). Nos D5 e D9, o tratamento A foi estatisticamente superior ao tratamento E (p<0,05), não havendo alterações nos outros dias.

34 Para a característica morfologia, não houve diferenças entre os tratamentos com e sem incubação. Em todos os tratamentos analisados, encontrou-se queda significativa entre os momentos de análise do sêmen puro e a diluição, e entre a diluição e as análises subseqüentes. Portanto, concluiu-se que a incubação não aumentou o tempo de conservação do sêmen, quando se utilizou a temperatura final de 17 ºC e que o momento da diluição é o momento mais crítico dentro do processamento do sêmen refrigerado. Palavras-chave: Sêmen, Suíno, Incubação, Refrigeração ABSTRACT SWINE SEMEN REFRIGERATED AT 17 ºC IN DIFFERENT TIMES AND TEMPERATURES OF EQUILIBRIUM The quality of the inseminated pig semen vary according to the time and temperature in which the semen stays before reaching the final stage and stabilize (17 ºC); therefore this work had the purpose to determine the effect on the incubation of the semen and the quality, and also verify which temperatures have the most sensibility to the pig spermatozoa. There were used 57, from 06 boars, which were divided in five following treatments: Treatment A: The semen was diluted at 35 ºC and brought down to 17 ºC in 11 days (control); Treatment B: Semen diluted at 35 ºC and brought down to 30 ºC in 4 hours, after this period brought to 17 ºC in 11 days; Treatment C: Semen diluted at 35 ºC and right after brought down to 25 ºC in 4 hours and after this to 17 ºC in 11 days; Treatment D: Semen diluted at 35 ºC then down to 30 ºC in 1 hour then to 25 ºC in 4 hours and after this period to 17 ºC in 11 days; Treatment E: Semen diluted at 35 ºC, down to 30 ºC in 1 hour after that to 25 ºC in 1 hour and still to 20 ºC in 4 hours and after this period to 17 ºC in 11 days. The vigor, motility and morphology characteristics were analyzed and the results were compared with the Mann-Whitney tests (vigor and motility) and the t test of Student (morphology) all at 5% probability. The obtained results showed not only the vigor but also motility a similar behaviour, where in D0, the treatment E was the one which showed the best results about the control treatment (p <0,05). In D5 and D9 treatment A was statistically superior to treatment E (p <0,05) and did not have alterations

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