Melhoramento e Desenvolvimento Educacional da Sysmex No

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1 SEED Haematology Melhoramento e Desenvolvimento Educacional da Sysmex No O papel do esfregaço de sangue periférico no laboratório de hematologia moderno Este boletim informativo tem como objectivo apresentar uma visão geral sobre o papel do esfregaço de sangue periférico, a importância da obtenção de um esfregaço e de uma coloração de boa qualidade e a comparação entre contagens diferenciais manuais e automatizadas. Palavras-chave: Sysmex, CBC, esfregaço de sangue periférico, contagem diferencial manual, monócito, malária, dispositivo de coloração da RAL, Hemoslider da Sysmex, contagem diferencial automatizada Contagem automatizada em hematologia A prática laboratorial em hematologia evoluiu enormemente nas últimas décadas, tendo os hemogramas completos (CBC) obtidos em analisadores automatizados substituído os antigos métodos de ensaio manuais para os parâmetros individuais. A revisão tradicional dos dados obtidos por processos automatizados, mais especificamente da contagem diferencial de leucócitos, para cada amostra analisada, pela observação ao microscópio do esfregaço de sangue periférico foi posta de lado na maior parte dos laboratórios. A razão para tal reside na maior precisão e exactidão da contagem automatizada de células comparativamente aos métodos de contagem manuais tradicionais. Além disso, reconhece-se também que a superioridade da contagem diferencial automatizada se encontra limitada a leucócitos maturos bem caracterizados, ao passo que a microscopia manual se revela melhor para diferenciar células mais imaturas e anómalas, cuja análise se baseia em pequenas variações das características citológicas. Tendo isto em conta, para além dos dados quantitativos, os analisadores fornecem informação qualitativa sob a forma de sinalizadores de alerta (flags) que alertam o operador para a possibilidade de resultados erróneos causados pela interferência de certas variáveis, bem como para a presença de células anómalas. A partir destes dados, é necessário efectuar uma análise selectiva do esfregaço de sangue periférico por método manual com base em dados quantitativos anómalos e sinalizadores de alerta. Apesar de os dados de CBC serem aceites sem entraves, ainda é uma práctica muito comum em muitas instituições proceder automaticamente à confirmação da contagem diferencial de leucócitos através da análise de um esfregaço de sangue periférico em microscopia óptica. O esfregaço de sangue periférico de execução manual Embora a contagem diferencial manual seja geralmente considerada superior à contagem gerada por um analisador para amostras patológicas, tal só se aplica em condições muito estritas. A contagem diferencial manual é efectuada mediante o exame visual de um esfregaço de sangue corado, utilizando um microscópio óptico. A obtenção de um esfregaço de sangue periférico fresco e adequadamente executado é crucial para uma correcta avaliação da morfologia. São quatro os factores que contribuem para o resultado final: a qualidade do esfregaço, a qualidade da coloração, a qualidade do microscópio e a competência e a experiência do técnico de microscopia. a) A realização do esfregaço de sangue O esfregaço de sangue periférico tem de ser

2 2 correctamente realizado. Os esfregaços são geralmente efectuados utilizando a técnica de estiramento ou a técnica da cunha. Os esfregaços manuais são obtidos colocando uma gota de sangue sobre a face de uma lâmina de vidro e espalhando a gota graças à rápida aplicação de uma segunda lâmina ou lamela de vidro sobre a primeira descrevendo um determinado ângulo. Um esfregaço de sangue periférico bem realizado é espesso (os eritrócitos sobrepõem-se em camadas) na extremidade fosca e torna-se progressivamente mais fino, com boa separação das células, em direcção à extremidade oposta. A chamada zona de morfologia, ou seja, a área de espessura óptima para a observação por microscopia óptica, deve ter pelo menos 2 cm de extensão. O esfregaço deve ocupar a área central da lâmina e não apresentar margens nas extremidades. Obter um esfregaço de boa qualidade exige prática. O esfregaço de sangue não deve ser nem demasiado fino, nem demasiado espesso e a cauda do esfregaço deve ser suave. São três os factores que influenciam a obtenção de um esfregaço de boa qualidade: a velocidade, o ângulo e o tamanho da gota. Quanto mais depressa se deslocar a lamela, mais comprido e fino será o esfregaço. Se a lamela for movida lentamente, o esfregaço será mais curto e espesso. Um ângulo superior a 30 torna o esfregaço mais espesso; se for inferior a 30, o esfregaço será mais fino. Uma pequena gota de sangue pode ser insuficiente para preparar uma lâmina de comprimento suficiente; uma gota demasiado grande pode fazer com que o esfregaço se alongue e ultrapasse o comprimento da lâmina. A viscosidade (hematócrito) do sangue, que pode variar muito de doente para doente, também afectará o esfregaço. O sangue de um doente com anemia terá menor viscosidade, e o esfregaço será demasiado fino se não se aumentar o ângulo. O oposto aplica-se ao sangue de um doente com policitemia. Os esfregaços de sangue demasiado finos ou demasiado espessos constituem um problema. Esfregaços extremamente finos (originados por uma gota demasiado pequena, por um estiramento muito lento ou a) b) Fig. 1 a) Esfregaço manual de sangue periférico de má qualidade e b) Esfregaço automatizado de boa qualidade por um ângulo demasiado pequeno) podem fazer com que os RBC pareçam esferócitos e exacerbar o tamanho dos WBC, como monócitos e neutrófilos, nas caudas, originando uma contagem diferencial incorrecta. No caso de esfregaços extremamente espessos, a área de contagem é demasiado pequena. Para uma contagem diferencial de WBC exacta, são necessários pelo menos dez campos de baixa potência em que cinquenta por cento dos RBC não se sobreponham. Os esfregaços com caudas excessivas ou com extremidades retículogranulosas indicam que o bordo da lamela é irregular ou está sujo ou que existe uma acumulação de leucócitos causada pela lentidão do estiramento ou por uma contagem de leucócitos muito elevada. b) A coloração do esfregaço de sangue O esfregaço de sangue periférico tem de ser submetido a coloração, para que os pormenores do citoplasma e do núcleo dos vários tipos de células fiquem mais visíveis. As colorações de Romanowsky ou delas derivadas, como as colorações de Wright, Wright-Giemsa e May-Grünewald Giemsa, são universalmente usadas em hematologia. A coloração de Romanowsky designa qualquer combinação de colorações constituída por eosina e azulde-metileno e/ou qualquer dos produtos da sua oxidação. Tais colorações produzem a típica coloração das células em tons de azul, púrpura e rosa quando observadas ao microscópio. Ver o quadro 1.

3 3 Quadro 1: Resposta dos componentes celulares à coloração de Romanowsky Núcleo Citoplasma Grânulos Componente Celular Cromatina Nucléolos Eritrócito Reticulócito Linfócito Monócito Neutrófilo Eosinófilo Basófilo Neutrófilo (granulação tóxica) Eosinófilo Basófilo Plaqueta Cor Púrpura Azul-claro Rosa-escuro Azul-cinza Azul Azul-cinza Rosa Rosa Azul Inclusões Parasita da malária Púrpura Púrpura (azul-escuro) Vermelho-alaranjado Púrpura-negro Púrpura Adaptado de Dacie and Lewis, Practical Haematology 1 i. Como funcionam os corantes O mecanismo pelo qual certos componentes estruturais de uma célula ficam corados na presença de um determinado corante, ao passo que outras estruturas similares não, embora corem com outros corantes, depende de diferenças complexas entre os corantes, da forma como estes interagem entre si, bem como do ph do corante e do microambiente celular. As estruturas acídicas absorvem o corante básico azul-de-metileno que, conforme o nome indica, apresenta cor azul. Pelo contrário, as estruturas básicas ou alcalinas ligam-se a corantes ácidos, neste caso a eosina, que é cor-de-rosa. Uma forma prática de recordar este princípio é ter presente o cor-de-rosa intenso dos grânulos eosinófilos e a cor púrpura intensa dos grânulos basófilos. O termo eosinófilo indica afinidade para a eosina (o corante cor-de-rosa), indicando o termo basófilo afinidade para o corante básico ou azul. O álcool metílico é usado quer como solvente, quer como fixador e faz parte do procedimento da coloração de Romanowsky. com depósitos de corante. As estruturas celulares possuem afinidades diferentes para os diversos corantes o ADN liga-se rapidamente, o ARN tarda mais e a hemoglobina é a mais lenta. Uma correcta temporização é, pois, fundamental para se obter resultados de boa qualidade. É, também, crucial preparar os vários componentes da coloração na proporção correcta, dado que interagem entre si. Esta possibilidade de variação é eliminada com a utilização de formulações para coloração disponíveis comercialmente, mas é uma fonte comum de erro nas colorações de preparação manual. Como já foi referido, o ph da solução de coloração é crucial. O valor geralmente recomendado situa-se entre os 6,8 e os 7,2. Outras fontes de erro muito comuns são o uso excessivo de corante e valores elevados de temperatura ambiente, que causam a evaporação e a contaminação com bactérias e outros resíduos. Preparação de lâminas e coloração automatizadas A menos que os técnicos laboratoriais respeitem orientações estritas na preparação das lâminas e na realização da coloração, existe a possibilidade de se obterem esfregaços de má qualidade. Isto, por sua vez, poderá dar origem a interpretações erróneas da observação microscópica, com consequências potencialmente graves para a prestação de cuidados de saúde ao doente. De harmonia com os princípios das boas práticas laboratoriais, a normalização dos processos de preparação de lâminas e de coloração permitirá garantir a boa qualidade dos esfregaços de sangue periférico. A melhor forma de normalização é a automatização. Na maior parte dos laboratórios que possuem algum tipo de automatização, esta está limitada ao processo de coloração. Na sua maioria, ii. Factores que originam uma coloração de má qualidade São muitos os factores que podem dar origem a uma lâmina mal corada. A má coloração pode traduzir-se numa lâmina que se apresenta muito escura ou muito clara, com excesso de azul ou excesso de rosa, com grânulos muito escuros ou ausentes, com fundo azul ou Fig. 2 O Hemoslider da Sysmex

4 4 os sistemas de coloração automatizada são designados como sistemas abertos, que permitem o uso de qualquer corante, incluindo os de preparação manual, pelo que apenas a duração do procedimento de coloração é controlada. Nestes casos, não é eliminada a possibilidade de se obter uma coloração de má qualidade por utilização de corante em excesso ou devido a uma composição incorrecta. Por outro lado, o facto de no dispositivo de coloração automatizada se introduzirem, invariavelmente, esfregaços feitos manualmente, também não permite garantir resultados com qualidade. No outro extremo do espectro, encontra-se um dispositivo de coloração de lâminas totalmente automatizado como o SP-1000i da Sysmex, que só é rentável para laboratórios com grande volume de trabalho. A boa notícia é que a Sysmex, em parceria com a RAL Diagnostics, dispõe agora de uma solução para laboratórios de pequena dimensão. Hemoslider. Todas as fontes de erro acima referidas podem ser eliminadas por completo usando a combinação do Hemoslider com a unidade de coloração da RAL. O analisador permite a carga e descarga contínuas, oferecendo também a possibilidade de se introduzir uma lâmina urgente em qualquer altura. Uma das suas grandes vantagens é não precisar de manutenção. Do ponto de vista da segurança e do ambiente, há a ter em conta que as colorações não contêm metanol. a) O Hemoslider da Sysmex Trata-se de um dispositivo pequeno, portátil, de construção robusta e cunha normalizada para preparar esfregaços. É fácil de usar e limpar e as lâminas do espalhador podem ser substituídas. Coloca-se uma pequena gota de sangue numa das extremidades da lâmina e faz-se passar sobre ela o espalhador. O resultado é um esfregaço bem realizado, de qualidade homogénea, com uma dispersão uniforme das células. b) A unidade de coloração automatizada da RAL O dispositivo de coloração da RAL é uma unidade de coloração automatizada fácil de usar. Os reagentes são fornecidos em cartuchos fechados munidos de etiquetas RFID que previnem a utilização do reagente após o prazo de validade e o excessivo consumo do mesmo, um problema comum noutros métodos não fechados. Os protocolos de coloração foram optimizados para esfregaços de sangue periférico obtidos com o Fig. 3 A unidade de coloração automatizada da RAL Diagnostics A unidade de coloração dispõe de um protocolo para coloração de lâminas de medula óssea e para despiste da malária. Em breve estará disponível uma versão semiautomatizada deste dispositivo. Nesta versão, o operador precisará de mover o cesto das lâminas de um tanque de coloração para o seguinte, após o alerta do temporizador do analisador. Este temporizador é automaticamente configurado de acordo com a selecção do protocolo de coloração.

5 5 A observação microscópica do esfregaço de sangue periférico Só é possível obter resultados óptimos se, para além de um esfregaço e de uma coloração de boa qualidade, se utilizar um microscópio bem mantido e a observação for feita um microscopista competente. Acresce que os analisadores automatizados contam um maior número de eventos. Um analisador Sysmex, por exemplo, fornecerá uma contagem diferencial de leucócitos de cerca de células, comparativamente a uma contagem de apenas 100 pelo método manual padrão. As diferenças podem ser substanciais, por várias razões. À semelhança de todos os equipamentos de laboratório, o microscópio requer uma rotina de manutenção regular. Os climas quentes e húmidos são especialmente problemáticos, dado que pode haver crescimento de fungos se não forem tomadas as devidas precauções. Esta situação danificará o sistema óptico e inutilizará o microscópio. Pelo contrário, em climas quentes e secos, o problema é o pó. O microscópio tem de ser correctamente configurado para se obter uma iluminação correcta e para eliminar possíveis artefactos de refracção que podem ser erradamente interpretados como inclusões celulares. Contagens diferenciais de células manuais versus contagens automatizadas Consulte o boletim SEED N.º 5, de 2011, para ver uma descrição detalhada da técnica rigorosa que os analisadores Sysmex utilizam para contar e diferenciar as subpopulações de leucócitos. Nos casos em que se procedeu à comparação entre os resultados de uma contagem diferencial automatizada e os resultados de uma contagem diferencial manual, foram observadas diferenças. Perante esta diferença, a reacção da maior parte dos técnicos de laboratório é pôr em causa o rigor da contagem automatizada. Convém lembrar que a atribuição do estatuto de método de referência à contagem diferencial manual tem por base a recomendação do CLSI da contagem de 800 células (2 operadores contam 200 células cada um em dois esfregaços diferentes), e não o procedimento de rotina geralmente usado da contagem de 100 células, feita por um único operador num único esfregaço. a) A desigual distribuição das células num esfregaço Infelizmente, mesmo num esfregaço perfeitamente executado, a distribuição das células não é aleatória. Em regra, os neutrófilos e os monócitos tendem a acumular-se nos bordos do esfregaço e os linfócitos no meio. Este problema acentua-se se o esfregaço for demasiado fino ou se o bordo da lamela for irregular. Na contagem automatizada, as células encontram-se em suspensão e são contadas todas as células contidas na alíquota da amostra. b) Anomalias na escolha das células a contar e omissão de células Faz parte da natureza humana que, à medida que se varre a lâmina à procura de uma boa área para efectuar a contagem, a atenção se fixe em quaisquer células invulgares que surjam no campo de visão e que se use essa área como ponto de partida. Assim, pode ocorrer uma sobrestimativa da percentagem de células anómalas presentes. Da mesma forma, existe uma tendência generalizada para simplesmente ignorar quaisquer células que se apresentem difíceis de classificar morfologicamente. O analisador, porém, identifica e classifica todas as células. Em geral, a contagem de monócitos é a mais frequentemente identificada como susceptível de produzir discrepâncias nos resultados dependendo do método de contagem, por várias razões. Em primeiro lugar, os monócitos tendem a acumular-se na cauda do esfregaço, que, regra geral, não é área de contagem. Em segundo lugar, pode ser difícil distinguir morfologicamente os monócitos dos linfócitos activados, pelo que são geralmente desprezados na contagem das 100 células. Em terceiro lugar, quanto mais velha for a amostra de sangue antes da execução do esfregaço, maior o nível

6 6 de desintegração das células em geral e mais difícil será a identificação rigorosa dos monócitos em especial. Os eosinófilos e os basófilos, embora relativamente pouco comuns, são muito diferentes, sendo, por isso, fáceis de identificar. Por último, os monócitos são uma população celular minoritária, pelo que quaisquer diferenças, por pequenas que sejam, introduzidas pelos pontos um a três acima referidos serão acentuadas. Por conseguinte, as contagens automatizadas de monócitos são, em regra geral, superiores às contagens manuais de monócitos. Estas diferenças seriam menores se os laboratórios respeitassem a recomendação do CLSI da contagem de 800 células, mas é óbvio que tal não é prático, nem mesmo no mais exigente dos laboratórios. Tendo em conta a reduzida fiabilidade da contagem manual de monócitos, propôs-se a contagem por citometria de fluxo utilizando anticorpos monoclonais CD45 e CD14 marcados por fluorescência como novo método de referência para a contagem de monócitos. Este método revelou uma boa correlação com a contagem automatizada 2. Intervalos de referência para as contagens diferenciais automatizadas e manuais A forma de ultrapassar as aparentes diferenças entre as contagens diferenciais de células automatizadas e as contagens diferenciais manuais em geral, e as de contagens de monócitos em particular, consiste em aderir aos princípios gerais das boas práticas laboratoriais e estabelecer intervalos de referência específicos para cada método. Deste modo, os valores obtidos serão interpretados em relação a valores de referência apropriados, não tendo qualquer impacto negativo na avaliação clínica. Populações de células normais versus populações de células patológicas Conforme descrito no boletim SEED n.º 5, de 2011, os analisadores automatizados alertam o operador para a suspeita da presença de leucócitos anómalos mediante sinalizadores de alerta. Neste caso, convém fazer um esfregaço de sangue periférico e proceder à sua observação ao microscópio. No entanto, para amostras perfeitamente normais, que não geram sinalizadores de alerta, a contagem diferencial automatizada apresenta maior exactidão, tornando obsoleta a contagem manual. Informação a reter 1. Na era da tecnologia da automatização, não se justifica a realização da contagem diferencial manual e da observação de esfregaços de sangue periférico para todos os casos. Estes procedimentos devem ser reservados para aquelas amostras que o analisador identifique como duvidosas relativamente a possíveis anomalias morfológicas ou numéricas. Isto permitiria que os laboratórios utilizassem eficientemente as competências e a disponibilidade dos seus técnicos para se concentrarem apenas nos esfregaços que efectivamente requerem a sua atenção. 2. Para que a observação microscópica forneça informações fiáveis para a decisão clínica, é necessário optimizar a qualidade do esfregaço e da coloração. A melhor forma de o conseguir reside na automatização, tanto da preparação das lâminas, como da coloração. A Sysmex tem uma solução para o efeito, graças à combinação do Hemoslider (unidade de preparação automatizada de lâminas) com a unidade de coloração automatizada de lâminas da RAL Diagnostics 3. Haverá diferenças entre as contagens diferenciais manuais e automatizadas, especialmente na contagem de monócitos. É aconselhável utilizar intervalos de referência diferentes, específicos para cada método. Referências bibliográficas 1. Dacie and Lewis, Practical Haematology, 9 th edition, Eds SM Lewis, BJ Bain, I Bates, Chapter 4 Preparation and staining methods for blood and bone marrow films, page Hübl W, Andert S, Erath A, Lapin A, Bayer PM. Peripheral blood monocyte counting: towards a new reference method. Eur J Clin Chem Clin Biochem 1995; 33: Compiled by Dr Marion Münster Sysmex South Africa (Pty) Ltd. Fernridge Office Park Block 2, 5 Hunter Avenue, Ferndale, Randburg 2194, South Africa Phone Fax info@sysmex.co.za