IDENTIFICAÇÃO TAXONOMICA DE CUPINS COHABITANTES DE MONTÍCULOS DE SOLO NA REGIÃO DE CAMPINAS COM BASE EM SEQUENCIAS DE DNA

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1 IDENTIFICAÇÃO TAXONOMICA DE CUPINS COHABITANTES DE MONTÍCULOS DE SOLO NA REGIÃO DE CAMPINAS COM BASE EM SEQUENCIAS DE DNA João H. P. Giudice Faculdade de Ciências Biológicas Centro de Ci6encias da Vida Edmilson Ricardo Gonçalves Grupo de pesquisa: ecologia, biologia Molecular e Filogenia de cupins Centro de Ciências da Vida Resumo: A espécie Cornitermes cumulans é também conhecida como cupim de montículo e já foi descrita como praga de cultura de cana-de-açúcar. Ninhos de C. cumulans podem ser utilizados como habitat de várias outras espécies, incluindo outras espécies de cupins e formigas. Uma vez que o gênero Cornitermes já foi descrito como praga de cana-de-açúcar por alguns autores, sua presença no agroecossistema poderia estar correlacionada com a ocorrência e distribuição de outras espécies co-habitantes, também com potencial de praga. Assim, é fundamental conhecer as espécies que se associam a esse gênero para avaliar o potencial de risco que esses cupins podem trazer à agricultura. O presente trabalho teve como objetivo identificar, através de sequencias de DNA, as espécies de cupins que co-habitam ninhos epígeos na região de Campinas. Para a identificação molecular foram extraídos DNA de amostras de cupins provenientes de diferentes regiões no distrito de Campinas, seguido de amplificação por PCR e sequenciamento do gene COII destas mesmas amostras. A identificação foi realizada por comparação de similaridade entre sequencias obtidas no presente trabalho e sequencias depositadas no GenBank. A identificação por DNA provou ser eficiente na classificação de espécies, em vários graus taxonomicos, desde que o banco de dados possua sequencias de DNA para comparação. Sendo assim, em alguns casos, este tipo de identificação foi capaz jikde confirmar as espécies já classificadas anteriormente pela taxonomia clássica como foi o caso para Procornitermes araujoi. Em outros casos, por exemplo Rynchotermes nasutissimos, este método foi incapaz de identificar o gênero e espécie da amostra devido ao fato do banco de dados não possuir sequencias similares para comparação; num outro exemplo, onde a taxonomia clássica não conseguiu identificar a espécie do gênero Velocitermes, por comparação em banco de dados, as sequencias de DNA obtiveram resultado positivo, sendo capazes de indicar a espécie em análise. Palavras-chave: cupim, código de barra de DNA, taxonomia. Área do Conhecimento: Ciências Biológicas Sub-área: Biologia Molecular 1. INTRODUÇÃO A espécie Cornitermes cumulans é também conhecida como cupim de montículo. Embora freqüente nos pastos da região sudeste e centro-oeste de nosso pais, muitos aspectos da biologia dessa espécie permanecem obscuros, tais como comportamento e alimentação [1]. Os estudos sobre essa espécie, no que se refere ao seu potencial como praga ainda é controverso [2,3]. Assim como a maioria das espécies do gênero Cornitermes, C. cumulans constrói ninhos epígeos e são consumidores de serrapilheiras [4]. Os ninhos de C. cumulans podem ser utilizados como habitat de várias outras espécies, incluindo outras espécies de cupins e formigas. Sendo que já foi registrada a presença de duas a 14 espécies em um mesmo ninho [5,6.7]. Além das diferentes espécies de térmitas, outros insetos têm sido encontrados como co-habitantes dos ninhos, em especial formigas, como o relatado na literatura [8,9}. Diversos fatores podem determinar a ocorrência ou não de co-habitantes, entre eles a capacidade da espécie de construir ninhos; as características do ninho; os mecanismos de defesa e a quantidade de soldados das colônias; as características de outras espécies presentes na área de estudo e, por fim, a densidade com que estas aparecem. A identificação de espécie utilizando como princípio a comparação de sequencias de DNA teve início nos anos 1990 com o desenvolvimento da téc-

2 nica de PCR [10]. Desde então, esta técnica vem facilitando e ajudando o trabalho de taxonomistas uma vez que espécimes danificadas, imaturas ou mesmo larvas e ovos são muito difíceis ou impossíveis de serem classificados até mesmo por um profissional experiente (http://www.barcodeoflife.org/content/about/what-dnabarcoding). Mais tarde o DNA barcoding (Código de barra de DNA) foi introduzindo por Paul Hebert. O presente trabalho apresenta uma primeira etapa na compreensão da Biologia das espécies de cupins cohabitantes de ninhos de Cornitermes cumulans, abrindo possibilidades de novos estudos com foco no controle e dispersão das espécies pragas. 2. Material e Métodos Coleta de cupins e extração de DNA Foram escolhidas 9 áreas aleatórias na região de Campinas que apresentavam pastos com ninhos epigeos (Figura 1 e Quadro 1). Todas as áreas foram delimitada em uma fração de 100 X 100 metros compreendida entre 4 pontos, cada qual georreferenciados (Quadro 1). Foram coletadas amostras de cupins de todos os cupinzeiros visíveis no interior dessa área selecionada. Quadro 1: Informações das coletas: áreas de coleta, data das coletas, coordenadas geográficas e a indicação na Figura 1. Data Área de coleta Coorda 29/10/2012 Bela Aliança 09/01/2013 Viracopos 14/03/2013 Taquaral 14/03/ /03/ /03/2013 D. Pedro (Rossi) Escola de Cadetes (Circulo Militar) Parque Ecólogico 21/03/2013 Balão Iguatemi 27/03/2013 San Conrado 15/01/2014 Trilha Joaquim Egídio S22º56 50 W47º S23º W047º S22º52'351" W047º02'958" S22º50'911" W047º03'556" S22 52'305" W047 04'787" S22 54'546" W047 00'938" S22 53'767" W047 01'786" S22 51'114" W046 58'336" Indicação no Mapa S22 52'410'' 9 Figura 1. Áreas de coletas de cupins de ninhos epigeos na região de Campinas, SP representados por pontos amarelos. (imagem:google Earth) Coleta e triagem Primeiramente, os montículos (cupinzeiros) foram georreferenciados, tendo seus pontos marcados e anotados, a data da coleta e o número do ninho foram postos a frente do monte para registro fotográfico (Figura 2). Os ninhos encontrados foram caracterizados quanto ao diâmetro e altura da porção epígea, medindo-se o diâmetro da porção superior, média e inferior (Figura 3). Com uma picareta o ninho foi quebrado e os fragmentos tirados foram levados em sacos plásticos com identificação do ninho e da porção escolhida. O material coletado foi levado para laboratório para identificação das espécies presentes de acordo com a porção no ninho de onde foram coletados. Em uma segunda triagem, o material foi separado, tendo uma parcela encaminhada para analise de DNA, outra com térmitas (cupins) e possíveis térmitas co-habitantes (encontrados no mesmo cupinzeiro) e uma ultima com não térmitas co-habitantes. Todos os dados obtidos foram registrados em planilha de Excel e identificados. O material foi armazenado a -20 em etanol 80%

3 Identificação com base em características morfológicas A identificação taxonômica com base em características morfológicas (identificação clássica) foi realizada com base em chave dicotômicas disponíveis na literatura pelo grupo da pesquisora Luciane Kern Junqueira da Pontifícia Universidade Católica de Campinas. Extração e purificação de DNA Apos a extração e purificação de DNA de cupins de acordo com protocolo descrito em literatura [11]. Após a purificação, todas amostras de DNA foram mantidas sob refrigeração à 8ºC. Para a avaliação da qualidade e quantidade de DNA, 5 ml de cada amostra extraída e purificada com os diferentes métodos foram submetidas à eletroforese em gel de agarose 1 % em TAE 1X (Trisacetate-EDTA) e corados com blue Green Loading dye (Figura 2) de acordo com as especificações do fabricante (LAB TRADE). ciclos de 1 minuto a 94oC, 1 minuto a 46 o.c e 1 minuto a 72 o.c, 35 ciclos de de 1 minuto a 94oC, 1 minuto a 52 o C e 1 minuto a 72 o.c, seguidos de 3 minutos a 72 o.c. Escolha das amostras para sequenciamento de DNA Utilizou-se amostras de todas as áreas e abrangendo famílias, gênero e espécies diferentes para se obter uma variedade maior de resultados e possibilitar a comparação entre eles.uma vez escolhidas as amostras para identificação molecular, seus respectivos DNAs foram utilizados para amplificar o gene mitocondrial COII. Os produtos dessas amplificações foram purificadas com a enzima Exo-sap para remover qualquer remanescente de primer e/ou dntps do PCR e encaminhadas ao Laboratório Central de Tecnologias de Alto Desempenho (LACTAD) da Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP). Os resultados do sequenciamento foram analisados com o auxilio de três programas, BioEdit; Sequence Scanner 2 e Gene Runner. Uma vez verificada a qualidade das sequencias de DNA obtidas, essas foram submetidas a comparação com sequencias depositadas no Genbank por Blastn (NCBI) para identificação das espécies. 3. Resultados e discussões Figura 2: Eletroforese em gel de agarose 1% com amostras de DNA de cupim Escolha dos primers para amplificação das subunidades de citocromo oxidase. Artigos descrevendo a amplificação dos genes CO1, CO2, CO3 em insetos foram avaliados em busca dos melhores primers (iniciadores). De acordo com as descrições dos resultados nos artigos encontrados foram selecionados 5 primers. Os primers para amplificação do gene mitocondrial COI, COI, HCO e LCO foram sintetizados de acordo com as sequências descritas por Miura et al. (1998), Liu & Beckenbach (1992) e Folmer et al. (2007) respectivamente. No presente trabalho o gene amplificado foi o gene CO2 (Citocromo oxidase subunidade 2) utilizando os primers P2 (2B-Lys) e P3 (1-C1-J-2773). As de amplificação por PCR foram efetuadas em volume final de 25 microlitros nas seguintes condições: 1 minuto a 94 o.c de desnaturação incial. Seguido por 5 Identificação Taxonômica Das amostras de cupins coletadas em ninhos epigeos na região de Campinas, com base em características morfologicas, puderam ser identificadas algumas espécies e, em alguns casos, até gêneros, por ausencia de chave de classificação do grupo em questão (Quadro 2). A partir desses dados, as amostras foram selecionadas para análises de Biologia Molecular, buscando a identificação da espécie ou a confirmaçao dos dados de taxonomia clássica. No presente trabalho, amostras de cupins das espécies Procornitermes araujoi e Cornitermes cumulans puderam ser identificadas com similaridade acima de 98% com sequencias de DNA depositadas no Genbank. Entretanto, amostras de espécies do gênero Rynchotermes não puderam ser identificas corretamente, apresentando similaridade máxima de 89% com o gênero Embiratermes. O mesmo foi encontrado para a amostra 402 de Labiotermes longilabius. O [D igi te u ma citaçã o do do cu

4 DNA dessa amostra apresentou 91% de similaridade com Embiratermes transandinus. Em ambos os casos, se deve ao fato de não haver, até o momento, nenhuma sequencia depositadas de gene mitocondrial COII de espécies do gênero Rynchotermes ou Labiotermes no Genbank. A amostra 474, identificada por características morfológicas como Cornitermes cumulans apresentou similaridade de 95% com sequencia dessa mesma espécie depositada no Genbank. Esse resultado é interessante, pois 5% de divergência pode significar uma espécie diferente dentro do gênero Cornitermes. Hebert et al (2003) trabalhando com espécies de borboletas, encontrou variação menor que 1% entre indivíduos de uma mesma espécie e variações entre 5 e 10% entre espécies de um mesmo gênero. O resultado encontrado com Cornitermes pode representar duas espécies distintas muito semelhante morfologicamente ou uma mesma espécie com grande variação na sequencia do gene COII analisado. Outras amostras de Cornitermes cumulans precisam ser analisadas para verificar essa dúvida. A amostra 122 de velocitermes sp apresentou 91% de similaridade com a espécie Velocitermes velox. Esse valor é insuficiente para que a amostra seja classificada como Velocitermes velox. O valor está num nível aceitável para a confirmação do gênero, mas não para a espécie. Em todos os casos, a correta identificação depende de um banco de sequencias consistente e baseado em uma correta identificação taxonômica clássica. Em outras palavras, quanto mais amostras corretamente classificadas forem depositadas no banco, maior o sucesso na classificação molecular de trabalhos posteriores. É importante que espécies brasileiras de cupins também sejam analisadas e depositadas nesse banco, permitindo a correta identificação das espécies de cupins por diferentes grupos de pesquisa, passo essencial para a compreensão da biologia desses insetos. [2] VALÉRIO et al. (1998). Controle Químico e Mecânico de Cupins de Montículo ( Isoptera : Termitidae ) em Pastagens, 27 (1): [3] WILCKEN, C.F. (1992). Anais da Sociedade Entomológica do Brasil, 21: [4] CONSTANTINO, R. (1999). Papéis Avulsos de Zoologia, v. 40: [5] DOMINGOS et al. (1996). Rev. Bras. Biol., v. 56: [6] DOMINGOS, et al. (1996). Rev. Bras. Biol., v. 56: [7] FLORENCIO et al. (2002). Acta Biologia Leopoldensia, v.24: [9] DIEHL et al.. (2005). Brazilian journal of biology = Revista Brasileira de Biologia, 65(3), [10] ROSA, A. J. de M.; SONODA, K. C Disponível em: <http://www.cpac.embrapa.br/noticias/artigosmidia/ publicados/217/>. Acesso em: 22 jul [11] DONNAN LABORATORIES. Disponível em: SOLATIO.PDF. Acesso em 19/01/2011. [12] MIURA et al. (1998). Annals of Entomology Society of America, 91: [13] LIU. H. & BECKENBACH, A.T. (1992). Molecular and Phylogenetic Evolution, 1: [14] FOLMER et al. (1994). Molecular Marine Biology and Biotechnology, 3, REFERÊNCIAS [1] SANTOS et al. (2011). Comunicação sobrevivência de operários do cupim-de-montículo Cornitermes cumulans ( kollar, 1832 ) ( Isoptera : Termitidae ) alimentados,

5 Quadro 2: Comparação entre a taxonomia clássica e molecular de amostras de Cupins Amostra Identificação Taxonômica com base em características morfológicas Identificação Molecular % Similaridade com GenBank Gênero Espécie Gênero Espécie transandinus 171 Rynchotermes nasutissimos Embiratermes 89% 474 Cornitermes cumulans Cornitermes sp 95% Orthagnathotermes 165 mirim Orthagnathotermes sp 92% 219 Procornitermes araujoi Procornitermes araujoi 98% 487 Cornitermes cumulans Cornitermes cumulans 99% 499 Cornitermes cumulans Cornitermes cumulans 98% transandinus 412 Labiotermes longilabius Embiratermes 91% 215 Procornitermes araujoi Procornitermes araujoi 99% 122 Velocitermes sp Velocitermes velox 91% 418 Cornitermes cumulans Cornitermes cumulans 99%

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