Por tanto, a presente pesquisa objetiva avaliar o potencial térmiticida do extrato bruto obtido a apartir do carpóforo de Pycnoporus sanguineus

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1 INTRODUÇÃO Os cupins ou térmita são insetos eusociais da ordem Isoptera, com cerca de espécies catalogadas no mundo. No Brasil, as principais famílias encontradas são: Kalotermitidae, Termopsidae, Rhinotermitidae, Termitidae e Serritermitidae, entre as quais apenas Kalotermitidae, Rhinotermitidae e Termitidae são economicamente importantes (GALLO et al., 2002). Os cupins podem ser considerados insetos benéficos, pois atuam na decomposição da matéria orgânica e colaboram na ciclagem dos nutrientes e na aeração do solo. Entretanto, também podem se destacar como pragas de espécies florestais e algumas culturas agrícolas, como milho, cana-de-açúcar, arroz, mandioca, entre outras. O principal dano causado pelos cupins é conseqüência da sua capacidade de digerir celulose: são os principais agentes biológicos de degradação de madeira. Além disso, várias espécies de cupins são pragas agrícolas nos trópicos, alimentando-se de várias partes de plantas cultivadas, incluindo cana-de-açúcar, eucalipto, amendoim, frutíferas e outras. Sua expansão é facilitada pelo transporte de madeira pelo homem de uma região para outra e pelas condições favoráveis encontradas em cidades. O controle de cupins é feito quase que exclusivamente com produtos químicos com emprego de iscas atrativas, que baseiam-se no princípio da transmissão de agentes químicos ou microbianos diretamente para insetos atraídos, visando atingir toda a colônia (ALMEIDA et. al., 1994; 1998). Contrapondo-se a inúmeras vantagens apresentadas pela madeira e seus derivados, determinantes para a sua ampla utilização, existe a biodeterioração, pois segundo OLIVEIRA et al. (1986), a madeira é um material de origem orgânica e como tal está sujeita à deterioração por agentes biológicos (fungos, bactérias, insetos e brocas marinhas). Os organismos biodeterioradores apresentam 14

2 características morfológicas, fisiológicas e comportamentais especiais que os tornam capazes de utilizar a material lignocelulolítico como substrato, abrigo e alimento. Nesse contexto, destaque especial é dado aos cupins ou térmitas que, por causa da capacidade de digerir celulose proporcionada por fauna microbiológica simbionte presente em seu intestino, são atraídos por todo o material de origem celulósica, como a madeira em seu estado bruto, papel, tecidos e outros (GRASSÉ, 1982; OLIVEIRA et al., 1986). Os danos causados, por cupins em construções, trazem enormes prejuízos, pois, de maneira geral, são percebidos quando já causaram grande comprometimento estrutural. Os custos, com o controle curativo e recuperação das construções, é alto. No Brasil, existem poucas espécies de cupins considerados prejudiciais cuja biologia é pouco conhecida, por isso, EDWARDS & MILL(1986), LELIS (1995) e WALLER e LA FAGE (1986) torna-se portanto,a necessidade da realização de estudos que contribuam para o conhecimento da biologia desses insetos, sobre as principais espécies que causam danos em áreas urbanas, bem como sobre as que apresentam potencial de se tornarem pragas, e a sua distribuição. Apesar dos térmitas pertencerem a um dos grupos animais mais bemsucedidos do planeta, poucas espécies têm tido sucesso na transição do ambiente natural para o ambiente urbano e o sucesso de algumas espécies tem sido relacionado a sua habilidade em se adaptar às mais variadas condições existentes em meio urbano (ROBINSON, 1996). WALLER & LA FAGE (1986) alguns pesquisadores acreditam que a eliminação de competição e a eliminação dos predadores pelo homem facilitaram a proliferação dos térmites em áreas urbanas.segundo (LELIS 1999), a densidade e a proximidade das edificações em grandes cidades, como ocorre em São Paulo, facilitam a infestação por cupins subterrâneos que estão presentes em árvores de praças e jardins e em grandes parques. No Brasil, os ataques mais freqüentes às edificações urbanas têm sido ocasionados por cupins pertencentes a dois grupos: cupins subterrâneos e cupins de madeira seca (LELIS, 1976). As colônias de cupins de madeira seca, segundo MARER (1991), pertencem à família Kalotermitidae e infestam madeira seca, não- 15

3 apodrecida, estrutural, móveis, ramos de árvores vivas em locais sombreados, árvores em pomares, postes e madeiras armazenadas. Com base nessas áreas, reprodutores alados migram para novas construções e outras estruturas em dias ensolarados nos meses chuvosos. Segundo MARER (1991), as colônias desses cupins geralmente são pequenas e são capazes de viver em pequenas peças de madeira que podem ser acidentalmente transportados pelo homem implicando na sua ampla área de distribuição. O uso de fungos como controle biológico contra pragas agrícolas vem se intensificando nos últimos anos, uma vez que em muitas situações pode substituir com vantagens o controle químico, devido a proibição do uso de inseticidas clorados, a partir de 1985, outros produtos passaram a ser utilizados, além do incremento na pesquisa de agentes de controle biológico, buscando um controle mais racional e menos prejudicial ao homem e ao ambiente (ZANETTI et al., 2002). Por outro lado o fungo Pycnoporus sanguineus é degradador de madeira atuando principalmente na degradação da lignina, deixando ao final um complexo de celulose, esbranquiçado em forma de faixas ou listras brancas, separadas por zonas de madeira sã, de cor normal, sendo por isso chamado de fungo causador de podridão branca (CASTRO E SILVA, 1996). Vários estudos vêm sendo realizados sobre o potencial de uso de compostos produzidos pelo P. sanguineus contra ação de bactérias patogênicas, vírus, para biorremediação de solo poluídos e produção de enzimas de interesse industrial (ZULFADHLY; MASHITAH; BHATIA, 2000). Uma nova fonte de -amilase foi identificada em Pycnoporus sanguineus,(putzke, 2002; SIAU, 1984; SJÖSTROM, 1981). Na realidade este fungo possui um pool enzimático que de acordo com Castro e Silva et al, (1993), estudando uma cepa amazônica deste fungo é composto por enzimas dos grupos das oxidativas e hidrolíticas como, por exemplo, a lignina-peroxidase, peroxidase, lacase- Mn-peroxidades, -glicosidase, celulase e xilanase 16

4 Por tanto, a presente pesquisa objetiva avaliar o potencial térmiticida do extrato bruto obtido a apartir do carpóforo de Pycnoporus sanguineus (L.F.) MURR, utilizando diferentes solventes e metodologias de extração dos compostos bioativos. 17

5 2 OBJETIVOS: 2.1 GERAL Avaliar o potencial do extrato bruto obtido a partir do carpóforo do fungo amazônico Pycnoporus sanguineus (L.F.) MURR em atividade térmiticida. 2.2 ESPECÍFICOS Verificar a ação dos extratos aquoso e etanólico em diferentes concentrações obtidos a partir do fungo Pycnoporus sanguineus em atividade termiticida. Avaliar os diferentes processos de extração dos compostos bioativos do carpóforo Avaliar a toxicidade através da metodologia de pulverização do extrato, uso de corpo de prova de material lignocelulósico e técnica de embebição dos extratos. Avaliar o potencial de repelência dos extratos através de construção de arenas de acordo com a metodologia proposta por Rosales, (2001). 18

6 3. REVISÃO DA LITERATURA 3.1 OS CUPINS Todos os Isoptera conhecidos são eussociais e diferem dos outros insetos sociais por apresentarem vários tipos morfológicos ou castas que apresentam divisão de trabalho e funções biológicas diferentes, são de ambos os sexos, diplóides e desenvolvimento hemimetábolo, onde os jovens também participam do trabalho colonial (LELIS et al.,2001;costa-leonardo, 2002; GALLO et al., 2002). A maioria das espécies de cupim não causa prejuízo ao homem, porque são importantes invertebrados dominantes nos ambientes terrestres tropicais, desde florestas úmidas até mesmo regiões áridas, degradando madeira, ciclando os nutrientes e participando da manutenção e recuperação do solo (LEE e WOOD, 1971; FONTES, 1998). Até o momento foram descritas espécies, ocorrendo aproximadamente 550 espécies na região neotropical, divididas entre Termitidae (381 spp), Kalotermitidae (130spp), Rhinotermitidae (29 spp), Serritermitidae (3 spp) e Termopsidae (1 spp). Os cupins são pragas representados por aproximadamente 80 espécies no mundo das quais cerca de 30espécies no Brasil, sendo 12 espécies agrícolas e 21 espécies urbanas (CONSTANTINO,2009). Os cupins ou térmitas são mais conhecidos por sua importância econômica como pragas de madeira e de outros materiais celulósicos. Também têm atraído a atenção de cientistas devido ao seu singular sistema social. Além de provocar considerável dano econômico em áreas urbanas e rurais, esses insetos também são importantes componentes da fauna de solo de regiões tropicais, exercendo papel essencial nos processos de decomposição e de ciclagem de nutrientes ( KRISHNA e WEESNER, 1970). Os Kalotermitidae são cupins considerados primitivos, que são capazes de viver em madeira seca sem contato com o solo e nunca constroem ninhos. As colônias de cupins de madeira seca, segundo MARER (1991), pertencem à família Kalotermitidae e infestam madeira seca, não-apodrecida, estrutural, móveis, ramos de árvores vivas em locais sombreados, árvores em pomares, postes e madeiras armazenadas. 19

7 Com base nessas áreas, reprodutores alados migram para novas construções e outras estruturas em dias ensolarados nos meses chuvosos e as colônias desses cupins geralmente são pequenas e são capazes de viver em pequenas peças de madeira que podem ser acidentalmente transportados pelo homem implicando na sua ampla área de distribuição, cupins pertencentes a esse grupo têm baixo requerimento de umidade e possuem grande tolerância às condições secas por períodos prolongados (MARER, 1991). A água pode ser obtida diretamente da madeira que, mesmo sendo em pequena quantidade é o suficiente graças a mecanismos especiais desenvolvidos para reduzir a perda de água (EDWARDS e MILL, 1986; WALLER e LA FAGE, 1986 e RUDOLPH et al., 1990). Os Rhinotermitidae são na maioria subterrâneos e se alimentam de madeira, e alguns deles são pragas importantes. Serritermitidae até recentemente continha uma única espécie, Serritermes serrifer, que ocorre apenas no Brasil. A família Termitidae é bastante diversificada, e compreende cerca de 85% das espécies de cupins conhecidas do Brasil. Dentre os Termitidae, alguns atuam em madeira, folhas, de húmus, e também cultivadores de fungo (que não ocorrem no Brasil), e muitos constroem ninhos grandes e complexos ( BERTI-FILHO; 1995 e Fontes;1998). Nos ecossistemas naturais, os cupins ocupam a posição de consumidores primários, pois atuam na trituração, decomposição, humificação e mineralização de uma grande variedade de material orgânico de origem celulósica. Exercem um papel fundamental no funcionamento de vários ecossistemas atuando na ciclagem de nutrientes e disseminação de bactérias e fungos, além de servir de alimento para uma grande variedade de animais, tais como formigas, aranhas, pássaros e mamíferos, contribuindo para a formação da base da cadeia alimentar (FONTES, 1998; COSTA-LEONARDO, 2002; UNEP/FAO/GLOBAL,2008). 20

8 3.2 CARACTERÍSTICAS BIOLÓGICAS DOS CUPINS Os cupins são insetos sociais polimórficos que constroem seus ninhos, chamados cupinzeiros ou termiteiros, para proteção da colônia, armazenamento de alimento e manutenção de condições ótimas para o desenvolvimento dos indivíduos. Todas as espécies de cupins vivem em colônias mais ou menos populosas (permanentes). As colônias são formadas por castas de indivíduos ápteros e alados. Além das formas jovens, existem duas categorias de formas adultas. A primeira é formada pelos reprodutores alados, machos e fêmeas, que abandonam o cupinzeiro para fundar novas colônias. A segunda categoria é composta por formas ápteras, de ambos os sexos, mas estéreis, são os operários e os soldados. São insetos mastigadores que se desenvolvem por paurometabolia. Os ovos são colocados soltos e as ninfas recémeclodidas são muito semelhantes nesse primeiro ínstar. A partir do segundo ínstar no entanto, elas diferem em dois tipos principais: ninfas de cabeça pequena, que darão origem aos indivíduos da casta reprodutora, e ninfas de cabeça grande, que darão origem aos indivíduos estéreis das castas das operárias e soldados. Os operários são de coloração branca ou amarelo pálida, geralmente desprovidas de olhos compostos e de ocelos. Constituem a maior parte da população do cupinzeiro e desempenham todas as funções da colônia, exceto a da procriação. Os soldados, usualmente cegos, são semelhantes aos operários dos quais diferem por terem a cabeça mais volumosa, de coloração marrom amarelada, e as mandíbulas mais desenvolvidas, embora não sirvam para mastigação. A função dos soldados é a defesa da colônia, colaborando também no trabalho dos operários. Em espécies primitivas encontram-se apenas as formas sexuadas e os soldados, sendo que as ninfas funcionam como operárias. ( BERTI-FILHO; 1995; e FONTES;1998). 21

9 3.3 AS COLÔNIAS E CARACTERÍSTICAS DA ANATOMIA EXTERNA DOS CUPINS As novas colônias iniciam-se, de modo geral, com os reprodutores alados que em revoada deixam a colônia-mãe, em igual número de machos e fêmeas (permanecem no termiteiro por até 3 meses antes da revoada). Na época da revoada os alados tornam-se fototropicos positivos e começam a abandonar o termiteiro por aberturas laterais feitas pelas operárias (COSTA-LEONARDO, 2002).. A época de revoada varia de acordo com a espécie e com a região onde situa-se a colônia-mãe. Geralmente ocorrem no crepúsculo de dias claros ou em dias chuvosos, nos meses de agosto a outubro. O alcance do vôo é pequeno, algumas dezenas de metros, porém maiores distâncias podem ser alcançadas com o auxílio do vento. O primeiro evento, após a aterrissagem dos alados, é a perda das asas, que se quebram ao longo de uma linha basal de menor resistência. A revoada de cupins difere de abelhas e formigas, pois os cupins alados, ao saírem do ninho, ainda são sexualmente imaturos. A primeira cópula só ocorre após os cupins terem perdido as asas e se estabelecido num local. Depois de perderem as asas os cupins tornam-se fototrópicos negativos e extremamente tigmotópicos, isto é, necessitam estar em contato com madeira ou o solo. Após esta fase, cada fêmea, com seu macho, formam o casal real, iniciando em seguida a escavação de uma galeria, que termina numa cavidade mais ampla, chamada câmara nupcial, onde após alguns dias ocorre a primeira cópula e a fêmea coloca os primeiros ovos. Cerca de um mês depois, aparecem as primeiras formas jovens, que serão criadas pelo casal real. Quando estas formas jovens começarem a se locomover, o casal real passa a ter apenas a função de procriar e o macho fecunda a fêmea periodicamente; o casal real permanece na câmara nupcial que é alargada pelos operários para acomodar o corpo da fêmea, cujo abdômen pode atingir até vezes o volume do resto do corpo. 22

10 A capacidade de postura da rainha é variável com a espécie e a idade da rainha. A taxa de oviposição pode variar de 12 ovos/dia nas espécies mais primitivas a nas espécies mais evoluídas. Quanto ao número de indivíduos na colônia, também depende da espécie, cerca de indivíduos nas espécies primitivas, podendo chegar a milhões nas espécies mais evoluídas (como as da família Termitidae). A anatomia externa dos cupins é descrita em três partes ( BERTI-FILHO;1995 e FONTES; 1998). Cabeça - livre, de forma e tamanho variáveis. Olhos compostos nas formas aladas (com dois ocelos), e atrofiados nas formas áptera. Antenas simples, monoliformes, contendo de 9 a 32 antenômeros, inseridas nos lados da cabeça, acima das bases das mandíbulas. Aparelho bucal mastigador, mandíbulas bem desenvolvidas (principalmente nos soldados). Tórax - um pouco achatado, pronoto com ou sem projeção anterior em forma de sela, protórax distinto e livre, mesotórax e metatórax unidos. Pernas ambulatóriais, tarsos pequenos de 4 artículos. Dois pares de asas membranosas, com nervações simples, nos indivíduos alados. Quando em repouso as asas ficam sobre o abdômen. Abdômen - volumoso, aderente ao tórax, com 10 segmentos, 1 par de cercos no último segmento e 1 par de estilhetes subanais no 9 o segmento, geralmente presente em todas as formas, exceto nas formas aladas. 3.4 O USO DE INSETICIDAS ORGANOCLORADOS NO CONTROLE DE TÉRMITAS Nos levantamentos realizados pelo IAA/ PLASULCAR, em 1985 foram gastos aproximadamente 150 toneladas de princípios ativos clorados para o controle de térmitas que totalizaram aproximadamente hectares e 83 ficam localizadas nos Estado de São Paulo (PIZZANO,1995) 23

11 Os produtos mais eficientes para o controle de térmitas têm como características permanecerem no solo por longo período de tempo, daí a excelente atividade dos produtos térmiticidas organoclorados. Depois da proibição da fabricação, comercialização e uso dos organoclorados houve um incentivo nas pesquisas voltado para o controle de térmitas. Posteriormente o desenvolvimento de novos produtos e desenvolvimentos de iscas artificiais vem gradativamente substituindo os mecanismos convencionais, aumentando a eficiência e praticidade do controle e diminuindo custos (MACEDO et al., 1995). Novos térmiticidas se destacam como é o caso o fipronil e o imidaclopride que tem se revelado mais seguros para o ambiente que os produtos primeiramente utilizados (BERTI FILHO,1995) A utilização de iscas atrativas no controle de térmitas Outra maneira para o controle de térmitas vem sendo bastante difundida que é a de uso de iscas atrativas com inseticidas e/ou entomopatógenos. O uso de iscas de ação lenta (slow acting) em armadilhas baseia-se em que uma colônia inteira de térmitas possa ser eliminada com somente uma parcela das galerias tratadas, devido o agente tóxico ser distribuído por toda a colônia graças a interação social dos térmitas (trofalaxia e lambimento) com os operários expostos por ocasião do forrageamento (SU et al., 1987) Outro aspecto positivo é a redução drástica na quantidade de inseticida utilizada isso em comparação com as aplicações de solo (SU E SCHEFFRAHN, 1991). Novos produtos térmiticidas cujos princípios ativos apresentam características diferentes dos organoclorados e bastante seguros ao meio ambiente, já encontramse a disposição no mercado brasileiro, estão devidamente registrados para seu emprego na agricultura, como por exemplo o isasofos (Miral) e o fipronil (Regent ) (MACEDO, 1995). 24

12 Como o método de iscas gasta-se o mínimo de inseticida e patógenos para eliminar uma grande parcela de insetos que são atraídos pelas iscas (ALVES e ALMEIDA,1995). Segundo estes autores em experimento de campo já se demonstrou que uma unidade de armadilha Termitrap R pode atrair até insetos, entre operários e soldados. 3.5 OS NASUTITERMES A grande maioria das espécies pertencentes ao gênero Nasutitermes (termitidae) é endêmica, principalmente na região neotropical. São principalmente xilófagos e forrageiam o solo à procura de madeira morta, preferencialmente seca e em decomposição. As espécies que ocorrem na América do Sul nidificam em qualquer tipo de formação vegetal,matas, florestas, caatingas, parques, etc. (Pizano et al. 1990) Muitas espécies constroem ninhos arbóreos, que estão sempre em comunicação com o solo, por meio de túneis que descem pelo tronco da árvore onde seu ninho foi construído (MELO FILHO;1996) Este comportamento demonstra evidências de evolução e especialização. Poucas são as espécies deste gênero que modificam somente no solo. Algumas espécies de Nasutitermes têm a tendência de construir ninhos vulgarmente denominados cabeça de nego em galhos de árvores, indicando ser este o principal local de formação da colônia, ainda que o casal real inicialmente nidifique no solo; mais tarde a colônia acaba transferindo-se para locais acima do nível do mesmo (FONTES ;1987) Segundo Araújo (1958) esta praga foi constatada pela primeira vez no Brasil em Portanto, trata-se de uma praga exótica. Atualmente, os grandes centros urbanos do país, principalmente aqueles localizados em áreas litorâneas, estão atualmente infestados por este cupim que ataca todo e qualquer tipo de material, seja de origem vegetal ou não! Todavia, pouco se tem feito para controlá-lo. 25

13 É necessário que as pessoas tomem conhecimento de que o cupim é como o câncer, depois de instalado, a cura não é impossível, todavia, é muito difícil e complicada. Os cupins nativos têm sido um problema para a agricultura e o reflorestamento. Entretanto, estão se adaptando às áreas urbanas, tanto é que cidades históricas como Ouro Preto, Vassouras, Bananal, etc., já estão altamente infestadas por Nasutitermes spp. Assim sendo, os cupins do gênero Nasutitermes devem ser encarados como mais uma preocupação para o homem, o qual tem contribuído demasiadamente para o aumento das populações de colônias de espécies pertencentes a esse gênero. Com a invasão do habitat natural desse cupim, o ser humano diminui a fonte natural de seu alimento. Nesse sentido, em se tratando do gênero Nasutitermes, o conceito de praga está equivocadamente adotado Nasutitermes tatarandae (Holmgren) (Termitidae) Estudos de laboratório e de campo para realizar levantamentos de insetos xilófagos e avaliar a durabilidade de espécies florestais da região Amazônica ao ataque de insetos têm sido realizados pela Coordenação de Pesquisas de Produtos Florestais do Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia, dentro do contexto da caracterização tecnológica, com vistas a um melhor aproveitamento da madeira (INPA/CPPF, 1991; 1993; Abreu & Bandeira, 1992; Jesus al., 1998; Abreu & Silva, 2000). 3.6 A MADEIRA A madeira é uma fonte de carbono, rica em calorias que apresenta a desvantagem de ser altamente insolúvel, devido ao alto grau de polimerização de seus constituintes. Em vista disso, para que sirvam de fonte de energia para microrganismos provocando manchas, emboloramentos, rachaduras e outras formas 26

14 de degradação, estes constituites devem ser quebrados em moléculas menores e solúveis em água (OLIVEIRA et al., 1986) Preservação da madeira A madeira pode ser deteriorada por agentes biológicos, por reações químicas e muitos outros agentes. No decorrer de milhões de anos de evolução, a natureza selecionou organismos que obtêm alimento direta ou indiretamente da madeira. Entre eles, se incluem bactérias, fungos, insetos, moluscos e crustáceos, que decompõem a madeira para utilizar os seus constituintes como fonte de energia. Os agentes físicos e químicos atuam em conjunto com os biológicos na madeira, acelerando o processo de deterioração. Destes agentes, os biológicos são os de maior importância, sendo os fungos os responsáveis pela maior proporção de danos causados à madeira Fatores que afetam a preservação de madeiras De acordo com Castro e Silva, (2002), preservar uma madeira é, em primeira análise, proporcionar o aumento da sua resistência frente aos organismos deterioradores, através de aplicação de preservantes químicos. A seleção e a aplicação adequada de um produto preservante é fundamental para conferir um aumento na durabilidade natural da madeira (HENDERSON et al., 1997; PERALTA et al., 2003; PERALTA et al., 2004; BRITO,2004). Um produto químico para ser utilizado como preservativo de madeira tem de satisfazer alguns requisitos: a) Eficiência: deve apresentar-se tóxico à gama mais ampla possível de organismos xilófagos. Deve ainda, para ser eficiente, permitir penetração profunda e uniforme na madeira. b) Segurança: deve apresentar toxidez baixa em relação a seres humanos e animais domésticos, além de não aumentar as características de combustibilidade inerentes à madeira. 27

15 c) Permanência ou resistência à lixiviação: deve ser insolúvel em água ou formar complexos insolúveis por meio de reação química com os componentes da parede celular da madeira. d) Custo: a madeira tem que apresentar competitividade com outros materiais, dessa formas os preservativos devem ser eficientes e de baixo custo Estudos que visam o controle de térmitas no Brasil e no mundo Estudos feitos por Green e colaboradores em 1997 avaliaram a diminuição do dano de térmitas subterrâneos a concentrações de precipitados de cálcio (naftaloilhidroxilaminas) em madeiras de Pinus sp., comparados à madeira tratada com organoclorados. Os cupins causaram menos danos na madeira de Pinus em concentração de 0,5% de precipitados de cálcio. Métodos de campo estudados por Groot e colaboradores (1998) avaliaram o declínio de estacas das madeiras de Pinus palustris, P. echinata, P. taeda e P. elliottii pelo ataque de fungos e térmitas. Estes últimos parecem preferir atacar inicialmente os tecidos jovens da madeira de todas as espécies testadas de Pinus, degradando os tecidos mais antigos após os primeiros serem consumidos. Mwalongo et al. (1999) em estudos na Tanzânia, avaliaram misturas de extratos naturais como o tanino e composto derivado da semente da castanha de caju, junto com pequenas quantidades de cobre. Os tratamentos foram suficientes para conferir às madeiras uma boa resistência aos térmitas. As madeiras testadas foram de Pinus ponderosa e de Populus tremuloide. Ambas, ao serem embebidas com os produtos, tornaram-se resistentes ao ataque de cupins. Os autores ressaltaram que os compostos não matam os cupins, mas são repelentes a eles. Logo, por utilizar apenas uma pequena porção de produtos cúpricos, esta mistura pode ser uma tecnologia ambientalmente correta, comparada aos produtos convencionais de controle dos cupins. Indrayan et al. (2000) avaliaram a resistência da madeira do pinheiro indonésio (Pinus merkusii) e da madeira de pinheiro americano (Pinus taeda), submetidas a dois tratamentos químicos (acetilação e tributiltin acrilato 28

16 polimerizado), ao ataque de Cryptotermes cynocephalus (cupim-da-madeira-seca). Como resultados obtidos, ambos os produtos foram eficientes no controle de térmitas com percentagens de mortalidade média de 97,1 % para as amostras dos ensaios com acetilação e de 100 % para as de tributiltin acrilato polimerizado, contra apenas 40,89% de mortalidade para as amostras testemunha (sem aplicação de nenhum produto). Barillari (2002) observou a durabilidade de madeira de Pinus (P. elliottii, P. caribaea, P. oocarpa e P. kesyia) submetidas a cinco diferentes tratamentos contra agentes biológicos durante 21 anos no estado de São Paulo - BR. A autora encontrou três famílias de cupins (Termitidae, Kalotermitidae e Rhinotermitidae) atuando na degradação das madeiras tratadas. Os Pinus sem tratamento tiveram uma vida média de menos de 1 ano. Os tratamentos com teores mais elevados de inseticida proporcionaram maior durabilidade à madeira dos Pinus. Não houve diferença de durabilidade referentes às espécies de pinheiros. Smith et al. (2003) compararam o ataque do cupim subterrâneo formosan termite (Coptotermes formosanus) à madeira de duas pináceas: Pinus sylvestris e Picea abies, tratadas por aplicação de óleos a alta temperatura e apenas alta temperatura. Os autores observaram que a madeira do Pinus foi a mais resistente ao ataque, porém apenas as amostras que receberam óleo e temperaturas elevadas tiveram alguma resistência ao cupim. Estudos conduzidos por Brenton e Creffield (2004) em duas regiões de campos na Austrália avaliaram a resistência da madeira de duas espécies de Pinus (Pinus radiata e Pinus elliottii) ambas tratadas com deltamethrin e permethrin, contra os danos do térmita Coptotermes acinaciformis, considerado uma das espécies economicamente mais danosas do país. Em ambas regiões estudadas, todas as amostras das madeiras apresentaram início de ataque do cupim; contudo, os tratamentos mostraram-se eficientes, tendo apenas 0,002 a 0,02 % de massa retirada pelos insetos. Barros et al. (2006) compararam, em laboratório, a mortalidade de cupins Cryptotermes brevis em madeira de Pinus sp. tratada com diferentes extratos de plantas cítricas. Com alguns extratos houve mortalidade total dos cupins, 29

17 demonstrando bom potencial como controlador alternativo de cupins-da-madeiraseca. Rech et al. (2006) observaram o efeito da repelência de concentrações variadas de dois extratos industriais de ceras cítricas: um derivado de limeira-ácida (Citrus latifolia) e o outro de laranjeira (Citrus sinensis), aplicados em cavacos de Pinus sp. expostos à C. brevis. Os resultados mostraram efeito preservante de todas concentrações do extrato da limeira-ácida, ao passo que todos os cavacos tratados com extrato da laranjeira foram consumidos pelos cupins durante a pesquisa. Logo, a cera de limeira-ácida apresenta potencial como repelente na resistência da madeira de Pinus ao ataque de Cryptotermes brevis. Stumpp et al. (2006) observaram o efeito de preservantes a base de mineralizantes e extratos de plantas em madeiras de Araucaria angustifolia, Pinus spp. e Eucalyptus grandis. Todos os produtos testados ocasionaram a mortalidade dos cupins nos três gêneros de madeira testados, sendo que alguns ensaios chegaram a 100 % de controle, como o óleo de mamona para o Pinus. Madeiras de Pinus banksiana e de Pinus sylvestris foram submetidas a amplitudes térmicas e também tratadas com um produto a base de cobre alcalino quaternário objetivando a resistência a um fungo decompositor e ao cupim subterrâneo Reticulitermes flavipes. As amostras de Pinus sylvestris submetidos apenas a amplitudes térmicas não resistiram com sucesso ao ataque de térmitas (Shi et. al. 2007). 3.7 OS FUNGOS Os fungos são organismos eucariotos que diferem das bactérias em tamanho, genoma e em muitas das suas funções celulares que são típicas de organismos complexos ao invés de simples células bacterianas. Apresentam crescimento celular vegetativo na forma de micélio seguido pela mudança da forma e estrutura (morfogênese) com a formação de espórios assexuados e sexuados. Para a maioria dos propósitos biotecnológicos fungos são crescimentos vegetativos associados com a divisão nuclear mitótica (CASTRO E SILVA et al., 2002). 30

18 Estão amplamente distribuídos na natureza, podendo ser encontrados na água, no ar atmosférico, no solo, sobre os animais e vegetais vivos parasitando-os, na matéria orgânica em decomposição, nos produtos alimentícios e produtos industriais. São os mais efetivos biodegradadores de materiais lignocelulósicos na natureza, mais especificamente os fungos causadores de decomposição (podridão) branca, pois degradam todos os componentes da madeira (celulose, hemicelulose e lignina). (CASTRO E SILVA e AGUIAR, 2001; OLIVEIRA et al., 1986). De acordo com Silveira, (1981) os fungos utilizam três principais estratégias na metabolização de compostos orgânicos:1-utilizam-se de reações de transformações; 2- realizam a conversão de substâncias químicas orgânicas para dióxido de carbono e 3- fazem a incorporação de químicos orgânicos como única fonte de carbono e energia para crescimento e formação de dióxido de carbono. Quase todos os fungos, quando cultivados em condições favoráveis e abundância de alimentos de fácil assimilação, crescem rapidamente formando abundante micélio, e quando as condições tendem a deter o crescimento por falta de alimentação eles formam os corpos frutíferos (SILVEIRA, 1981). Entre os fungos decompositores de madeira, existem aqueles que são únicos entre os eucariotes por desenvolverem métodos não específicos para a degradação da lignina (fungos de podridão-branca) encontrado na parede celular e em outras estruturas das células xilemáticas (KIRK et al., 1976). A degradação da lignina é essencialmente um processo metabólico secundário que não é necessário para o principal processo de crescimento (os fungos de podridão-branca não usam a lignina como fonte de carbono para o seu crescimento) Os Basidiomycotas São fungos de micélio septado, que se reproduzem por esporos exógenos (basioósporos) formados sobre uma hifa especial denominada basídia. Em muitas espécies, os basídios reúnem-se em corpos de frutificação com forma característica, o basidiocarpo (conhecido popularmente como cogumelo), onde os basídios constituem, juntamente com células estéreis, o himênio. Outras espécies não 31

19 produzem basidiocarpos. Em muitas delas, o basídio sempre se desenvolve a partir de um esporo que germina (SILVEIRA, 1981). Os Basidiomicetos são divididos em três subclasses (Holobasidiomycetidae, Phragmobasidiomycetidae e Teliomycetidae), de acordo com o tipo de basídio que produzem. Os Holobasidiomycetidae possuem basídios inteiros, isto é, nãoseptados, freqüentemente reunidos em basidiocarpos bem-desenvolvidos. Quase todos os fungos comestíveis conhecidos e também inúmeros fungos venenosos pertencem a essa subclasse. Entre os primeiros, podemos citar o tão apreciado champignon (Agaricus sp.) e o parasol (Macrolepiota procera), entre os venenosos as espécies de Amanita ou Inocybe patoullardi. Psilocybe mexicana produz os alucinógenos psilocibina e psilocina, usados em rituais religiosos indígenas. Além destes, as orelhas-de-pau, muitos fungos de micorriza e importantes fungos de madeira, muitos dos quais causam enormes prejuízos econômicos, figuram entre os Holobasidiomycetidae (SILVEIRA, 1981). A última subclasse dos Basidiomicetos, Teliomycetidae, caracteriza-se pela produção de esporos com parede espessada, os teliósporos, nos quais ocorre a cariogamia. As duas ordens que constituem essa subclasse são de enorme importância econômica, pois reúnem alguns dos principais patógenos das culturas agrícolas. São as temidas ferrugens - dentre as quais merecem menção os gêneros Puccinia, Gymnosporangium e Cronartium - e outros parasitas, entre eles o Ustilago maydis, que ataca o milho e forma galhas características negro-pulverulentas, razão pela qual recebe popularmente o nome de carvão de milho (SILVEIRA, 1981) Os Fungos e suas Aplicações Alguns fungos filamentosos têm em comum a habilidade de produzir enzimas úteis na bioconversão da madeira, como por exemplo, no pré-tratamento biológico de cavacos de madeira na indústria de papel e celulose, o que permite a economia de energia no processo mecânico e termomecânico de produção de pasta celulósica. Linhagens do fungo Chrysonilia sitophila, por exemplo, o qual exibe um alto teor de proteína e atividades celulolíticas e ligninolíticas, têm sido testadas em 32

20 estudos de produção de proteínas a partir de casca de arroz pré-tratadas e celulose pré-tratada fotoquimicamente (DURÁN et. al., 1987; DURÁN et al., 1988). Outro aspecto importante dos fungos filamentosos é o seu potencial para a produção de antibióticos, tais como cefalosporina (Cephalosporium acremonium), griseofulvina (Penicillum griseofulvis) e penicilinas (Aspergillus nidulans, Cephalosporium acremonium). Entre os fungos decompositores de madeira, existem aqueles que são únicos entre os eucariotes por desenvolverem métodos não específicos para a degradação da lignina (fungos de podridão-branca) encontrada na parede celular e em outras estruturas das células xilemáticas (KIRK et al., 1976). A degradação da lignina é essencialmente um processo metabólico secundário que não é necessário para o principal processo de crescimento (os fungos de podridão-branca não usam a lignina como fonte de carbono para o seu crescimento). A despeito do grande potencial micológico da Amazônia pouco ou quase nenhum estudo tem sido feito na área de enzimas com potencial industrial advindas de fungos amazônicos. Atualmente, a medida que olhamos o ambiente como um todo, temos a necessidade de compreender detalhe do funcionamento do bio componente, o que por sua vez, tem possibilitado o desenvolvimento de novas atividades industriais, referidas como biotecnologias ambientais ( VANDEVIVERE e VERSTRAETE, 2001) O Pycnoporus sanguineus O fungo Pycnoporus sanguineus, um orelha de pau, pertence à família Polyporaceae. Esta família provavelmente, mais que qualquer outra, é responsável pela maioria das podridões de madeira, contra o qual se ocupam os preservadores da madeira que empregam grande quantidade do dinheiro da indústria (ALEXOPOULOS, 1996). Quanto a sua morfologia, o corpo frutífero do P. Sanguineus (Figura 01) apresenta-se como carpóforo anual, semelhante à cortiça, mas bem delgado e tanto flexível, apresentando um himênio enrugado, com tubos ou poros em sua face 33

21 inferior, de aspecto vermelho-alaranjado, o que lhe dá o nome popular de laranjinha (MADHOSING, 1942; GILBERTSON & RYVARDEN, 1987). Figura 01: Corpo Frutífero de Pycnoporus sanguineus Foto: Andrey Azedo (2010) Segundo Nobles e Frew (1962), o crescimento deste fungo em cultura, é em média moderadamente rápido, as placas geralmente ficam completamente cobertas em três semanas, raramente requerendo quatro semanas. A zona de crescimento é plana levemente elevada e fofa como finos flocos de algodão, fina e transparente com algumas áreas brancas opacas. Na maioria das culturas a cor começa a aparecer após uma ou duas semanas, como grânulos ou poros vermelho-alaranjado suave a alaranjado forte. 34

22 4. MATERIAL E MÉTODOS 4.1. COLETA DOS BASIDIOCARPOS A linhagem utilizada neste estudo foi do fungo Pycnoporus sanguineus (L.F.) MURR, pertencente a classe basidiomycota. A coleta do material biológico foi durante o período de verão na Comunidade do Maranhão a aproximadamente 100 Km do Município de Parintins-AM ( Figura 02). Os carpóforos foram armazenados em sacos de papel e mantidos em temperatura de 30 0 C no Laboratório de Biologia do CESP-UEA. Figura 02: Mapa do município de Parintins, indicando o local da coleta dos basidiocarpos. Fonte: portalamazonia.globo.com 4.2 PREPARAÇÃO DOS EXTRATOS Foi utilizado dois extratores (solventes) para retirada dos componentes bioativos do carpóforo. Estes foram primeiramente selecionados e desidratados em temperatura de 40 0 C na estufa e posteriormente triturados em moinho de facas e passados em peneira de 60 mesh. Para cada 100 gramas do material biológico triturado foi acrescido 450 ml do solvente e utilizado extrator Soxhlet para extração à quente, no tempo médio de 8 horas, utilizando-se solventes com diferentes 35

23 gradientes de polaridade: etanol (C 2 H 6 O) e água (extrato aquoso) e em seqüência crescente de polaridade ( Figura 03) Figura 03: Extrator soxhlet contendo o carpóforo triturado. Foto: Andrey Azedo ( 2010 ) Também foi realizada extração ultra sônica nas proporções de 100g do material biológico triturado acrescido de 450 ml do solvente e levado ao ultra-som à temperatura de 50 ºC (não foi usada temperatura maior do que 68ºC, devido a movimentação da água, que quando entra em ebulição, diminui os efeitos do ultrasom.) e testado os seguintes tempos: 15 min, 25min e 40min de extração ( Figura 04). Figura 04: Extrator ultra-sônico contendo o carpóforo triturado. Foto: Andrey Azedo ( 2010 ) 36

24 Para o extrato a frio foi obedecido as mesmas proporções de material biológico e de solvente (100g para 450 ml) e deixado em repouso por um período de 72h em um recipiente âmbar para evitar as possíveis reações químicas com a luz (Figura 05). Figura 05: Extração á frio período de 72h. Foto: Andrey Azedo ( 2010 ) Os extratos obtidos foram concentrados em evaporador rotativo à pressão reduzida, observando-se o ponto de ebulição de cada solvente (etanol= 78,5 ºC, água= 100 ºC), Após a evaporação rotativa dos extratos, isto para todos os processos de extração dos princípios ativos do carpóforo (soxhlet; ultra-sônico e a frio) os rendimentos, foram pesados, etiquetados e armazenados em câmara refrigerada a temperatura de 4 ºC, até a realização dos bioensaios ( Figura 06). Figura 06: Evaporador rotativo contendo os extratos. Foto: AndreyAzedo (2010) 37

25 4.3 REALIZAÇÃO DOS BIOENSAIOS. Para a realização dos bioensaios utilizou-se cupins do gênero Nasutitermes tatarandae, coletados no perímetro urbano do município de Parintins,o delineamento experimental foi inteiramente casualizado. As avaliações das atividades dos extratos obtidos a partir de extratores e técnicas de extração diferentes dos basidiocarpos dos fungos, afim de verificar a toxicidade e repelência dos extratos frente a Nasutitermes tatarandae (Holmgren) (Termitidae), os bioensaio ocorreram em triplicatas e as concentrações dos extratos testadas foram de: 0,5%, 1%, e 2% (Figura 07). Figura 07: Preparo das concentrações dos extratos 0,5%,1% e 2%. Foto: Andrey Azedo (2010) Bioensaio 1 (Toxicidade dos extratos pulverizados) Térmitas: Os cupins foram coletados de ninhos e partes diversas de árvores de diferentes espécies, assim como de residências. Para evitar o estresse, os cupins foram coletados somente próximos ao período do bioensaio e armazenados em tubos de ensaio. 38

26 Ensaio: O ensaio foi realizado em placas de Petri descartáveis, 90x15mm, após acondicionar os cinquenta espécimes de térmitas por placa, foi pulverizado a uma distancia de 15cm, 5ml dos extratos nas triplicatas para observação da atividade dos extratos sendo que para todas as concentrações usadas, sempre utilizou-se uma placa controle pulverizando na mesma proporção de água destilada. Em seguida, as placas foram levadas para um termiteiro experimental medindo 1,5m de altura, 2m de comprimento e 1m de diâmetro e dividido em seis prateleiras e todo confeccionado em TNT para simular as condições reais de um termiteiro, onde foram mantidas em 28 0 C e umidade relativa em torno de 85-92%. Os bioensaios ocorreram sob condições de laboratório com temperaturas ambiente de 28 2ºC e umidade relativa em torno de 85-92%. Para avaliar o resultado da toxicidade dos extratos pulverizados foi realizada contagem em um intervalo de tempo de 4 horas. (Figura 08). oxicidade Figura 08: Termiteiro com o bioensaio 1 (toxicidade - pulverização) Foto: Andrey Azedo ( 2010 ) Bioensaio 2 (Toxicidade /corpo -de- prova) Foram utilizados amostras de alburno da madeira da espécie Hura crepitans (assacu), corpo-de-prova de 1x1x1cm que foram colocados em um Becker e 39

27 acrescido 300ml de água destilada para a retirada dos compostos fenólicos possivelmente presentes por um período de 48h. Após a retirada dos compostos o cada corpo-de-prova foi levado a estufa a temperatura de 40 0 C para secar por um período de 72h em seguida os cubos foram embebidos por 5 minutos nos diferentes extratos a serem avaliados nas concentrações de 0,5%, 1%, e 2%. Para cada placa foram acondicionados 50 spp dos térmitas a serem avaliados e quatro cubos do corpo-de-prova com produto colocados de forma eqüidistante para a avaliação das atividades dos extratos, também foram realizados dois grupos controle, o primeiro sem nada e no segundo com corpo-de-prova, sem o produto. Após a aplicação foram feitas leituras em intervalos de 12h, de exposição dos cupins ao extrato fúngico sem deixar de observar a quantidade de cupins vivos e mortos em cada ensaio/tratamento. Os bioensaios ocorreram sob condições de laboratório com temperaturas ambiente de 28 2ºC e umidade relativa em torno de 85-92%. Para manter o umidade relativa dentro do parâmetro do experimento (85-92%), utilizou-se a metodologia proposta por Rosales, (2001) onde era acrescentado diariamente 10 gotas de água em uma placa de petri 90x15 contendo chumaço de algodão (Figura 09). Figura 09: Bioensaio 2 toxicidade/ corpo-de-prova Fonte: Andrey Azedo ( 2010 ) 40

28 4.3.3 Bioensaio 3 (repelência ) Com base no resultado da toxicidade e nas observações do comportamento dos insetos sobreviventes, foram selecionados, para os testes de avaliação de repelência, os extratos que apresentaram melhor resultado. Os testes com chance de escolha foram realizados em arenas (Figura 10), constituídas por placas de Petri descartáveis de 90x15cm e conectadas por tubos plásticos de 3x16 medindo 5cm (ROSALES, 2001,adaptado) em todos os casos, os térmitas foram liberados no centro dos recipientes, contendo dois discos de papelão com extrato, em arranjos eqüidistantes, sendo dois deles tratados com os extratos e dois sem nada (testemunha). O numero de espécimes por arena foi 50 espécimes onde dois 48 eram operários e dois soldados, o período de avaliação foi 24 h. A pós o período de 24h foi realizado a contagem dos cupins que estavam presentes nas placas, tanto naquelas que continham o extrato a ser testado quanto ao controle. Figura 10: Arenas de testes de repelência em Nasutitermes tatarandae obtidos a partir do fungo Pycnoporus sanguineus. Foto: Andrey Azedo ( 2010 ) para extratos 41

29 O Índice de preferência (IP) foi calculado conforme a equação abaixo: I.P = % IP - %IT % IP + %IT onde: IP =nº de insetos presentes nos discos com produto IT = nº insetos presentes nos discos testemunhas. Os produtos compreendidos na variação de 10% do I.P. para o teste serão considerados como neutros. parâmetros. Para classificação do índice de Preferência utilizou-se os seguintes Repelentes : -1 < I.P. < -0,1 Neutro : - 0,1 < I.P. < + 0,1 Atraente: + 0,1 < I.P. < + 1 Os recipientes foram mantidos em condições controladas (27 2 ºC; 65-85% U.R.), e observado a entrada ou não nas áreas tratadas e se os túneis construídos para a passagem do orifício central para as laterais foram selados ou não. O delineamento experimental foi inteiramente casualizado. 42

30 5. RESULTADOS 5.1 Avaliação da toxicidade dos extratos. Foram utilizados duas metodologias para testar a toxicidade dos extratos nas diferentes concentrações. A primeira diretamente nos insetos conforme descrito no item (4.3.1) e a segunda utilizando a metodologia de corpo-de-prova da madeira Hura creptans, descrito no item ( 4.3.2). 5.2 Atividade térmiticida dos extratos aquoso e etanólico obtido a partir do extrator ultra-sônico, usando a técnica da borrifação. A toxicidade das diferentes concentrações dos extratos aquoso e etanólico obtidos a partir do método ultra-sônico e aplicados por borrifação é mostrado no (Gráfico 1). Dezesseis horas após a aplicação do extrato aquoso na concentração de 0,5% foi alcançado 100% de mortandade dos térmitas testados. Este índice de 100% de mortandade foi atingido na mesma concentração no extrato etanólico em um tempo menor, 8 horas após a borrifação. GRÁFICO 1: Percentual de mortandade dos térmitas submetidos aos extratos aquoso e etanólico obtido a partir do método de extração ultra-sônica,através da técica de borrifação. 43

31 Na concentração de 2% tanto para o extrato aquoso como o etanólico a mortandade de 100% ocorreu também após oito horas após a borrifação. Ressaltase que oito horas após aplicação do extrato na concentração de 1% do extrato aquoso foi alcançado um índice de 90% de mortandade dos indivíduos. De modo geral, tanto para o extrato aquoso como para o extrato etanólico existe uma relação positiva entre o aumento da concentração e o aumento do índice de mortandade. Em síntese a obtenção do extrato bruto contendo os princípios ativos do carpóforo através do método ultra-sônico mostrou que o extrato etanólico a 0,5% apresentou a melhor desempenho no que diz respeito ao menor intervalo de tempo para atingir o índice de 100% de mortandade dos indivíduos testados Atividade térmiticida dos extratos aquoso e etanólico obtido a partir do extrator soxhlet, usando a técnica da borrifação. No processo de extração dos compostos bioativos do carpóforo utilizando o extrato obtido pelo método de extração em soxhlet, o extrato aquoso na concentração 0,5% o índice de mortandade em 16h foi de aproximadamente 96%. Nesta mesma concentração, mas no extrato etanólico a mortandade foi de 100% em um menor intervalo de tempo de 12 horas (Gráfico 2). De modo geral, o extrato aquoso obtido pelo método de extração a quente mostrou maior mortandade, 16 horas após a borrifação em todas as concentrações testadas. Resultado diferente foi obtido no extrato aquoso obtido pelo método ultra-sônico onde o aumento da concentração eleva o percentual da mortandade em um menor intervalo de tempo. 44

32 Grafico 2: Percentual de mortandade dos térmitas submetidos aos extratos aquoso e etanólico obtido a partir do método de extração em soxhlet, através da técnica de borrifação. 5.4 Atividade térmiticida dos extratos aquoso e etanólico obtido a partir da extração a frio, usando a técnica da borrifação. Neste processo de extração a frio para a retirada dos compostos bioativos do carpóforo foi onde ocorreu o maior percentual de mortandade no menor intervalo de tempo (Grafico 3). Na concentração de 0,5% do extrato aquoso, por exemplo, após 12 horas da borrifação ocorreu 100% de mortandade. Para o menor concentração testada do extrato etanólico o percentual de mortandade no periodo de 12 horas após a borrifação foi de 100%, resultado similar á quele do processo á quente. Na maior concentração testada, já se observa um percentual de aproximadamente 98% de mortandade nas primeiras quatro horas após a borrifação, resultado similar áquele dos processos de extração á quente, alcançando 100% de mortandade. 45

33 Grafico 3:Percentual de mortandade dos térmitas submetidos aos extratos aquoso e etanólico obtido a partir do processo de extração a frio, através da técnica de borrifação. 5.5 Atividade dos extratos aquoso e etanólico, obtido a partir dos processos de extração ultra-sônico, soxhlet e a frio, usando a metodologia do corpo-deprova. Para esta metodologia utilizou-se dois controles: controle 1 sem a presença do corpo-de-prova ( os térmitas foram colocados em placas de Petri 90x15cm sem nenhuma fonte de alimento); controle 2: as placas de Petri continham corpo-deprova de madeira de Hura crepitans, mas que não estavam embebidos no extratos. Para o extrato aquoso de todos os processos de extração dos compostos bioativos (a frio, à quente e ultra-sônico) a mortandade alcançou 38% no quarto dia de experimento na concentração de 0,5%. Para o processo a frio foi alcançado o percentual de 100% de mortandade dos indivíduos no quinto dia (Gráfico 4). 46

34 Gráfico 4: Porcentagem de mortandade de térmitas em diferentes metodologias de extração na concentrações 0,5% Aq.Fr= Aquoso a frio. Aq.Sox.= Aquosos soxhlet. Aq. US= Aquoso ultra-sônico. Interessantemente na mesma concentração do extrato aquoso obtido pelo processo á quente no quinto dia do experimento também alcançou 100% de mortandade dos térmitas. Para o extrato aquoso obtido pelo processo ultra-sônico o percentual de mortandade somente alcançou o patamar de 98% no décimo dia do experimento. Situação diferente foi obtida para o extrato etanólico na concentração de 0,5% (gráfico 5), onde o maior percentual de mortandade de (100%) foi alcançado pelo extrato obtido através do processo a quente no oitavo dia do experimento. Grafico 5: Porcentagem de mortandade de térmitas em diferentes metodologias de extração na concentração 0,5% Eta.Fr= Etanólico a frio.eta.sox.= Etanólico soxhlet. Eta. US= Etanólico ultrasônico. 47