SEQUENCIAMENTO DE DNA MITOCONDRIAL PARA AVALIAÇÃO DE DIFERENÇAS GENÉTICAS EM OVINOS RESUMO

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1 SEQUENCIAMENTO DE DNA MITOCONDRIAL PARA AVALIAÇÃO DE DIFERENÇAS GENÉTICAS EM OVINOS Joyce Azambuja de Oliveira 1 ; Bruno do Amaral Crispim 2 ; Rodrigo Matheus Pereira 3 ; Leonardo de Oliveira Seno 4 ; Alexéia Barufatti Grisolia 5 1 Mestranda no Programa de Pós-Graduação em Biologia Geral-Bioprospecção/FCBA/UFGD 2 Mestrando no Programa de Pós-Graduação em Biologia Geral-Bioprospecção/FCBA/UFGD 3 Docente da Faculdade de Ciências Biológicas e Ambientais/FCBA/UFGD 4 Co-orientador, Docente da Faculdade de Ciências Agrárias/FCA/UFGD 5 Orientadora, Docente da Faculdade de Ciências Biológicas e Ambientais/FCBA/UFGD RESUMO Devido à herança materna do DNA mitocondrial estar altamente conservada em muitos dos seus genes, estes muitas vezes podem ser usados para resolver as relações que medem períodos de tempo muito longos e são relevantes quando se considera questões de filogenética e importância taxonômica. Em ovinos o uso de marcadores mitocondriais veio para solucionar grandes problemas relacionados à origem de muitas raças naturalizadas de ocorrência mundial. O objetivo deste trabalho foi avaliar a eficácia da técnica de sequenciamento de Sanger para mostrar a variação do DNA mitocondrial entre 4 raças de ovinos. O sangue de 28 animais das raças Pantaneira (n=14), Bergamácia (n=4), Dorper (n=5) e Ile de France (n=5) foi utilizado para realizar extração de DNA, amplificação da região do citocromo b, purificação e sequenciamento. As sequências foram importadas para o programa BioEdit versão e alinhadas pelo método de alinhamento múltiplo Clustal W. A árvore filogenética, os cálculos de diversidade nucleotídica, diversidade dentro das subpopulações (as 4 raças diferentes), na população inteira (os 28 animais) e interpopulacional e o número de haplótipos foram obtidos com o programa MEGA Foi possível sequenciar aproximadamente pares de base, representando em torno de 86% da região do citocromo b. Foram encontrados 71 haplótipos e as diversidades médias obtidas mostram a possibilidade das 4 raças serem intimamente relacionadas entre si. Conclui-se que a técnica de seqüenciamento de Sanger foi eficaz para seqüenciar a região do citocromo b e demonstrar a

2 variação do DNA mitocondrial em ovinos e proporcionou a geração de dados genotípicos para a realização de estudos futuros de origem e evolução dos animais. Palavras-chave: Citocromo b Sequenciamento de Sanger Ovis aries INTRODUÇÃO Pequenos ruminantes domesticados (caprinos e ovinos) foram introduzidos no Brasil com a colonização portuguesa no século XVI. Consequentemente, a maior contribuição genética, ainda hoje, é de raças originárias da Península Ibérica (MARIANTE et al., 1999). Outra importante fonte genética de pequenos ruminantes no Brasil é de animais africanos trazidos em navios negreiros. Além de portugueses, espanhóis e africanos, o Brasil recebeu vários outros povos que trouxeram várias de suas raças e sua tecnologia de manejo reprodutivo (PORTER, 1996; ANJOS & FARIAS, 2005). Após algumas modificações adaptativas sofridas nas várias colônias ao longo do país, estes animais trazidos pelos colonizadores passaram a ser considerados locais, sendo denominadas raças crioulas, localmente adaptadas ou naturalizadas. Tais grupos genéticos apresentam alto grau de adaptação ao meio no qual se desenvolveram, conferindo-lhes características específicas e vantajosas em relação a raças comerciais (MARIANTE et al., 1999). No Sul do Brasil, a raça Crioula desenvolveu-se em um ambiente de temperaturas extremas ao longo do ano fornecendo alimento e lã aos habitantes da região (MARIANTE & CAVALCANTE, 2006). Acredita-se que esses habitantes com as migrações levaram consigo seus animais de produção e passaram a ocupar o Pantanal Brasileiro junto com os ovinos Crioulos. Atualmente, nesta região, existem ovinos fenotipicamente assemelhados aos ovinos Crioulos, mas que já apresentam características próprias, o grupo genético ovino Pantaneiro (FRAZILIO, 2005; SANTOS, 2005). Vários estudos demonstram que os ovinos Pantaneiros caracterizam-se, diferentemente das raças comerciais, por alta resistência parasitária e boa adaptação aos ambientes alagados próprios do Pantanal (FRAZILIO, 2005; SANTOS, 2005) e tolerância ao calor. A compreensão e a conservação desse grupo genético podem ajudar na introgressão dessas características em rebanhos comerciais e aumentar a produtividade da ovinocultura comercial. Outra vantagem seria a possibilidade de fornecer dividendos à população local que mantém e aproveita esse recurso genético típico de regiões alagadas como o Pantanal Brasileiro.

3 DNA mitocondrial Marcadores moleculares baseados em DNA mitocondrial possuem herança materna, ao contrário da herança biparental que ocorre com os marcadores nucleares. De acordo com Olson et al. (2009) por à herança materna estar altamente conservada em muitos dos genes localizados no genoma mitocondrial, estes marcadores, muitas vezes podem ser usados para resolver as relações que medem períodos de tempo muito longos e são relevantes quando se considera questões de filogenética e importância taxonômica. O marcador mitocondrial mais extensivamente utilizado nas filogenias moleculares, principalmente nas que avaliam as relações entre hierarquias taxonômicas superiores, é o gene do citocromo b. Este gene é um dos treze codificadores de proteína do genoma mitocondrial (IRWIN et al., 1991), sendo considerado o marcador que pode prover a melhor resolução em estudos de taxa de mamíferos com tempos de divergência entre aproximadamente 4 a 44 milhões de anos (IRWIN et al., 1991; SMITH & PATTON, 1991). Em ovinos o uso de marcadores mitocondriais veio para solucionar grandes problemas relacionados à origem de muitas raças naturalizadas de ocorrência mundial, onde o alto grau de cruzamentos indiscriminados muitas vezes impossibilita a caracterização das mesmas por marcadores nucleares. Sequenciamento O método mais utilizado para identificação das bases do DNA é o de terminação da cadeia, também conhecido como sequenciamento de Sanger (SANGER et al., 1977). Essa técnica é baseada na capacidade da enzima DNA Polimerase estender a cadeia polinucleotídica a partir de um iniciador ancorado por complementaridade em uma das fitas (fita molde). Como as fitas de DNA são complementares (A:T e C:G), a partir do molde, a enzima vai adicionando o nucleotídeo complementar necessitando do grupo hidroxila livre (OH) na posição 3, componente do desoxinucleotídeo anterior (dntp) (CARRARO & KITAJIMA, 2002). Para identificar a seqüência de uma molécula de DNA, é necessário adicionar a essa reação altas concentrações de nucleotídeos que interrompam a polimerização da cadeia, que são denominados didesoxinucleotídeo (ddntp) que são nucleotídeos em que a pentose perdeu o grupo hidroxila da posição 3 (OH) necessário à continuidade da polimerização da cadeia. Durante os ciclos de polimerização, os ddntps vão sendo incorporados aleatoriamente, produzindo fragmentos de tamanhos diferentes. A mistura de fragmentos é submetida a uma eletroforese para separação por tamanho. Os diferentes ddntps apresentam marcas passíveis

4 de reconhecimento. Em seqüenciadores automáticos, os diferentes ddntps são ligados a moléculas fluorescentes denominadas cromóforos, que quando estimuladas por raio laser, emitem diferentes comprimentos de ondas, sendo reconhecidas por programas apropriados e convertidas a determinada base nitrogenada (A, T, G ou C) (CARRARO & KITAJIMA, 2002) (Figura 1). Figura 1. Esquema da reação de sequenciamento de Sanger (Fonte: Com a automatização da técnica de seqüenciamento e com o advento da Bioinformática (disciplina que funde a biologia com a informática), foi possível automatizar a fase de geração de seqüências, produzindo-as em larga escala e digitalizando-as para o computador (CARRARO & KITAJIMA, 2002). O objetivo deste trabalho foi avaliar a eficácia da técnica de sequenciamento de Sanger para mostrar a variação do DNA mitocondrial, utilizando ovinos da raça Pantaneira e das raças Bergamácia, Dorper e Ile de France por serem produzidas comercialmente no estado de Mato Grosso do Sul. MATERIAL E MÉTODOS Animais Um total de 28 ovelhas de 4 raças diferentes foram utilizadas sendo: Pantaneira (n=8) pertencentes aos rebanhos da Fazenda Experimental da Universidade Federal da Grande

5 Dourados (UFGD) e Pantaneira (n=6) de Corumbá; Bergamácia (n=4), Dorper (n=5) e Ile de France (n=5) provenientes de rebanhos credenciados a Associação dos Criadores de Ovinos da Grande Dourados (Ascogran). Coleta de sangue As amostras de sangue periférico foram coletadas da veia jugular de cada animal e colocadas em tubos para coleta de sangue a vácuo (Vaccutainer ) de 4,5 ml, contendo K3 EDTA. As amostras foram mantidas sob refrigeração até a realização da extração do DNA. Extração de DNA A extração de DNA foi realizada no Laboratório de Biotecnologia aplicada à Produção Animal, Faculdade de Ciências Agrárias da Universidade Federal da Grande Dourados (FCA/UFGD), utilizando protocolo de extração de DNA de sangue total segundo descrito abaixo: Foram aliquotados 300 L de sangue bovino em um microtubo de polipropileno de 2 ml e acrescentados 3 L de proteinase K (20 mg/ml) e 500 L de SDS (Dodecil Sulfato de Sódio) a 20%, homogeneizados em vortex e incubados a 60 C em banho-maria por 1 hora e 30 minutos. Após realizada a incubação, foi adicionado 800 L de clorofórmio nos microtubos e agitados vigorosamente em vortex até completa homogeneização; em seguida, foi acrescentado 350 L de solução de precipitação protéica e homogeneizados novamente em vortex. Os microtubos com a solução foram centrifugados a rpm por 10 minutos para que a fase aquosa pudesse ser retirada e transferida para outro microtubo. Foi adicionado 1 ml de etanol 100% gelado e logo em seguida, homogeneizado por inversão até a formação de precipitado (entre 30 e 60 segundos). Posteriormente, o material foi centrifugado a rpm por 5 minutos e após centrifugação desprezou-se o sobrenadante e acrescentou-se 1 ml de etanol 70%, em seguida, centrifugou-se novamente por dois minutos, e desprezou-se o sobrenadante. Após esta etapa o microtubo foi invertido para a secagem do sedimento (10 a 15 minutos), logo após, adicionou-se 100 L de TE ph 8,7 com RNAse, homogeneizou-se lentamente (1 L de RNAse para cada 1000 L de TE) e por último o material foi incubado a 37 C por 1 hora e posteriormente, armazenados em freezer a -20 ºC. A qualidade do DNA foi observada por meio de eletroforese em gel de agarose corado com brometo de etídeo. Além disso, dados referentes à quantidade de DNA (ng/µl) e qualidade (razão de 260/280 nm) foram obtidos por meio de espectrofotometria com o aparelho NanoPhotometer Pearl (Implen).

6 Amplificação da região do citocromo b As amostras de DNA foram utilizadas para amplificação da região do citocromo b do DNA mitocondrial. Os oligonucleotídeos iniciadores (primers, em inglês) foram desenhados a partir da seqüência publicada de ovinos, Ovis aries [AF010406] (HIENDLEDER et al., 1998) sendo: CYTB_F Senso (5 -CCCCACAAAACCTATCACAAA-3) e CYTB_R Antisenso (5 - AGGGAGGTTGGTTGTTCTCC-3 ). Também foram utilizados primers internos para compensar a perda de nucleotídeos que ocorre no sequenciamento: CYTB_IN_F (5 -ACCTCCTTTCAGCAATTCCA-3 ) e CYTB_IN_R (5 - CCTGTTTCGTGGAGGAAGAG-3 ). A PCR foi realizada em um volume final de 25 µl e a mistura para amplificação constituiu-se de: 7,3 µl de água ultra-pura, 1,5 µl de cada primer (10 pmoles), 12,5 µl de PCR Master Mix (Fermentas ), 2,0 µl de DNA (10-20ng) e 0,2 µl de Taq DNA polimerase (Fermentas ). As reações de PCR foram realizadas no termociclador BIORAD modelo MyCycler TM thermal cycler. Purificação As amostras amplificadas foram purificadas seguindo o protocolo fenol/clorofórmio descrito a seguir: colocou-se 12 µl de produto de PCR amplificado e 12 µl de uma mistura de fenol/clorofórmio (1:1). A solução foi agitada por 1 min em vortex e centrifugada à temperatura ambiente por 3 min a rpm. A fase aquosa foi recuperada e a ela adicionou-se 250 µl de clorofórmio. Agitou-se novamente por 1 min em vortex e centrifugou-se a temperatura ambiente por 3 min a rpm. Recuperou-se a fase aquosa e adicionou-se 1/10 do volume (1,2 µl) de acetato de sódio ph 5,2 a 3M e 2,5 vezes do volume (30 µl) de etanol 95%. A solução foi mantida a -20ºC overnight e então centrifugada a 4ºC por 15 min a rpm. O sobrenadante foi descartado e adicionou-se 1 ml de etanol 70% e centrifugou-se a temperatura ambiente por 15 min a rpm. O DNA precipitado foi seco à temperatura ambiente e ressuspendido em 30 µl de TE 10:1 (10mM Tris-HCl ph 8,0, 1mM EDTA ph 8,0). Sequenciamento O sequenciamento foi realizado no Centro de Recursos Biológicos e Biologia Genômica (CREBIO) da Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho em Jaboticabal, SP. As placas de sequenciamento foram preparadas adicionando-se uma quantidade de produto amplificado e de água ultra pura de modo a se ter um volume final de

7 aproximadamente 10 ng/µl. Cada amostra foi adicionada em dois poços da placa sendo que em um poço foi adicionado o primer forward e no outro o primer reverse. Em seguida, adicionou-se 3 µl de tampão, 1 µl dos primers (forward ou reverse, sendo 10 pmoles de cada) e 1 µl de Big Dye Terminator Cycle Sequencing (Life Technologies). Essa reação foi levada ao termociclador por 4 horas com o seguinte programa: um ciclo de 96ºC por 1 min, 39 ciclos de 96ºC por 15 seg, 60ºC por 15 seg e 60ºC por 4 min. Em seguida, foi feito o protocolo de lavagem das reações adicionando-se 80 µl de isopropanol 75% e selou-se com selo de alumínio (Figura 2a). As placas foram deixadas por 15 min dentro da centrífuga para decantação e depois centrifugou-se por 30 min a 20ºC, rpm. Descartou-se o sobrenadante e adicionou-se 200 µl de etanol 70% e selou-se com selo de alumínio novamente e foi centrifugado por 10 min a 20ºC, rpm. Descartou-se o sobrenadante e repetiu-se esses mesmos passos mais uma vez. Foi feito spin invertido onde se coloca um pedaço de papel higiênico embaixo da placa invertida na centrífuga e realiza-se o spin por 20 seg na aceleração e desaceleração 1 (Figura 2b). (a) (b) Figura 2. Placa de seqüenciamento com selo de alumínio (a) e spin invertido (b). As placas foram colocadas na estuda para secar por 5 min e depois seladas para o sequenciamento. Adicionou-se 10 µl de formamida e levou-se ao termociclador por 5 min no mesmo programa citado acima. As placas foram colocadas no sequenciador automático ABI 3730 XL (Applied Biosystems, Foster City, California (CA)) onde o sequenciamento durou em torno de 2 horas e 30 min (Figura 3a e 3b).

8 (a) (b) Figura 3. Placas dentro do sequenciador (a) e sequenciador ABI 3730 XL (b). Análise dos dados Como o sequenciamento foi realizado das sequências forward e reverse de cada animal separadamente, foi necessário juntá-las e formar os contigs para poder analisar a sequência completa. Isso foi feito com o programa de montagem de sequências CAP3 (HUANG & MADAN, 1999). As sequências foram importadas para o programa BioEdit versão e alinhadas pelo método de alinhamento múltiplo Clustal W. A árvore filogenética foi construída no programa MEGA 5.10 pelo método de Tamura e Nei, desenvolvido especialmente para se trabalhar com DNA mitocondrial (TAMURA & NEI, 1993) (Figura 7). Os cálculos de diversidade nucleotídica, diversidade dentro das subpopulações (as 4 raças diferentes), na população inteira (os 28 animais) e interpopulacional também foram obtidos com o programa MEGA 5.10, pelo método de Jukes- Cantor (JUKES & CANTOR, 1969) (Tabela 1). Pelo mesmo programa também foi observado o número de haplótipos encontrados. RESULTADOS E DISCUSSÃO Os primers utilizados no trabalho delimitam pb na região do citocromo b. O seqüenciamento resultou sequencias de aproximadamente pb em todas as amostras, ou seja, conseguiu seqüenciar em torno de 86% da região (Figura 4).

9 Figura 4. Cromatograma de uma sequência importada no BioEdit exemplificando os picos de cores diferentes para cada base. Importando as sequências no programa BioEdit foi possível analisar detalhadamente cada uma e realizar comparações entre os diferentes contigs das diferentes raças e, em seguida, foi feito o alinhamento das mesmas (Figuras 5 e 6). Figura 5. As 28 sequências importadas no programa BioEdit.

10 Figura 6. Sequências alinhadas no programa BioEdit. Através da árvore filogenética obtida no programa MEGA 5.10 é possível observar a homogeneidade entre as sequências das diferentes raças (Figura 7). Figura 7. Árvore filogenética das 28 sequências gerada pelo programa MEGA 5.10.

11 A diversidade nucleotídica média para a população foi de 26,6% de timina (T), 27,9% de citosina (C), 32,8% de adenina (A) e 12,7% de guanina (G). Foram encontrados 71 haplótipos dentre as 28 sequências analisadas. Tabela 1. Diversidade média dentro das subpopulações, na população inteira e interpopulacional calculadas com o programa MEGA Diversidade Média Erro Padrão Dentro das subpopulações 0,005 0,001 População inteira 0,007 0,001 Interpopulacional 0,001 0,000 Esses resultados mostram a possibilidade das 4 raças estudadas serem intimamente relacionadas entre si, visto que a diversidade entre as 4 foi pequena. Essa falta de diversidade pode ser devido ao fato de o DNA mitocondrial ser altamente conservado, então os animais de diferentes raças (porém da mesma espécie) apresentariam uma grande semelhança genética. Assim, pode-se traçar um histórico da origem e evolução das mesmas e, posteriormente, fazer estudo comparativo com outras raças de outros países utilizando sequências que estão depositadas em bancos de dados. CONCLUSÕES Conclui-se que a técnica de seqüenciamento de Sanger foi eficaz para sequenciar a região do citocromo b e mostrar a variação do DNA mitocondrial em ovinos de 4 raças diferentes (Pantaneira, Bergamácia, Dorper e Ile de France) e proporcionou dados para se realizar estudos futuros de origem e evolução dos animais. AGRADECIMENTOS À Fundação de Apoio ao Desenvolvimento do Ensino, Ciência e Tecnologia do Estado de Mato Grosso do Sul (Fundect), ao Centro de Recursos Biológicos e Biologia Genômica (CREBIO) da Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho em Jaboticabal, SP e à equipe do Laboratório de Biotecnologia Aplicada à Produção Animal da FCA/UFGD. REFERÊNCIAS ANJOS, G.C.B.; FARIAS, A.S.D. O fortalecimento da cadeia da caprinocultura como instrumento de desenvolvimento e geração de renda: Um estudo de caso no município de

12 Monteiro/PB. XXV ENEGEP - Encontro Nacional de Engenharia de Produção. Porto Alegre, CARRARO, D.M.; KITAJIMA, J.P. Sequenciamento e Bioinformática de Genomas Bacterianos. Biotecnologia Cienc. Desenvolv. 28:16-20, FRAZILIO, F.O. Perfil das proteínas séricas e da contagem leucocitária em ovinos com infecção helmíntica naturalmente adquirida f. Dissertação (Mestrado em Produção e Gestão Agroindustrial) Universidade para o desenvolvimento do estado e da região do Pantanal, HIENDLEDER, S. A low rate of replacement substitutions in two major Ovis aries mitochondrial genomes. Anim. Genet. 29: , HUANG, X; MADAN, A. CAP3: A DNA Sequence Assembly Program. Genome Res. 9: , IRWIN, D.M.; KOCHER, T.T. & WILSON, A.C. Evolution os the cytochrome b gene in mammals. J. Mol. Evol. 32: , JUKES, T.H.; CANTOR, C.R. Evolution of protein molecules. New York: Academic Press , MARIANTE, A. da S.; ALBUQUERQUE, M.; EGITO, A.A.; McMANUS, C. Advances in the Brazilian Animal Genetic Resources Conservation Programme. AGRI, 25: , MARIANTE, A.da S.; CAVALCANTE, N. Animais do descobrimento: Raças domésticas da história do Brasil. Embrapa Sede, Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia Brasília, 232 p., OLSON, Z. H.; WHITTAKER, D. G.; RHODES JR, O. E. The use of molecular markers in wild sheep research in North America: a review. Proceeding of the Northern Wild Sheep and Goat Council Biennial Symposium 16: , PORTER, V. Goats of the World. Farming Press, SANGER, F.; NICKLEN, S.; COULSON, A. R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74(12):5463-7, SANTOS, S.A. Descrição do manejo geral de cavalos Pantaneiros na região do Pantanal. Embrapa Pantanal, SMITH, M.F. & PATTON, J.L. Variation in mitochondrial cytochrome b sequence in natural populations do South American akodontine rodents (Muridae: Sigmodontinae). Mol. Biol. Evol. 8: , TAMURA, K.; NEI, M. Estimation of the number of nucleotide substitutions in the control region of mitochondrial DNA in humans and chimpanzees. Mol. Biol. Evol. 10 (3): , 1993.

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