Programa de Pós-Graduação em Genética e Melhoramento de Plantas

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1 Programa de Pós-Graduação em Genética e Melhoramento de Plantas LGN SEMINÁRIOS EM GENÉTICA E MELHORAMENTO DE PLANTAS BIOTECNOLOGIA FLORESTAL APLICAÇÕES E PERSPECTIVAS Pós-graduanda: Juliana Erika de Carvalho Teixeira Orientador: Prof. Dr. Luís Eduardo Aranha Camargo Departamento de Genética Avenida Pádua Dias, 11 - Caixa Postal 83, CEP: Piracicaba - São Paulo - Brasil Telefone: (0xx19) / 4125 / Fax: (0xx19)

2 SUMÁRIO 1. Introdução 2. Propagação in vitro - Micropropagação - Biorreatores e Propagação Fotoautotrófica in vitro 3. Marcadores Moleculares - Aplicações Operacionais - SAM 4. Transgenia 5. Genômica

3 INTRODUÇÃO Importância do Setor Florestal OS DEZ PAÍSES COM MAIS PLANTAÇÕES FLORESTAIS Fonte: FAO, 2007

4 INTRODUÇÃO - Importância do Setor Florestal PLANTAÇÕES DE EUCALIPTO PRINCIPAIS PAÍSES

5 INTRODUÇÃO - Importância do Setor Florestal MAIORES EXPORTADORES DE PRODUTOS FLORESTAIS (2000) Fonte:

6 INTRODUÇÃO - Importância do Setor Florestal MG:1,6 milhões ha SP:700 mil ha

7 INTRODUÇÃO - Importância do Setor Florestal CARACTERIZAÇÃO DA ATIVIDADE FLORESTAL BRASILEIRA DADOS SÓCIO-ECONÔMICOS 2006 eucaliptocultura apresenta uma significativa e crescente participação no desenvolvimento socio-econômico nacional PIB Florestal = US$ 21 bilhões (4% do PIB Nacional) Celulose e papel: US$ 7,5 bilhões (BR 7 maior produtor e 11 fabricantes papel) Siderurgia a carvão vegetal: US$ 4,2 bilhões Madeira e móveis: US$ 9,3 bilhões Exportações = US$ 5,4 bilhões (10% do total) Impostos Recolhidos = US$ 2 bilhões Consumo de madeira (Nativas + Plantadas) = 300 milhões m 3 /ano Empregos Diretos + Indiretos = 2 milhões (total)

8 Nossa indústria de base florestal é muito competitiva! INTRODUÇÃO - Importância do Setor Florestal Florestas altamente eficientes, produtivas e competitivas, plantadas com base em um adequado nível de sustentabilidade; Madeira de baixo custo; Qualidade e homogeneidade da madeira; Fábricas de tecnologia estado-da-arte e de classe mundial; Recursos humanos qualificados; Excelente gestão da qualidade de produto, meio ambiente e da responsabilidade social corporativa (ISO 9000, ISO 14000, OHSAS 18000, SA, etc..) Sustentabilidade ambiental e certificação florestal do manejo e da cadeia de custódia; Intenso desenvolvimento científico e tecnológico através de muitas pesquisas; Contínuo crescimento do setor industrial, com novas adições de capacidade e modernizações das fábricas existentes; Gestão eficaz, eficiente e competitiva; Competição a nível mundial nos mais exigentes mercados. Fonte: Foelkel, 2007.

9 Plantio Clonal: um dos responsáveis pelo sucesso! INTRODUÇÃO - Importância do Setor Florestal Apagão florestal: BR - Déficit de madeira: 225 milhões de m3/ano

10 INTRODUÇÃO Biotecnologia Florestal Biotecnologia tecnologia que ajudará a superar este desafio!... compreensão dos processos moleculares fundamentais nas árvores, enquanto organismos individuais, bem como sua domesticação e utilização comercial... Genética Quantitativa Silvicultura Genética Molecular Biotecnologia Florestal Melhoramento Genética Populações Propagação Clonal

11 INTRODUÇÃO Biotecnologia Florestal Biotecnologia Florestal: Propagação in vitro Marcadores Moleculares Transgenia Genômica

12 PROPAGAÇÃO IN VITRO Primeiros trabalhos de micropropagação no BR Déc. 50 e laboratórios: Micropropagação e enxertia in vitro: maior interesse científico e econômico Na área florestal: micropropagação é a técnica mais difundida e com aplicações comprovadas Aplicações da Propagação in vitro na área florestal: conservação de germoplasma in vitro multiplicação de clones superiores aceleração do programa de melhoramento limpeza clonal base para outras técnicas biotecnológicas transformação genética

13 PROPAGAÇÃO IN VITRO - Aplicações Fases Micropropagação: Seleção do explante e obtenção de culturas livres de contaminantes - Inoculação Multiplicação e Alongamento dos propágulos vegetativos Enraizamento (in vitro ou ex vitro) Aclimatização na condição ex vitro das plantas obtidas in vitro

14 Proliferação de Gemas Axilares PROPAGAÇÃO IN VITRO Aplicações Via Organogênese Seleção dos Explantes Enraizamento e Aclimatização Fonte: Xavier, et al., 2007 Fonte: Xavier, et al., 2007 Via Embriogenêse Somática Fonte: Xavier, et al., 2007

15 PROPAGAÇÃO IN VITRO - Aplicações Eucalipto: Micropropagação por proliferação de gemas axilares Enraizamento ex vitro Produção de mudas para formação de mini-jardins clonais Micropropagação Enraizamento Mini-jardim clonal

16 PROPAGAÇÃO IN VITRO - Perspectivas Micropropagação tradicional: meio semi-sólido, grande número de pequenos recipientes e muita mão-de-obra, várias câmaras de fluxo laminar, grandes autoclaves e espaço de cultivo Propagação em larga escala mediante propagação in vitro, em quantidade e qualidade Inovações têm sido propostas: Uso de recipientes de cultivo alternativo Equipamentos para produção de mudas em larga escala Biorreatores Automação das operações dos sistemas de cultura de tecidos Manipulação do ambiente in vitro com a propagação fotoautotrófica

17 PROPAGAÇÃO IN VITRO - Perspectivas BIORREATORES: Tecnologia mais proeminente na redução de custos de mão-de-obra, permitindo multiplicação de plantas em larga escala Por usar meio líquido, permite maior produtividade e eficiência da propagação Primeiro relato: 1981 em Begonia 2005: surgiram os primeiros biorreatores para micropropagação comercial em espécies arbóreas

18 PROPAGAÇÃO IN VITRO - Perspectivas Tipos de Biorreatores, classificados pelo tipo de agitação e pela construção do frasco Fonte: Penchel, et al., 2007

19 PROPAGAÇÃO IN VITRO - Perspectivas Princípio de funcionamento: - Compartimento superior: suporte e flutuação do material vegetal - Compartimento inferior: estocagem de meio de cultura - Conjunto de válvulas: controla a transferência do meio de cultura RITA 3R TRI

20 PROPAGAÇÃO IN VITRO - Perspectivas Impacto da utilização de Biorreatores Fonte: Penchel, et al., 2007

21 PROPAGAÇÃO IN VITRO - Perspectivas Fonte: Penchel, et al., 2007

22 Micropropagação em Condições Fotoautotróficas PROPAGAÇÃO IN VITRO - Perspectivas Propagação in vitro convencional: heterotrófica Perda da competência fotossintética e desordens fisiológicas Etapa de aclimatização a condição ex vitro O que pode melhorar a competência FS e permitir rustificação in vitro? Reduzir ou eliminar Sacarose Uso de luz alternativa, luz natural [ CO 2 ] [ O 2 ]

23 Micropropagação em Condições Fotoautotróficas PROPAGAÇÃO IN VITRO - Perspectivas Uso de frascos maiores Menor risco de contaminação Automação!!

24 MARCADORES MOLECULARES Aplicações Operacionais Análise de DNA para fins de identificação individual e estudos de parentesco MM vem sendo utilizados em florestas desde os anos 80 primeiros mapas Tipos: RFLP RAPD AFLP SSR SNPs TRAP herança co-dominante multi-alélicos análise simples e econômica transferíveis dentro e entre espécies DArT

25 Evolução dos MM... MARCADORES MOLECULARES - Aplicações Grattapaglia, 2007

26 MARCADORES MOLECULARES - Aplicações Principais aplicações: 1. Identificação e Discriminação de Clones-elite Controle de Qualidade do Processo de Multiplicação: Certificação Genética Evitar mistura principalmente em jardim clonal Garantir que o clone selecionado pelo programa de melhoramento seja corretamente multiplicado e plantado

27 MARCADORES MOLECULARES - Aplicações Método Padrão para identificação de clones: SSR em sistemas multiplex com 6 a 12 locos analisados em seqüenciador automático Parcerias com universidades ou empresas de genotipagem Gel de agarose 3% com locos polimórficos Dados Tese Juliana Teixeira

28 Exemplo: Análise de identidade de 4 clones com 12 locos MARCADORES MOLECULARES - Aplicações Grattapaglia, 2007

29 MARCADORES MOLECULARES - Aplicações 2. Determinação da paternidade em cruzamentos controlados Identificação de contaminantes na progênie (auto-fecundação e filhos ilegítimos) Por que certificar os descendentes de um cruzamento? - Estimar corretamente os parâmetros genéticos que são ferramentas utilizadas pelos melhoristas na seleção de genótipos superiores!! - Correta identificação de marcadores de DNA que possivelmente poderiam ser utilizados na construção de mapas genéticos e no Melhoramento Assistido por Marcadores!!

30 MARCADORES MOLECULARES - Aplicações Pai Mãe Filho 1 Filho 2 Filho 3 Filho 4 Autofecundação Filho 5 Filho 6 Filho ilegítimo Dados Tese Juliana Teixeira

31 MARCADORES MOLECULARES - Aplicações 3. Proteção de Cultivares Consenso: Material genético é um dos principais componentes do sucesso empreendimento florestal ativo essencial para a manutenção e o crescimento da competitividade de uma indústria de base florestal Conjunto de 36 marcadores morfológicos estabilidade e pouca influência ambiental, em dois ciclos

32 MARCADORES MOLECULARES - Aplicações Muitos clones elites selecionados dentro da mesma família: difícil separá-los usando os descritores morfológicos!! MM: atendem com perfeição aos requerimentos do teste de DHE adotado na proteção intelectual de uma nova variedade BR: Lei de Proteção de cultivares n 9.456, sancionada em publicação das instruções para os ensaios de DHE MM: descritores complementares e facultativos 10 a 15 marcadores

33 MARCADORES MOLECULARES - Aplicações 4. Caracterização de Coleções de Germoplasmas e Populações de Melhoramento Direcionar rotas de coleta de sementes: maior variabilidade dentro de famílias sementes de uma única árvores por ponto de coleta representam grande parte da variabilidade daquela população coleta de sementes de uma ou poucas árvores, porém de um grande número de locais diferentes Planejamento de pomar de sementes com genótipos mais divergentes Gerenciar variabilidade genética em populações de melhoramento

34 MARCADORES MOLECULARES - Perspectivas Perspectivas SAM Nenhum MM publicado para ser usado na SAM aplicação operacional da SAM em árvores ainda é uma promessa!! Vários mapas publicados (RAPD, AFLP, SSR), com diversos QTLs mapeados Resistência a ferrugem

35 Florescimento precoce MARCADORES MOLECULARES Perspectivas

36 Vários mapas para Qualidade da Madeira MARCADORES MOLECULARES Perspectivas Grattapaglia, et al., 1992 Novaes, 2006

37 Porque não temos MM para serem usados na SAM? MARCADORES MOLECULARES Perspectivas Domesticação recente, pouco conhecimento sobre herança dos caracteres Impossibilidade ou grande dificuldade em obter linhagens Poucas características herança simples Poucos pesquisadores MM mapeados atualmente são dominantes e/ou aleatórios Novas perspectivas... Mapeamento de genes candidatos Mapeamento de Associação QTLs de expressão (eqtls)

38 Mapeamento de Associação MARCADORES MOLECULARES Perspectivas Grattapaglia, 2007 DESAFIOS Desconhecimento da extensão do desequilíbrio de ligação (espécie e/ou população específica) Whole genome scan ou genes candidatos?? Quantos e quais SNPs genotipar? Como genotipar? Definição de quais genes candidatos devem ser analisados Seleção de populações adequadas para análise

39 MARCADORES MOLECULARES Perspectivas QTLs de expressão gênica - Identificação de genes por trás de QTLs usando abordagem combinada mapeamento genético e expressão em microarranjos Grattapaglia, 2007

40 Transgenia Transgenese Florestal Transformação genética: ferramenta indispensável aos estudos de biologia molecular e pesquisa em genômica funcional Além de avaliar a função de genes em plantas, tem permitido a geração de cultivares com características superiores Vantagem: redução do tempo necessário para introdução de novas características de interesse em clones superiores Populus, eucalipto e coníferas agrobactérias é mais eficiente Populus: planta modelo para estudos de genética molecular em sps florestais Principal obstáculo: regeneração de plantas transformadas FOCO: QUALIDADE DA MADEIRA

41 TRANSGENIA Aplicações Classes de genes transformados: 1. Redução ou alteração do ciclo reprodutivo LFY de arabidopsis em Populus: Flores, frutos e sementes férteis em 7 meses redução de 8 anos 2. Modificação da arquitetura vegetal Genes reguladores da síntese de fitohormonios: TRP (triptofano sintase): maior formação de brotos, número e comprimento de raízes, número de folhas e área foliar Ugt (UDP-glicose-transferase): duplicação da taxa de multiplicação de raízes Ácido-giberélico-20-oxidase: crescimento vertical mais acelerado, folhas e fibras mais largas e aumento da biomassa

42 3. Manipulação dos teores de lignina e celulose TRANSGENIA Aplicações COMT e CCoAOMT: fenótipos indesejáveis, baixa S:G CAD: redução 45% lignina, aumento 15% celulose, crescimento mais rápido de caules e raízes 4. Resistência a pragas e doenças Inibidores de proteases e proteinases, quitinases, bacteriosinas, bacteriopsinas, glutationa sintase e oxalato oxidase 5. Tolerância a herbicidas e estresses abióticos CP4/EPSPS, GOX: tolerância a glifosato ahas: tolerância a imidazolinonas bar: glifosato amônio Glutamina sintase: R déficit hídrico Fitocromo A: R frio Glutationa sintase e glutationa redutase: R metais tóxicos e a ozônio

43 Eucalipto: TRANSGENIA Aplicações Literatura: vários trabalhos descrevendo geração de calos, tecidos ou órgãos geneticamente transformados, porém sem comprovação de que plantas completas foram regeneradas Diferentes grupos de pesquisas do setor privado: protocolos bem estabelecidos de transformação e regeneração: SEGREDO INDUSTRIAL

44 Fonte: Brum, 2007 TRANSGENIA Aplicações

45 TRANSGENIA Aplicações

46 TRANSGENIA Perspectivas Perspectivas Maioria dos trabalhos já realizados: aplicações industriais aumento produção e qualidade da madeira Futuro próximo: agregar valores de relevância ambiental recuperação de áreas ou ecossistemas degradadas Criação da Castanheira americana resistente à requeima da castanheira e a outras doenças, para recuperação futura do ecossistema florestal dos Appalaches, destruído em razão desta doença

47 GENÔMICA Aplicações Final do séc. XX: início da era genômica GENÔMICA Genomas completo de várias espécies tem sido seqüenciados plataformas e metodologias de sequenciamento em larga escala

48 Populus árvore modelo: GENÔMICA Aplicações Tamanho relativamente pequeno do genoma (~ 485 Mb) Similar ao tamanho do genoma de arroz 40 vezes menor que Pinus taeda Crescimento rápido podendo atingir maturidade reprodutiva em 4-6 anos e fenótipos de interesse em 1-3 anos Alta diversidade fenotípica e existência de híbridos inter-específicos Facilita o mapeamento genético Grande pool gênico Facilidade de propagação vegetativa e transformação genética Fundamental para o estudo da função gênica

49 GENÔMICA Aplicações Iniciado em 2002 pelo International Populus Genome Consortium e coordenado pelo Dr. Gerald Tuskan (ORNL) Maior parte do seqüenciamento realizado no JGI (Joint Genome Institute) Foram geradas 4,2 x 109 bases fornecendo uma cobertura de 7,5 vezes do genoma Entretanto o genoma não pode ser totalmente finalizado... - Aproximadamente 410 Mb (~ 85%) bases puderam ser montadas em regiões contíguas distribuídas pelos 19 grupos de ligação - Alto grau de heterozigose que geraram diversos segmentos haplotípicos (variantes alélicas) - Grande incidência de segmentos duplicados e abundância de transposons - Limitações na técnica de seqüenciamento e montagem

50 GENÔMICA Aplicações O que descobrimos... Apenas uma pequena porcentagem de genes em Populus não possui um homólogo em Arabidopsis (Sterky et al., 2004) A maioria das famílias gênicas em Arabidopsis possuem correspondentes em Populus. Em termos proporcionais algumas famílias possuem mais elementos em Populus do que em Arabidopsis 1. Genes associados com resistência à doenças (família NB-ARC) 2. Genes envolvidos no desenvolvimento meristemático 3. Transportadores de metabólitos e nutrientes A análise do genoma de Populus revelou que diversos segmentos estão duplicados Aproximadamente 8,000 genes foram identificados como tendo duas cópias (genes parálogos)

51 Iniciativas genômicas em outras espécies florestais GENÔMICA Aplicações Coníferas: Para gimnospermas em geral a principal dificuldade é o tamanho do genoma 15 Gb em média, ~ 5 vezes maior que o genoma humano! Muitos elementos repetitivos no genoma Com a tecnologia atual de seqüenciamento as perspectivas para a obtenção do genoma completo de qualquer conífera são remotas Apesar disso as ESTs fornecem informações valiosas sobre a expressão gênica e na busca por marcadores moleculares (SSR e SNP) Projetos Dendrome e Arborea estudos genômicos auxiliando melhoramento

52 GENÔMICA Aplicações

53 GENÔMICA Aplicações Eucalyptus Diferentemente das coníferas, o tamanho do genoma para o gênero Eucalyptus varia de 370 a 700 Mb Possui diversas vantagens como o Populus: Crescimento rápido, várias possibilidades de híbridos interespecíficos, grande variabilidade genética Principal desvantagem : Transformação genética não totalmente dominada, o que impede a realização de estudos funcionais Diversos projetos de seqüenciamento de ESTs foram realizados para Eucalyptus. A maioria com participação de empresas privadas - Não disponíveis publicamente Agrigenesis (Nova Zelândia) ESTs a partir de 20 bibliotecas de cdna de E. grandis. Somente 951 depositadas no Genbank

54 GENÔMICA Aplicações O Brasil tem uma posição de destaque no cenário mundial em relação à genômica de Eucalyptus. Existem duas iniciativas distintas: Forests: Focado na descoberta de genes. Geração de ESTs de E. grandis Genolyptus: Principal objetivo é estudar as bases genéticas de características de interesse econômico em Eucalyptus. 1. Geração de um plataforma de informações e recursos genômicos 2. Estabelecimento de uma rede de populações experimentais para pesquisa genômica 3. Mapeamento, identificação e determinação de função de genes envolvidos na formação da madeira e resistência a doenças 4. Estabelecimento das bases para iniciativas empresariais visando a incorporação de tecnologias genômicas nos programas de melhoramento

55 Sequenciamento do genoma completo... GENÔMICA Aplicações Grattapaglia, 2007

56 GENÔMICA Aplicações Era Pós-Genômica... transcrissômica, proteômica, metabolômica Foco: Qualidade da Madeira... Estudos comparando transcritos e proteínas de diferentes tecidos: folha, casca, xilema, etc.. Conclusões: Não há alta correlação qualitativa ou quantitativa entre os RNAm e as proteínas extraídos de um mesmo tecido. Presença de RNAm de um determinado gene não é indicativo de atividade da proteína equivalente na célula. Complementar dados de expressão com proteômica, metabolômica

57 GENÔMICA Aplicações Principais contribuições e perspectivas: Melhor compreensão da função dos genes, permitindo maior entendimento da relação entre um gene e um fenótipo bem como um entendimento mais global das relações complexas entre variação genética e variação fenotípica; Fornecimento de genes candidatos para estudos de associação, mapeamento e transgênicos; Novas plataformas de genotipagem e sequenciamento: sequenciar toda a população a ser mapeada!!

58 Conclusões Setor florestal investe em estudos relacionados a biotecnologia e aplica as principais tecnologias desenvolvidas; Genômica + melhoramento: compreensão das relações complexas entre variabilidade genética e diversidade fenotípica; Somente com a união de diferentes ferramentas de biotecnologia será possível obter informações sobre o controle dos complexos eventos moleculares...

59 Obrigada!