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1 "Uso de biomarcadores na avaliação da exposição ao benzeno" SEMINÁRIO PARA REVISÃO DO PROTOCOLO PARA UTILIZAÇÃO DE INDICADORES BIOLÓGICOS DA EXPOSIÇÃO OCUPACIONAL AO BENZENO 22 de JULHO de 2014 LEILIANE COELHO ANDRÉ UFMG

2 EXPOSIÇÃO À SUBSTÂNCIA QUÍMICA Fontes múltiplas de exposição EXPOSIÇÃO AR ALIMENTOS ÁGUA PRODUTOS DE CONSUMO VIA CRÍTICA?

3 AS INFORMAÇÕES TOXICOLÓGICAS Para poder avaliar o risco ou a segurança de um produto químico a ser liberados no ambiente, dois tipos diferentes de informação são necessários: Como e o que é o produto químico (TOXICIDADE) Quantas pessoas estão realmente sendo exposta ao produto químico (EXPOSIÇÃO) O estudo da relação entre a toxicidade de uma substância e a amplitude da exposição (população exposta) está diretamente associados ao risco à saúde

4 OS ESTUDOS DOS EFEITOS DAS SUBSTÂNCIAS QUÍMICAS SOBRE A SAÚDE possibilita avaliar o risco da população exposta e constitui o primeiro passo na fixação de normas ambientais para um contaminante químico AVALIAÇÃO DA TOXICIDADE Etudos experimentais (dose-resposta) Estudos in vitro Estudos computacionais BIOMONITORIZAÇÃO IMPORTANTE ferramenta na avaliação exposição humana às substâncias químicas

5 O QUE É BIOMONITORIZAÇÃO? Avaliação da exposição por meio da medida da substância química, ou de seu metabólito ou uma alteração biológica (BIOMARCADORES) no organismo humano ESTIMAR A EXPOSIÇÃO OU RISCO À SAÚDE ESTUDOS EPIDEMIOLÓGICOS ESTUDOS CLÍNICOS

6 O QUE É BIOMARCADOR? Todo e qualquer agente tóxico e/ou metabólito, assim como qualquer alteração bioquímica precoce cuja determinação nos fluídos biológicos, tecidos, ar exalado, avalie a intensidade da exposição ou reflita a interação entre o agente químico e o sistema biológico. BIOMARCADOR DE EXPOSIÇÃO É o próprio AQ ou seu metabólito BIOMARCADOR DE EFEITO É um parâmetro mensurável que revela uma alteração biológica (efeito precoce e não nocivo) BIOMARCADOR DE SUSCETIBILIDADE É um parâmetro que mede a capacidade, inerente ou adquirida do organismo de responder um alerta da exposição à S.Q

7 PREVER OS NÍVEIS DAS SUBSTÂNCIAS TÓXICAS por meio do monitoramento ambiental é difícil e inclui muitas suposições concentração/ar concentração/água EM VEZ DE PREVER, PODEMOS MEDIR OS NÍVEIS DE SUBSTÂNCIAS QUÍMICAS NAS PESSOAS concentração/solo concentração/alimento estado nutricional estilo de vida hábitos pessoais NÍVEIS PREVISTOS NA POPULAÇÃO fatores genéticos outros fatores

8 EXPOSIÇÃO QUÍMICA E OS EFEITOS NA SAÚDE FONTES DE EXPOSIÇÃO DOSE EXTERNA - água, ar, alimento, solo. Inalação Ingestão Absorção dérmica Avaliação da Exposição DOSE INTERNA - sangue, urina, ar expirado. DOSE BIOLOGICAMENTE EFETIVA - sangue, tecido. EFEITO TÓXICO Avaliação dos Efeitos

9 EXPOSIÇÃO Agente Tóxico PREVENÇÃO TOXICOCINÉTICA VIAS DE ABSORÇÃO SANGUE TECIDOS EXCREÇÃO TOXICODINÂMICA SÍTIO DE AÇÃO EFEITOS PRÉ CLÍNICOS CLÍNICA EFEITOS CLÍNICOS DIAGNÓSTICO

10 EXPOSIÇÃO Agente Tóxico dose externa TOXICOCINÉTICA VIAS DE ABSORÇÃO SANGUE dose interna TECIDOS EXCREÇÃO TOXICODINÂMICA SÍTIO DE AÇÃO dose biol. ativa EFEITOS PRÉ CLÍNICOS efeito precoce CLÍNICA EFEITOS CLÍNICOS efeito tóxico

11 BIOMONITORIZAÇÃO Interpretar os resultados de testes de toxicidade em termos de risco do mundo real SAÚDE DO TRABALHADOR SAÚDE AMBIENTAL Sobre uma exposição excessiva conhecida ou suspeita para os POLUENTES QUÍMICOS Sobre a relação das substâncias tóxicas e os níveis de dose interna que podem causar dano Para que possa diminuir significativamente a incerteza na avaliação de riscos humanos

12 BIOMONITORIZAÇÃO CONSIDERA EXPOSIÇÃO GLOBAL DO TRABALHADOR, SEJA OCUPACIONAL OU NÃO ABSORÇÃO POR TODAS AS VIAS DE INTRODUÇÃO EXPOSIÇÃO RELATIVA A UM PERÍODO PROLONGADO DE TEMPO E NÃO APENAS AO DA AMOSTRAGEM DESLOCAMENTOS DOS INDIVÍDUOS EM DIFERENTES ÁREAS DO LOCAL DE TRABALHO DIFERENÇAS INDIVIDUAIS NA DISPONIBILIDADE DOS TOXICANTES

13 SELEÇÃO E VALIDAÇÃO DE BIOMARCADORES Refletir a interação quantitativa do sistema biológico com a substância química Ter conhecida e apropriada sensibilidade e especificidade para interação. Ser reprodutível em relação ao tempo (curto e longo prazo) Está contido em um meio biológico acessível de análise, de preferência não invasivo. Existir um método analítico adequado (exatidão, precisão, reprodutível) Conhecer os valores normais do biomarcador em populações não expostas ao agente químico de interesse, e as variações intra e interindividuais.

14 RESPOSTA PROGRESSIVA DO ORGANISMO À UMA EXPOSIÇÃO QUÍMICA E BIOMARCADORES BIOMARCADOR DE DOSE INTERNA BIOMARCADOR DE EFEITO AQ EXPOSIÇÃO DOSE INTERNA DOSE BIOLÓGICA EFETIVA EFEITO BIOLÓGICO PRECOCE ALTERAÇÃO ESTRUTURAL FUNCIONAL INTOXICAÇÃO SUSCETIBILIDADE PREVENÇÃO DIAGNÓSTICO

15 BIOMARCADORES - CLASSIFICAÇÃO BIOMARCADOR DE EXPOSIÇÃO (DOSE INTERNA) É uma SQ ou seu metabólito ou o produto de interação agente tóxico/molécula crítica Chumbo no sangue Inseticida organoclorado no leite materno Mercúrio no cabelo Benzeno no ar expirado Ácido Fenil mercaptúrico na urina Ácido trans, trans mucônico na urina Aductos de DNA (benzeno, HPA)

16 BIOMARCADORES - CLASSIFICAÇÃO BIOMARCADOR DE EFEITO É um parâmetro mensurável que revela uma alteração biológica Carboxihemoglobina no sangue Metahemoglobina no sangue Ácido delta aminolevulínico na urina Enzima Acetilcolinesterase Biomarcadores de nefrotoxicidade (Proteínas) Biomarcadores de hepatotoxicidade (Enzimas) Biomarcadores de genotoxicidade (alterações DNA)

17 BIOMARCADORES - CLASSIFICAÇÃO BIOMARCADOR DE SUSCETIBILIDADE É um indicador que mede a capacidade, inerente ou adquirida organismo de responder um alerta da exposição química do Enzimas envolvidas no processo de metabolização de agentes tóxicos (Paraxonase)

18 DESAFIOS PARA UMA MELHOR COMPREENSÃO DOS DADOS GERADOS Melhorar a compreensão da RELAÇÃO ENTRE EXPOSIÇÃO, DOSE E EFEITO Excelência analítica, buscando a implementação de ensaios interlaboratoriais para comparação Caracterizar uma base de biomarcadores e aplicar métodos estatísticos para avaliar temporalmente análise de tendências e desvios da linha de base (considerada exposição segura, baixa...) Melhorar o entendimento do significado dos biomarcadores e sua relação com a doença/fatores individuais/exposição múltiplas Estabelecerum banco de dados de associações de biomarcadores de determinadas SQ

19 L I G A Ç Ã O C O M E F E I T O S BIOMARCADORES DE DOSE INTERNA MECANISMO DE INTERAÇÃO MOLECULAR EXPOSIÇÃO EXTERNA MEDIÇÃO DA DOSE INTERNA QUANTIDADE ABSORVIDA QUANTIDADE ALCANÇA TECIDO QUNTIDADE ALCANÇA CÉLULA QUANTIDADE ALCANÇA MACROMOLÉCULA QUANTIDADE ALCANÇA SÍTIO CRÍTICO DOSE BIOLOGICA// EFETIVA R E L A Ç Ã O C O M E X P O S I Ç Ã O

20 BIOMARCADORES DO BENZENO TOXICOCINÉTICA TOXICODINÂMICA FATORES ENDÓGENOS QUE INFLUENCIAM CADA ETAPA FATORES EXTERNOS (EXPOSIÇÃO CONCOMINATE) FATORES RELACIONADOS À HABITOS INDIVIDUAIS (TABACO, ÁLCOOL, MEDICAMENTOS )

21 BENZENO - TOXICOCINÉTICA ABSORÇÃO CUTÂNEA 0,4 mg/cm 2 /h (forma líquida) PULMONAR RAPIDAMENTE ABSORVIDO (50-90 %) PICO MÁXIMO [benzeno-sg] MINUTOS [benzeno-sg] DISTRIBUIÇÃO ACUMULAM NOS TECIDOS GORDURA PLACENTA ratos ( imediata// após exposição) BIOTRANSFORMAÇÃO (~ 85 %) FÍGADO - MEDULA ÓSSEA CIT P-450 METABÓLITOS ATIVOS RÁPIDA fenol (24hs)

22 EXCREÇÃO % BENZENO / AR EXPIRADO 0,1-0,2 % BENZENO / URINA % FENOL / URINA 4-6% CATECOL E HIDROQUINONA / URINA 2,5-25 % ÁCIDO TRANS-TRANS MUCÔNICO / URINA 0,1-0,5 % ÁCIDO FENILMERCAPTÚRICO / URINA O hábito de fumar, assim como álcool pode influenciar a excreção urinária de todos os biomarcadores do benzeno, e para baixos níveis de exposição ocupacional e ambiental ao benzeno, deve ser levado em conta na interpretação dos resultados da monitorização biológica.

23 AÇÃO GENOTÓXICA BENZENO TOXICODINÂMICA Os agentes genotóxicos interagem quimicamente com o material genético, formando aductos, alteração oxidativa ou mesmo quebras na molécula de DNA. O genoma de todos os organismos vivos está constantemente sob o efeito de agentes exógenos ou endógenos que modificam a integridade química do DNA, alterando seu conteúdo de informações genéticas. MUTAGÊNICO TERATOGÊNICO CARCINOGÊNICO

24 BIOMARCADORES DE EXPOSIÇÃO (DOSE INTERNA) ÁCIDO TRANS-TRANS MUCÔNICO na urina - sensibilidade e facilidade analítica ( custo) - correlação com benzeno no ar (0,5 ppm) - [ t-t M ] em exposição concomitante tolueno e xileno - ácido sórbico (precursor) prevenção fungos (gênero Aspergillus) - sucos de fruta, margarina, refrigerantes... - indivíduos fumantes: [ t-t M ] urinário

25 ÁCIDO FENILMERCAPTÚRICO na urina - correlação com benzeno no ar ( 0,3 1,0 ppm) - sensibilidade e especificidade - não é influenciado pelo cigarro (*) - usualmente utilizado exposição ocupacional - limitação analítica (padrões, técnica...?)

26 Estudo em população urbana X populção rural Valores aumentados de AFM associados à população urbana Estudo revelou elevada exposição ambiental ao benzeno

27 LIU, H; ZHU, B; SHI, J. DETERMINATION OF URINARY 8-HYDROXY-2'- DEOXYGUANOSINE, TRANS, TRANS-MUCONIC ACID, AND S- PHENYLMERCAPTURIC ACID BY LIQUID CHROMATOGRAPHY-MASS SPECTROMETRY. Artigo em Chinês, 2014 Desenvolvimento de um método analítico para determinação simultânea dos metabólitos do benzeno Cromatografia Líquida de Alta Eficiência com Detector de escpectrometria de massas. O método atendeu aos requisitos necessários para os estudos de linearidade, reprodutibilidade, repetibilidade e precisão analítica.

28 LV, BH; SONG, SZ; ZHANG, Z; MEI, Y; YE, FL. URINARY S- PHENYLMERCAPTURIC ACID AS A KEY BIOMARKER FOR MEASURING OCCUPATIONAL EXPOSURE TO LOW CONCENTRATIONS OF BENZENE IN CHINESE WORKERS: A PILOT STUDY. J OCCUP ENVIRON MED, 56(3) , 2014 Cromatografia Líquida de Alta Eficiência com Detector de Espectrometria de Massas O método atendeu aos requisitos necessários para os estudos de linearidade, reprodutibilidade, repetibilidade e precisão analítica. Os resultados de AFM apresentaram boa correlação com com bixas doses de benzeno no ar (0,7 ppm)

29 LOVREGLIO, P et al. MONITORING OF THE OCCUPATIONAL AND ENVIRONMENTAL EXPOSURE TO LOW DOSES OF BENZENE. G ITAL MED LAV ERGON,;35(4):251-5, Revisão da literatura e comparação entre ATTM e AFM Conclui que o AFM um marcador confiável, mesmo para exposição a concentrações abaixo de 0,5 ppm e pode ser considerado o biomarcador de escolha para o monitoramento biológico dos trabalhadores expostos ao benzeno

30 BENZENO na urina - sensibilidade e especificidade - tempo de amostragem crítico - limitação analítica (sensibilidade)

31 BENZENO no ar expirado - sensibilidade e especificidade - facilidade analítica (matriz biológica) - correlação com benzeno no ar - não invasivo - avalia exposição recente (dia) - tempo de amostragem crítico

32 BIOMARCADORES DE EFEITO TESTE COMETA - não específico - baixa sensibilidade - não há dados de correlação com benzeno no ar - indicador de efeito genotóxico Corresponde a uma alteração biológica mensurável que possibilita a avaliação da ação de uma substância química no órgão-alvo Avalia precocemente o dano no DNA

33 AVALIAÇÃO DA EXPOSIÇÃO AO BENZENO POR MEIO DOS BIOMARCADORES DE DOSE INTERNA E EFEITO EM TRABALHADORES DE POSTOS DE GASOLINA Nos últimos anos, pesquisas buscam estabelecer relações de causa-efeito, decorrentes da exposição ambiental e/ou ocupacional ao benzeno e sua presença na gasolina. ÁCIDO TRANS, TRANS MUCÔNICO NA URINA TESTE COMETA EM LINFÓCITOS

34 RESULTADOS TESTE COMETA: VALIDAÇÃO DO MÉTODO E AVALIAÇÃO DA EXPOSIÇÃO OCUPACIONAL AO BENZENO PRESENTE NA GASOLINA E COMPARAÇÃO COM ÁCIDO TRANS, TRANS MUCÔNICO URINÁRIO Dissertação de Mestrado Apresentação em Congresso Elaboração de artigo científico para publicação

35 POPULAÇÃO ESTUDADA O grupo exposto de indivíduos expostos ao benzeno presente na gasolina formado por trabalhadores frentistas e analistas de combustíveis; O grupo controle de indivíduos não expostos ocupacionalmente ao benzeno; O projeto foi aprovado pelo Comitê de Ética UFMG sob o protocolo 118/11.

36 TESTE COMETA-metodologia A metodologia do Teste Cometa padronizada neste estudo, se baseou nos procedimentos descritos previamente por Rojas et al. (1999), Hartman et al. (2003), Tice et al. (2000) e Azqueta et al. (2011). Preparo das lâminas com o sangue total lise das células com uma solução altamente concentrada em sais As lâminas mantidas neste tampão alcalino por 40 minutos (permitindo o desenrolamento do DNA e o afrouxamento de suas ligações) Eletroforese Fixação e coloração

37 TESTE COMETA-metodologia Calibração: linearidade e reprodutibilidade Linearidade: irradiação (0, 2, 4, 6 e 8 Gy) Reprodutibilidade: três amostras em triplicata irradiação (0, 5 e 10 Gy) três dias seguidos Leitura por dois observadores

38 TESTE COMETA - classificação 5 classes de cometa (Collins et al., 2004): 0 (sem cauda) a 4 (quase todo o DNA na cauda) Cálculo do Índice de Dano (ID)

39 ÁCIDO TRANS, TRANS MUCÔNICO Metodologia ANÁLISE DO ÁCIDO TRANS, TRANS MUCÔNICO NA URINA Extração em Fase Sólida Cromatografia Líquida de Alta Performance Detector UV/Vis Estudo de Linearidade, Precisão, Exatidão, LD e LQ

40 ÁCIDO TRANS-TRANS MUCÔNICO Cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC- UV/VIS) Metodologia: Ducos modificado por Paula et al. (2003) Extração em fase sólida, utilizando coluna de amônia quaternária Determinação: Curva de calibração (0,0625 a 1,5 g/ml) Limite de Detecção: 0, 003 mg/l Limit de Quantificação: 0, 06 mg/l

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47 t,t MA 6 5,5 5 4,5 4 3,5 3 2,5 2 1,5 1 0,5 0 Relation between trans, trans muconic acid (t,t MA) and damage index (DI) for attendants R² = 0, DI

48 t,t MA 1,1 Relation between trans, trans muconic acid (t,t MA) and damage index (DI) for analysts 1 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 R² = 0, DI

49 DISCUSSÃO E CONCLUSÃO Embora essa detecção de danos ao DNA, utilizando linfócitos do sangue periférico, não represente a curto e médio prazo, o aparecimento de patologias relacionadas, especialistas aceitam que as células de sangue podem ser utilizadas como células sentinelas e que forneceriam precocemente sinais de alerta para efeitos adversos em longo prazo à saúde; A padronização e validação do teste cometa apresentaram os parâmetros de mérito adequados para o propósito de utilizá-lo como biomarcador aos danos provocados pela irradiação gama, ele obedeceu a uma ordem linear e foi reprodutível; O biomarcador de exposição de benzeno, o ácido trans-trans mucônico, permitiu verificar que a população exposta estudada, estava em contato com a substância em questão e que existiam níveis aumentados para frentistas e analistas de combustível, caracterizando uma exposição ocupacional.

50 O teste cometa correlacionou de maneira positiva com os resultados do AttM, ou seja, quando houve uma excreção urinária maior do biomarcador, os danos ao DNA também eram maiores; Os resultados encontrados nesse estudo permitiu confirmar e reconhecer que existe um risco ocupacional e genotóxico com relação a exposição ao benzeno, através da gasolina, pois o delineamento caso-controle, permite constatar fortes evidências de que o dano ao DNA aumentado encontrado nesta população está ligado ao benzeno, e que a exposição constitui um risco à saúde.

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