UNIVERSIDADE DO EXTREMO SUL CATARINENSE UNESC PROGRAMA DE PÓS GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS DA SAÚDE - PPGCS WILSON RODRIGUES RESENDE

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1 1 UNIVERSIDADE DO EXTREMO SUL CATARINENSE UNESC PROGRAMA DE PÓS GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS DA SAÚDE - PPGCS WILSON RODRIGUES RESENDE AVALIAÇÃO DOS EFEITOS ANTIDEPRESSIVOS E ANTIMANÍACOS DO BUTIRATO DE SÓDIO EM MODELOS ANIMAIS DE MANIA E DEPRESSÃO: IMPLICAÇÕES PARA A VALIDAÇÃO DE UM NOVO ESTABILIZADOR DO HUMOR CRICIÚMA, FEVEREIRO DE 2013

2 2 WILSON RODRIGUES RESENDE AVALIAÇÃO DOS EFEITOS ANTIDEPRESSIVOS E ANTIMANÍACOS DO BUTIRATO DE SÓDIO EM MODELOS ANIMAIS DE MANIA E DEPRESSÃO: IMPLICAÇÕES PARA A VALIDAÇÃO DE UM NOVO ESTABILIZADOR DO HUMOR Dissertação de Mestrado apresentado ao Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde para o exame de qualificação em Ciências da Saúde. Orientadora: Prof. Dra. Alexandra Ioppi Zugno CRICIÚMA, FEVEREIRO DE 2013

3 3 Dados Internacionais de Catalogação na Publicação R433a Resende, Wilson Rodrigues. Avaliação dos efeitos antidepressivos e antimaníacos do butirato de sódio em modelos animais de mania e depressão : implicações para a validação de um novo estabilizador do humor / Wilson Rodrigues Resende ; orientadora : Alexandra Ioppi Zugno. Criciúma, SC : Ed. do Autor, p. : il.; 21 cm. Dissertação (Mestrado) - Universidade do Extremo Sul Catarinense, Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde, Criciúma, Transtorno bipolar. 2. Depressão. 3. Butirato de sódio. I. Título. CDD. 22ª ed Bibliotecária Eliziane de Lucca Alosilla CRB 14/1101 Biblioteca Central Prof. Eurico Back - UNESC

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5 5 AGRADECIMENTOS Agradeço, a Deus que sempre está do meu lado com seu amor incondicional. Preciso aqui fazer um agradecimento mais que especial a pessoa que me abriu as portas do laboratória e confiou em mim pra ser seu IC. Agradeço, muito, a Samira Valvassori que me ajudou em tudo, sempre muito comprometida acreditando em mim mesmo quando eu proprio não acreditava. Me tornei teu amigo e eterno admirador do teu trabalho, da tua garra e da pessoa ética que tu és. Obrigado. Ao professor João Quevedo, pela oportunidade que me deu ao me aceitar na equipe. Muito obrigado. A equipe de estudos de transtorno bipolar do laboratório: Roger Varella, Daniela Bavaresco (amiga muito especial), Camila Arent, Jessica Borges, Gustavo Dal Pont, Juliane Franciscone, Letícia Calegare e a Josiane Budni que com sua enorme paciência me ajudou em tudo que eu precisei. A toda equipe do neurolab que está sempre trabalhando e disposta a ajudar. A professora Alexandra que me aceitou como orientando e me deixou bastante a vontade me dando total autonomia. A equipe do biotério que apresentou uma enorme paciência ajudando em todas as fazes do experimento. E por fim, e não menos importante, a minha irmã Nair que sempre me ajuda no que eu preciso.

6 6 RESUMO Transtorno Bipolar é um transtorno de humor grave, com grande morbidade e mortalidade. Apesar do tratamento adequado, os pacientes continuam a ter episódios de humor recorrentes, sintomas residuais e prejuízo funcional. Alguns estudos préclínicos demonstraram que inibidores das histona desacetilases podem agir em comportamentos depressivos e maníacos. Portanto, o objetivo do presente estudo foi avaliar os efeitos do butirato de sódio sobre as mudanças comportamentais em modelos animais de depressão e mania. Os animais foram submetidos a protocolos de privação materna ou estresse crônico moderado para avaliar comportamentos depressivos e submetido a protocolo de mania induzido por anfetamina ou administração de ouabaína para avaliação de comportamento do tipo maníaco. No presente estudo, podemos observar que a administração de SB reverteu os comportamentos depressivos e maníacos avaliados nos modelos animais. A partir dos resultados aqui apresentados, podemos sugerir que a SB pode ser um estabilizador do humor potencial. Palavras-chave: transtorno bipolar, depressão, mania; butirato de sódio; modelo animal

7 7 ABSTRACT Bipolar Disorder is a severe mood disorder with great morbidity and mortality. Despite adequate treatment, patients continue to have recurrent mood episodes, residual symptoms, and functional impairment. Some preclinical studies have shown that histone deacetylases inhibitors may act on depressive and maniclike behaviors. Therefore, the aim of the present study was to evaluate the effects of sodium butyrate on behavioral changes in animal models of depression and mania. The animals were submitted to protocols of chronic mild stress or maternal deprivation for evaluating depressive-like behaviors and subjected to amphetamine or ouabain administration for evaluation of manic-like behaviors. In the present study we can observe that administration of sodium butyrate reversed the depressive and manic-like behaviors evaluated in the animal models. From the results presented here we can suggest that SB may be a potential mood stabilizer. Key words: bipolar disorder; depression; mania; sodium butyrate; animal model

8 8 LISTA DE ABREVIATURAS DM= Depressão Maior TB= Transtorno Bipolar HAT= Histona Acetiltransferase HDAC= Histona Deacetilase IMI= Imipramina Li= Lítio VPA= Valproato BS= Butirato de Sódio OUA= ouabaína AMPH= anfetamina (do inglês) m-amph= meta-anfetamina d-amph= dextro-anfetamina TNF= Teste de Nado Forçado ECM= Estresse Crônico Moderado PM= Privação Materna IM= intramuscular ICV= intracebroventricular

9 9 (sigla do inglês) LCR= Liquido Céfalo-Raquidiano artificial BDNF= Fator Neurotrófico Derivado do Cérebro

10 10 SUMARIO 1 INTRODUÇÃO Transtornos do humor Depressão Maior (DM) Transtorno bipolar Inibidores de histonas deacetilases e transtornos de humor Modelos animais Modelos animais de mania Modelos animais de depressão OBJETIVOS Objetivo geral Objetivos específicos MATERIAIS E MÉTODOS Animais Experimentais Medicamentos e tratamentos Tratamento agudo Atividade Locomotora Teste do Nado Forçado (TNF) Estresse Crônico Moderado (ECM) Consumo de Sacarose (Anedonia) Privação Materna (PM) Modelo Animal de Mania Induzida pela d-amph Modelo Animal de Mania Induzido por Ouabaina Procedimento Cirúrgico Tratamento Analise Estatística RESULTADOS DISCUSSÃO CONCLUSÃO REFERÊNCIAS... 47

11 11 1 INTRODUÇÃO 1.1 Transtornos do humor Os transtornos do humor são uma das principais causas de morbidade e mortalidade em todo o mundo (HARRIS e BARRACLOUGH, 1998; HIROEH et al., 2001). Segundo o Manual Diagnóstico e Estatístico de Transtornos Mentais (DSM- IV), os dois principais transtornos do humor são Depressão Maior (DM) e Transtorno Bipolar (TB), ambos caracterizados por uma extrema e inapropriada alteração do humor com importante comprometimento social, cognitivo e funcional (MURRAY & LOPEZ, 1997; MORGAN et al., 2008; AAS et al., 2012). Eles são também uma das causas de maior incapacitação em todo o mundo, com alto impacto na vida do paciente, da sua família e da sociedade (ANGST et a., 2002; TSAI et al., 2002). Os custos econômicos incluem despesas relacionadas ao tratamento (hospitalar e domiciliar) e relacionadas à diminuição de sofrimento causado pelo transtorno (SOARES e MENEZES, 2001). Além disso, em consequência da invalidez precoce, o Estado acaba tendo altos custos com aposentadoria, serviços de saúde e medicamentos para pacientes com estes transtornos (MARNEROS et al., 1990). Apesar disso, muitos pacientes que sofrem desses transtornos, não respondem adequadamente aos fármacos disponíveis, demoram a obter uma resposta à medicação e/ou não toleram os seus efeitos colaterais (JUDD et al., 2002; TRIVEDI et al., 2006; ZARATE et al., 2006; HASHIMOTO et al., 2012). 1.2 Depressão Maior (DM) A DM foi estimada como a quarta causa de incapacitação quando comparada a várias doenças crônicas. Em consequência disso, a previsão para o ano 2020 é que a depressão será a segunda causa de incapacitação em países desenvolvidos, e a primeira em países em desenvolvimento (MURRAY et al., 1997). Quando comparada às principais condições médicas crônicas, a depressão é comparada em incapacitação às doenças isquêmicas cardíacas graves (WELLS

12 12 et al., 1989). O Manual Diagnóstico e Estatístico de Doenças Mentais, IV edição da Associação Americana de Psiquiatria (DSM-IV), caracteriza o transtorno depressivo maior como tendo dois sintomas principais humor deprimido e/ou anedonia, definida como a perda do prazer, e pelo menos outros cinco sintomas associados, os quais são: perda de apetite, distúrbios do sono, agitação ou retardo psicomotor, diminuição da energia, sentimentos de inutilidade e culpa e/ ou ideação suicida. Estes sintomas devem persistir por pelo menos duas semanas e causar prejuízo significativo do funcionamento social, profissional e pessoal (DUMAN et al., 1998). Estudos mostraram que dentre os transtornos mentais relacionados às tentativas de suicídio, a depressão fica em primeiro lugar apresentando frequências entre 13% e 53,8% (BEUATRAIS et al., 1996; HAW et al., 2001; NOCK et al., 2006; BERNAL et al., 2007). Entre as comorbidades agregadas a esse transtorno encontram-se obesidade; diabetes; problemas cardiovasculares, endocrinológicos, neurológicos, renais, oncológicos e outras síndromes dolorosas crônicas (TENG et al., 2005). 1.3 Transtorno bipolar O TB é um transtorno mental que se caracteriza por variações do humor que se diferem das variações normais de um indivíduo saudável. O indivíduo que sofre com esse transtorno apresenta episódios maníacos, hipomaníacos, depressivos e/ou mistos (MÜLLER-OERLINGHAUSEN et al., 2002). O TB é classificado como tipo I e II. No tipo I, o paciente apresenta sintomas maníacos alternados com sintomas depressivos e/ou hipomaníacos. No tipo II, o paciente apresenta somente sintomas hipomaníacos intercalados por episódios depressivos e/ou mistos. Durante os episódios maníacos os pacientes bipolares apresentam humor elevado, expansivo e ou irritável, por um período de pelo menos uma semana ou a necessidade de hospitalização. O episódio hipomaníaco é semelhante ao episódio maníaco, entretanto, o tempo de duração é menor, não

13 13 mais que uma semana, e sem maiores prejuízos social e funcional. Segundo o DSM-IV, o diagnóstico requer que as alterações do humor, tanto na mania quanto na hipomania, sejam acompanhadas por pelo menos três sintomas adicionais: autoestima inflada ou grandiosidade, diminuição da necessidade de sono, taquilalia, fuga de ideias, distratibilidade, agitação psicomotora e comportamentos de risco (JORGE, 2003). Embora o marco clínico para o diagnóstico do TB seja a presença de pelo menos um episódio maníaco ou hipomaníaco, normalmente, os pacientes passam a maior parte de suas vidas em depressão (JUDD et al., 2003). Nos episódios mistos, o paciente bipolar apresenta uma alternância rápida do humor, com a presença de sintomas dos estados maníacos e depressivos, por um período de tempo de pelo menos uma semana. Sendo de suma importância destacar que, para que seja caracterizado um episódio misto, estas alterações do humor precisam ser suficientemente importantes, causando prejuízo no trabalho e/ou nos relacionamentos pessoais (JORGE, 2003). A mortalidade de pacientes com TB é digna de nota, sendo o suicídio a causa mais frequente. Em um estudo recente, foi demonstrado que cerca de 60% dos pacientes bipolares do tipo I têm ideação suicida e que 29% desses já tentaram suicídio em algum momento de sua vida (BEGA et al., 2012). A lista de comorbidades associadas ao TB, que inclui obesidade, diabetes e problemas cardiovasculares, também está fortemente ligada à morbidade e mortalidade, vistas nesse transtorno (KUPFER, 2005; MCINTYRE et al., 2007). 1.4 Inibidores de histonas deacetilases e transtornos de humor Epigenética é comumente definida como o conjunto de alterações na expressão gênica que é hereditária, mas não envolve mudanças na sequência do DNA. Por exemplo, a influência dos fatores ambientais que podem modular as enzimas e proteínas associadas à metilação/acetilação do DNA e a modificação das histonas podem alterar a expressão genética (VERCELLI, 2004).

14 14 Cabe esclarecer que histonas são as principais proteínas que compõem a cromatina. Atuam como uma matriz na qual o DNA se enrola e têm um papel fundamental na regulação dos genes. Histona acetiltransferase (HAT) e histona deacetilase (HDAC) são enzimas que influenciam na transcrição por acrescentar (acetilação) ou remover (deacetilação) grupos acetis de um aminoácido ε-n-acetil lisina em uma histona. A acetilação da histona está ligada à atividade transcricional, enquanto a deacetilação está ligada à inativação da transcrição gênica (DRUMMOND et al., 2005). Weaver et al., (2004) têm desenvolvido uma série de estudos sobre comportamento maternal e epigenética em ratos. Com esses estudos eles demonstraram que o aumento de cuidados maternais foram avaliados os parâmetros comportamentais de lamber o filhote pup licking (L), afagar a pele ou os pelos dos filhotes grooming (G) e amamentação realizada pela mãe quando permanecia numa posição com curvatura dorsal, que possibilitava melhor acesso dos filhotes aos mamilos arched-back nursing (ABN) altera o epigenoma da prole em um promotor do gene do receptor de glicocorticóide no hipocampo. Os filhotes das ratas que mostraram altos níveis de L, G e ABN tiveram diferenças na metilação do DNA quando comparado com os filhotes que tiveram baixos L, G e ABN. A infusão central de um inibidor de HDAC removeu a diferença entre os grupos na deacetilação de histona, na metilação de DNA e na função do eixo hipotálamo-hiófise-adrenal, o qual é bem conhecido por ter um papel fundamental no estresse. Assim, os autores mostraram que um estado epigenético do gene pode ser estabelecido através da programação comportamental e este estado pode ser potencialmente reversível. Esta linha de achados é interessante em casos que a sequela por estressores no início da vida - frequentemente observada em pacientes com TB (LEVERICH et al., 2003) - pode ser minimizada com inibidores de HDAC. Em um estudo clínico, foi usado o PCR quantitativo para avaliar os níveis de RNAm das HDAC em sangue periférico de pacientes com DM e TB durante os episódios depressivo e remissivo. Em pacientes com DM foram encontrados níveis

15 15 aumentados de RNAm das HDAC2 e HDAC5 durante o estado depressivo. Em pacientes bipolares, a expressão das HDAC6 e HDAC8 diminuíram em ambos os estados, depressivo e remissivo, quando comparado ao grupo controle (HOBARA et al., 2010). As drogas clássicas para tratamento de TB são lítio (Li) e valproato (VPA). Elas são efetivas nos episódios de mania aguda, promovem razoável proteção contra episódios de humor recorrentes e têm uma modesta atividade antidepressiva (DAVIS et al., 2005; KECK, 2002; MANJI, 2002). Vários alvos bioquímicos em que Li e VPA agem diretamente têm sido identificados com o intuito de desenvolver fármacos que tenham uma ação mais específica e rápida, tendo, consequentemente, menos efeitos colaterais. As HDAC são um alvo direto de VPA, e a modulação dessas enzimas parecem estar envolvidas na disfunção e degeneração neuronal (GOULD et al., 2004; LANGLEY et al., 2005), aumentando assim, a possibilidade desse alvo molecular, as HDAC, ter um papel fundamental em algumas facetas dos efeitos terapêuticos do VPA. Recentemente, demonstrou-se que a infusão de butirato de sódio (BS) e VPA, dois inibidores da HDAC, no ventrículo, na amígdala, no estriado e no córtex pré-frontal bloqueou a hiperatividade induzida pela meta-anfetamina (m- AMPH) em ratos (ARENT et al., 2011). Em outro estudo préclínico, foi demonstrado que a administração intraperitoneal de VPA e SB em ratos além de prevenir e reverter o comportamento do tipo-maníaco induzido por dextro-anfetamina (d-amph), também protegeram o cérebro dos animais contra dano mitocondrial induzido por essa droga (MORETTI et al., 2010; VALVASSORI et al., 2010). Schroeder et al., (2007) mostraram que o tratamento com BS e fluoxetina resultaram numa significativa diminuição do tempo de imobilidade no teste de suspensão pela cauda, uma medida de desespero comportamental, em ambos tratamentos, agudo e crônico, o que sugere que o BS exerce efeitos antidepressivos em modelos animais de depressão. Tendo em vista os estudos citados anteriormente, podemos sugerir que o BS pode ter um forte potencial como um

16 16 estabilizador do humor, porque parece atuar tanto em modelos animais de mania quanto em modelos animais de depressão. Entretanto, existem poucos estudos mostrando os possíveis efeitos antimaníacos e antidepressivos do BS. Por isso, mais estudos são necessário para melhor avaliarmos o potencial do BS como um novo estabilizador do humor. 1.5 Modelos animais Os modelos animais tem sido uma ferramenta importante para o estudo de mecanismos intracelulares envolvidos nos transtornos psiquiátricos, bem como para o teste de novas estratégias terapêuticas. Para ser válido, um modelo animal de transtorno psiquiátrico precisa apresentar três características principais: 1) a validade de face - a qual se refere à habilidade que o modelo tem em mimetizar sintomas do transtorno; 2) a validade de constructo - que é a capacidade do modelo em mimetizar mecanismos fisiopatológicos envolvidos no determinado transtorno e; finalmente 3) a validade preditiva - em que fármacos clássicos utilizados para o tratamento do determinado transtorno precisam reverter os sintomas induzidos no modelo (ELLENBROEK e COOLS, 1990). 1.6 Modelos animais de mania Estudos prévios do Laboratório de Neurociência da Universidade do Extremo Sul Catarinense caracterizaram bem o modelo animal de mania induzido pela administração da anfetamina (AMPH), no qual os estabilizadores do humor, Li e VPA, reverteram e preveniram a hiperatividade induzida por esse psicoestimulante (FREY et al., 2006a; b; c). É bem descrito na literatura que a AMPH, um agonista dopaminérgico, induz sintomas maníacos em pacientes com TB (JOYCE et al., 1995), bem como em voluntários saudáveis (ANAND et al., 2000). Além disso, níveis elevados de dopamina na urina de pacientes bipolares foram associados à emergência de episódios maníacos (JOYCE et al., 1995).

17 17 A administração de ouabaína (um potente inibidor da Na + K + ATPase) em ratos, além de induzir hiperatividade, parece induzir também hipoatividade, que pode ser considerada sintoma do tipo-depressivo. Ambos os sintomas induzidos pela ouabaína são prevenidos pela administração de Li, um clássico estabilizador do humor usado no tratamento da bipolaridade (LI et al., 1997; JORNADA et al., 2010). Além disso, em uma metaanálise, Looney e El-Mallakh (1997) encontraram diminuição da atividade da Na + K + ATPase em eritrócitos de pacientes, tanto na fase maníaca quando na fase depressiva, quando comparados com os pacientes bipolares que estavam em eutimia. 1.7 Modelos animais de depressão Muitos modelos animais de depressão são utilizados com o intuito de avaliar novas possíveis substâncias antidepressivas (NESTLER et al., 2002; CRYAN e SLATTERY, 2007). Entre eles, se encontra o teste de natação forçada - descrito primeiramente por Porsolt et al., (1977) - que é um modelo animal preditivo de atividade antidepressiva e é baseado na observação do estado de desespero comportamental. O teste consiste na exposição de roedores a uma situação aversiva, nadar em um tanque cilíndrico com água, onde não podem tocar o fundo do cilindro ou fugir (escape). Com o tempo, os animais percebem que não tem como sair do local e desenvolvem uma postura de imobilidade, a qual é considerada como a perda de esperança, e é revertida pela administração de antidepressivos. Entre os modelos animais de depressão, está o modelo baseado na indução do estresse, que consiste em gerar um comportamento anedônico em ratos, por meio da aplicação de diversos estressores moderados, como privação de água, privação de comida, isolamento social e exposição à luz estroboscópica (GAMARO et al., 2003). Alguns estudos demonstraram que os animais submetidos ao protocolo de estresse desenvolveram comportamento anedônico, diminuindo o consumo de sacarose; além disso, apresentaram alterações fisiológicas, como diminuição no peso e alterações no eixo hipotálamo-hipófise-adrenal e esses efeitos foram revertidos pela

18 18 administração de fármacos antidepressivos (GARCIA et al., 2009; FORTUNATO et al., 2010). A privação materna em roedores é utilizada para estudar eventos adversos no início da vida e mimetiza o estresse induzido pela negligência ou pela perda dos pais em humanos. Esse modelo é considerado um dos estressores naturais mais potentes durante o período de desenvolvimento e é utilizado para estudar alterações comportamentais e neurobiológicas provenientes do estresse precoce (ANISMAN et al., 1998; HALL, 1998; FRANCIS et al., 1999; MATTHEWS e ROBBINS, 2003; VAZQUEZ et al., 2005a; b). A separação materna induz comportamentos do tipo depressivo em roedores, os quais são revertidos pela administração de antidepressivos (HUOT et al., 2001; LADD et al., 2000).

19 19 2 OBJETIVOS 2.1 Objetivo geral Avaliar os possíveis efeitos antimaníacos e antidepressivos do butirato de sódio em modelos animais de mania e depressão. 2.2 Objetivos específicos 1. Avaliar os efeitos da administração aguda de BS ou IMI sobre a atividade locomotora e exploratória em ratos Wistar; 2. Avaliar os efeitos da administração aguda de BS ou IMI sobre os parâmetros contabilizados no teste de Nado Forçado em ratos Wistar; 3. Avaliar os efeitos da administração sub-crônica de BS ou IMI sobre a atividade locomotora e exploratória em ratos Wistar; 4. Avaliar os efeitos da administração sub-crônica de BS ou IMI sobre os parâmetros contabilizados no teste do Nado Forçado em ratos Wistar; 5. Avaliar os efeitos do tratamento sub-crônico de BS sobre a atividade locomotora e exploratória em um modelo animal de depressão induzido por privação materna em ratos Wistar; 6. Avaliar os efeitos do tratamento sub-crônico de BS sobre o teste do nado forçado em um modelo animal de depressão induzido por privação materna em ratos Wistar; 7. Avaliar os efeitos do tratamento sub-crônico de BS sobre a atividade locomotora e exploratória em um modelo animal de depressão induzido por estresse crônico moderado em ratos Wistar; 8. Avaliar os efeitos do tratamento sub-crônico de BS sobre o teste de Consumo de Sacarose em um modelo animal de depressão induzido por estresse crônico moderado em ratos Wistar; 9. Avaliar os efeitos do tratamento sub-crônico de BS

20 20 sobre o teste do nado forçado em um modelo animal de depressão induzido por estresse crônico moderado em ratos Wistar; 10. Avaliar os efeitos do tratamento sub-crônico de BS sobre a atividade locomotora e exploratória em um modelo animal de mania induzido por anfetamina em ratos Wistar; 11. Avaliar os efeitos do tratamento sub-crônico de BS sobre a atividade locomotora e exploratória em um modelo animal de mania induzido por ouabaína em ratos Wistar.

21 21 3 MATERIAIS E MÉTODOS Os procedimentos experimentais envolvendo os animais foram executados de acordo com o Instituto Nacional de Guia de Saúde para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório (Institutos Nacionais de Saúde de publicação) e as recomendações da Sociedade Brasileira de Ciências Animais de Laboratório (BSCAL) projetadas para minimizar o sofrimento e limitar o número de animais utilizados. Este estudo foi executado somente após aprovação pelo Comitê de Ética em Pesquisa da Universidade do Extremo Sul Catarinense. Todos os experimentos deste projeto foram realizados nos Laboratórios de Neurociências da Universidade do Extremo Sul Catarinense UNESC. 3.1 Animais Experimentais Foram utilizados ratos Wistar machos (60 dias) procedentes do biotério da Unesc. Os animais foram acondicionados em caixas contendo 5 indivíduos cada, num ciclo claro - escuro de 12h (07:00 às 19:00) (Claro 7:00h) e comida e água ad libitum. O ambiente foi mantido na temperatura de 23 ± 1º C. 3.2 Medicamentos e tratamentos Tratamento agudo O butirato de sódio (BS), que foi utilizado no presente estudo, foi adquirido na Sigma-Aldrich, (EUA), e o Imipramina (IMI) foi adquirida na Novartis Pharmaceutical Industry (Suíça). Os animais receberam uma única injeção intraperitoneal (i.p) de solução salina (NaCl 0,09%) ou BS (500 mg/kg) ou IMI (10 mg/kg). O IMI e BS foram dissolvidos em solução salina, imediatamente antes das injeções. Todos os tratamentos foram administrados num volume de 1 ml/kg. A dose de BS que foi administrada no presente estudo foi escolhida com

22 22 base em estudos prévios (MORETTI et al., 2011). Os animais foram submetidos ao teste do campo aberto e teste de nado forçado, 1h após a administração de IMI, BS ou Sal. Para esse protocolo experimental, foi utilizado um n = 15 por grupo, somando um total de 45 animais Tratamento Sub-Crônico Foi administrado BS (500 mg/kg), IMI (10 mg / kg) ou solução salina (NaCl 0,09%) via intraperitoneal, duas vezes por dia (n = 15 animais por grupo), durante 7 dias. Todos os tratamentos foram administrados num volume de 1 ml/kg. Os animais foram submetidos ao teste do campo aberto e ao teste do nado forçado. No 5 dia do tratamento foi avaliada a atividade locomotora e exploratória dos animais, no teste do campo aberto. No 6 e 7 dia do tratamento, foi avaliado parâmetros comportamentais do tipo depressivo no TNF. Do 5 dia até o 7 dia de tratamento, as administrações dos fármacos foram feitas 1h antes das avaliações comportamentais. Para desenvolver este experimento foram necessários 45 animais (n = 15 por grupo) Atividade Locomotora A tarefa de habituação ao campo aberto foi executada em uma caixa de 40 x 60 cm cercada por três paredes de 50 cm de altura feitas de madeira compensada, com uma parede de vidro frontal, com o assoalho dividido em nove quadrados iguais marcados por linhas pretas. Os animais foram colocados delicadamente no quadrante traseiro esquerdo, a fim explorar a arena por 5min, onde foram contados os cruzamentos entre as linhas pretas (crossing), para a avaliação da atividade locomotora, e a quantidade de vezes em que o rato ficou apoiado

23 23 nas patas traseiras (rearing), para a avaliação da atividade exploratória Teste do Nado Forçado (TNF) Este teste consiste em dois dias de procedimentos no qual cada rato é posto em um recipiente cilíndrico com água a 23º C, a água deve ser suficiente para o animal não conseguir apoiar nem as patas nem a cauda no fundo do recipiente. No primeiro dia, denominado treino, os ratos foram forçados a nadar por 15min. No segundo dia (24h após o treino), cada animal é novamente forçado a nadar, entretanto por 5min. Foram avaliados os parâmetros de imobilidade, nos quais se incluem imobilidade total ou movimentos para manter a cabeça fora da água sem intenção de escapar (PORSOLT et al., 1977). Foram contabilizados os parâmetros nado, escalada e imobilidade, sendo avaliados somente no segundo dia durante os cinco minutos de teste Estresse Crônico Moderado (ECM) Neste estudo foram utilizados ratos Wistar adultos. A metodologia empregada para o estresse crônico moderado utiliza como estressores: 24h de privação de comida; 24h de privação de água; 1 e 3h de contenção; 1.5 e 2h de contenção a 4 C; nado forçado durante 10 ou 15min; exposição à luz estroboscópica de 40W que fica piscando em uma frequência de 60 vezes/min durante 150 a 210min e isolamento de 2 e 3 dias. Os estressores foram aplicados durante 40 dias em horários distintos todos os dias, para minimizar a previsibilidade. Sendo que, em quatro dias aleatórios os animais não foram submetidos a nenhum estressor (GAMARO et al., 2003). Os animais pertencentes ao grupo controle permaneceram em suas caixas durante 40 dias, não sendo submetidos a nenhum estressor e não sendo manipulados pelos pesquisadores.

24 24 Foi injetado, intraperitonealmente, em ratos Wistar, BS (500 mg/kg); IMI (10 mg/kg) ou solução salina (NaCl 0,09%), duas vezes por dia, durante 7 dias, após o protocolo de 40 dias de estresse crônico moderado. Todos os tratamentos foram administrados no volume de 1 ml/kg. Para o desenvolvimento deste experimento foram empregados 90 animais (n = 15 animais por grupo), separados em seis grupos: 1) não estressado/salina; 2) não estressado/bs; 3) não estressado/imi; 4) estressado/salina; 5) estressado/bs e 6) estressado/imi Neste modelo animal, foi realizado o TNF, o teste de consumo de sacarose (para avaliar anedonia) e o teste do campo aberto. Os animais foram submetidos ao teste do nado forçado e ao teste do campo aberto (ambos descritos anteriormente) 1h após a última administração de cada fármaco. O tratamento crônico com BS foi realizado durante o teste de anedonia, duas vezes ao dia, por sete dias, 1h antes da avaliação comportamental. Sendo que, diferentes animais foram usados em cada teste. Tabela 1 Cronograma dos agentes estressores que foram utilizados durante o tratamento. Dia de Estressor Duraçã tratamento utilizado o Dia 1 Privação 24h de água Dia 2 Privação 24h de comida Dia 3 Isolamento 24h Dia 4 Isolamento 24h Dia 5 Isolamento 24h

25 25 Dia 6 Exposição 3h à luz estroboscópica Dia 7 Privação 24h de comida Dia 8 Nado 10min forçado Dia 9 Contenção 1h Dia 10 Privação 24h de água Dia 11 Nenhum - estressor Dia 12 Nenhum - estressor Dia 13 Contenção 2h + frio Dia 14 Exposição 2.5h à luz estroboscópica Dia 15 Privação 24h de comida Dia 16 Nado 15min forçado Dia 17 Isolamento 24h Dia 18 Isolamento 24h Dia 19 Isolamento 24h Dia 20 Privação 24h de água Dia 21 Privação 24h de comida Dia 22 Exposição 3h à luz estroboscópica Dia 23 Contenção 2h Dia 24 Isolamento 24h Dia 25 Isolamento 24h Dia 26 Contenção 1.5h + frio Dia 27 Nado forçado 10min

26 26 Dia 28 Exposição 3.5h à luz estroboscópica Dia 29 Nenhum - estressor Dia 30 Privação 24h de comida Dia 31 Contenção 3h Dia 32 Exposição 2h à luz estroboscópica Dia 33 Privação 24h de água Dia 34 Contenção 2h + frio Dia 35 Nado 15min forçado Dia 36 Isolamento 24h Dia 37 Isolamento 24h Dia 38 Nenhum - estressor Dia 39 Exposição 3h à luz estroboscópica Dia 40 Nado forçado 10min Consumo de Sacarose (Anedonia) Após o protocolo de 40 dias de estresse, o teste do consumo de sacarose foi utilizado para avaliar a anedonia nos ratos. Os animais foram colocados no campo aberto. Este teste foi realizado no período da manhã (8:00hs às 12:00hs) os animais foram colocados no centro da caixa com dez Froot Loops (pellets Kellogg de trigo e amido de milho e sacarose). Os animais foram submetidos a cinco sessões de 3min cada, uma vez por dia, para se familiarizarem com este alimento (sessões de treino) e, em seguida, os animais foram expostos a

27 27 duas sessões de teste (sessões de teste), 3 min cada, e a quantidade de alimentos ingeridos foi medido (GAMARO et al., 2003). De acordo com Gamaro et al. (2003), foi estabelecido que, quando o animal comer parte da Froot Loops (isto é, 1/2, 1/3 ou 1/4), esta fração foi considerada como uma unidade. Além disso, nas duas sessões de teste, mas não nas sessões de treino, o consumo de sacarose foi feito com animais alimentados ad libitum (KATZ et al, 1981; GAMARO et al, 2003). A quantidade de Froot Loops consumidas em ratos não estressados e estressados foi expressa como a média das duas sessões de teste Privação Materna (PM) Nesse experimento foram utilizados ratos Wistar. A partir do primeiro dia pós-natal os filhotes foram privados da mãe 3 horas por dia, durante 10 dias. A privação consiste em retirar a mãe da caixa e manter os filhotes na caixa original, para que pudessem ficar na presença do odor materno. Os animais controles (não privados) não foram manipulados pelo pesquisador e permaneceram na gaiola original com sua mãe. O desmame aconteceu no 22 dia após o nascimento. Quando os animais atingiram a vida adulta (60 dias), tanto para os privados quanto para os não privados dos cuidados maternos, iniciou-se o tratamento com BS (500 mg/kg), IMI (10mg/kg) ou salina (NaCl 0,09%), intraperitonial, duas vezes por dia, durante 7 dias. Os tratamentos foram administrados num volume de 1 ml/kg. Os animais foram aleatoriamente divididos em grupos privados e não privados dos cuidados maternos antes do início do tratamento. Para desenvolver este estudo foram utilizados 60 animais (n=10 por grupo), separados em seis grupos: 1) não privado/salina; 2) não privado/imi; 3) não privado/bs; 4) privado/solução salina;

28 28 5) privado/imi e 6) privado/bs Os animais foram submetidos ao teste de nado forçado e ao teste do campo aberto (ambos descritos anteriormente) 1h após a última administração de cada fármaco Modelo Animal de Mania Induzida pela d-amph Para mimetizar uma crise aguda de mania foi administrado d-anfetamina (d-amph, 2mg/kg) durante 14 dias. Durante os 14 dias o grupo controle recebeu salina (NaCl 0.9%). Entre o 8 e o 14 dia os animais, salina (Sal) e d-amph, começaram a ser tratados, adicionalmente, com valproato (VPA, 200mg/kg), lítio (Li, 47,5 mg/kg), Butirato de Sódio (BS, 500 mg/kg) ou Sal. Para este experimento foram utilizados 80 animais (n=10 animais por grupo), divididos em 8 grupos experimentais: 1)Sal+Sal; 2) Sal+VP; 3) Sal+Li; 4) Sal+BS; 5) d-amph+sal; 6) d-amph+li; 7) d-amph+ VPA e 8) d-amph+bs No 15 dia foi administrado nos animais d-amph ou Sal e duas horas depois foi avaliada a atividade locomotora dos animais.

29 Modelo Animal de Mania Induzido por Ouabaina Procedimento Cirúrgico Os animais foram anestesiados com cloridrato de cetamina 80 mg/kg e xilasina 10 mg/kg intramuscular. No aparelho estereotáxico, foi removida a pele na região craniana do rato. Uma cânula guia de 9 mm foi implantada no ventrículo lateral a partir das seguintes coordenadas: 0,9 mm para trás do bregma, 1,5 mm à direita do bregma e 2,6 mm de profundidade. Em seguida, a fixação da cânula guia foi feita com acrílico dental. Após a cirurgia, aplicou-se o analgésico cloridrato de tramadol via intramuscular na dose de 10mg/kg. Os animais ficaram em recuperação da cirurgia durante os 3 dias seguintes Tratamento Os animais foram anestesiados com cloridrato de cetamina 90mg/kg e xilasina 90mg/kg intramuscular (IM). No aparelho estereotáxico, uma cânula de 9mm foi colocada, mediante as coordenadas, para a fixação da cânula no ventrículo. A administração intracebroventricular (ICV) de ouabaína (OUA) (10-3M em um volume de 5ul) ou liquido céfaloraquidiano artificial (LCR, em um volume de 5 ul) foi feita 72 horas após a cirurgia (JORNADA et al., 2010). No mesmo dia em que os ratos foram submetidos à administração ICV de ouabaína ou de LCR começaram a ser tratados com Li, VPA, BS ou Sal. O tratamento permaneceu durante 6 dias e no 7 dia foi avaliada a atividade locomotora dos animais. Para este experimento, foram utilizados 80 animais (n=10 animais por grupo), divididos em 8 grupos experimentais: 1) LCR +Sal; 2) LCR +VPA; 3) LCR +Li; 4) LCR +BS;

30 30 5) OUA+Sal; 6) OUA +Li; 7) OUA + VPA e 8) OUA +BS. 3.3 Analise Estatística Todos os dados foram analisados de acordo com a sua distribuição por meio do teste de Shapiro Wilk para a normalidade. A homogeneidade das variâncias entre os grupos foram avaliadas pelo teste de Levene. Os resultados foram apresentados como médias ± erro padrão. As diferenças entre os grupos experimentais foram determinadas pelo ANOVA de duas vias ou ANOVA de uma única via, de acordo com a distribuição dos grupos experimentais, seguido pelo teste de Tukey no post hoc. Sendo o valor de p < 0,05 considerado significativo.

31 31 4 RESULTADOS No presente estudo a ANOVA de uma via mostrou que a administração aguda de IMI ou BS produziram efeitos antidepressivos semelhantes no TNF [Imobilidade: F (2,67) = 323,38, p <0,001; Escalada: F (2,67) = 243,9, p <0,001; Natação: F (2,67) = 59,13, p <0,001]. A análise post hoc mostrou que IMI e BS produziram uma redução significativa do tempo de imobilidade e aumento do tempo de escalada no teste de TNF. A administração aguda de BS também aumentou o tempo de natação (Figura 1A). Além disso, não houve diferença no teste de campo aberto, indicando que os efeitos do IMI e do BS, no TNF, não foram devido ao aumento da atividade locomotora (Figura 1B).

32 32 Figura 1. Efeitos do agudo (A e B) e crónicos (C e D) Sal, IMI ou SB tratamento no teste de natação forçada e teste de campo aberto. Sal = salina, IMI = imipramina e SB = butirato de sódio. Os resultados são expressos como média ± SEM. As diferenças entre os grupos experimentais foi determinada por ANOVA de uma via, seguido pelo teste de Tukey post hoc. *P <0,001 em comparação com controles tratados com solução salina. # P <0,001, IMI comparado com o SB. Em seguida, avaliamos se o efeito antidepressivo do BS permaneceria após a administração sub-crônica (Figura 1C). ANOVA de uma via revelou que a administração sub-crônica (7 dias) de IMI ou BS produziu efeito antidepressivo no TNF [imobilidade: F (2,40) = 311,69, p <0,001; Escalada: F (2,40) = 54,67; Natação: F (2,40) = 30,33]. Análise post hoc indicou que IMI e BS produziram uma redução significativa no tempo de imobilidade, aumento no tempo de escalada e natação no TNF. Além disso, não houve diferença significativa no teste de campo aberto (Figura 1D).

33 33

34 34 Como observado na Figura 2A, os ratos expostos ao ECM, quando comparados com os ratos controles não estressados, exibiram uma redução no consumo de sacarose, o que indica um comportamento do tipo anedônico. Além disso, os ratos expostos ao ECM apresentaram aumento do tempo de imobilidade e diminuição do tempo de natação no TNF, indicativo de um comportamento tipo- depressivo (figura 2B). A administração crônica de IMI ou BS reverteu o déficit comportamental induzido pelos fatores estressores, tanto no teste de consumo de sacarose quanto no TNF. A administração de IMI ou BS não afetou o consumo de sacarose nos ratos controles não estressados. No entanto, a administração de IMI ou BS diminuiu o tempo de imobilidade e aumentou o tempo de escalada em ratos controles não estressados. Porém nos controles o tratamento com IMI ou BS não teve efeito sobre a atividade locomotora dos animais, indicando que a redução do tempo de imobilidade observada no TNF após o tratamento com IMI ou BS não foi em função de uma alteração na atividade locomotora (Figura 2C). A ANOVA de duas vias para a exposição ao ECM foram: [consumo de sacarose: F (1,84) = 71,64, p <0,001; Imobilidade: F (1,74) = 428,73, p <0,001; Escalada: F (1,74) = 2,71, p = 0,103; auto limpeza: F (1,74) = 109,76, p <0,001]; tratamento: [consumo de sacarose: F (2,64) = 40,72, p <0,001; Imobilidade: F (2,74) = 287,83; Escalada: F (2,74) = 312,74, p <0,001; auto limpeza: F (2,74) = 48,43, p <0,001], e exposição ao ACM versus interação com o tratamento: [consumo de sacarose: F (2,64) = 44,53, p <0,001; Imobilidade: F (2,74) = 83,94; escalada: F (2,74) = 1,62, p = 0,2; autolimpeza: F (2,74) = 30,93].

35 35

36 36 Figura 2. Efeitos do tratamento de IMI ou SB sobre o (A) consumo de sacarose, (B) Teste de Nado Forçado TNF e (C) teste de campo aberto nos ratos submetidos ao protocolo estresse crônico moderado (CMS). Controle = ratos não estressados, ECM = estresse crônico moderado, Sal = salina, IMI= imipramina e SB = butirato de sódio. Os resultados são expressos como média ± SEM. Diferenças entre os grupos experimentais foram determinadas pelo ANOVA de duas vias seguido pelo teste de Tukey post hoc. *P <0,001 em comparação com controles tratados com solução salina. # P <0,001 quando comparado com o grupo ECM + Sal. Os ratos submetidos à privação materna apresentaram aumento significativo do tempo de imobilidade e diminuição do tempo de natação, em comparação aos ratos controles, indicando que a privação materna induz comportamento do tipo depressivo em ratos (Figura 3A). Administração de IMI ou BS reverteu completamente o aumento do tempo de imobilidade induzido pela privação materna. A administração de IMI ou BS sozinhos também diminuiu o tempo de imobilidade dos ratos. Além disso, o IMI ou BS aumentou o tempo de escalada em ambos os ratos, privação e controle, mas IMI foi mais eficaz que BS. Por outro lado, somente o BS aumentou o tempo de natação em ratos do grupo controle, e a administração de IMI ou BS aumentou o tempo de natação dos ratos privados, mas somente o BS chegou ao nível dos