Desidratação de Glicídios em Presença de Ácidos Minerais Fortes

Transcrição

1 Bioquímica Experimental II LT006 Teoria da Prática: Propriedades Químicas de Glicídios Diferentemente dos aminoácidos que apresentam reações específicas baseadas principalmente na natureza química de sua cadeia lateral (radical R), os glicídios apresentam estruturas muito parecidas entre si o que torna quase impossível identifica-los isoladamente. Neste caso, o que se faz é caracterizar grupos de glicídios utilizando suas propriedades químicas comuns. As reações utilizadas nesta prática estão baseadas principalmente em duas dessas propriedades: Desidratação de glicídios em presença de ácidos minerais fortes Poder redutor Desidratação de Glicídios em Presença de Ácidos Minerais Fortes exoses e pentoses colocadas nestas condições são desidratadas, respectivamente a hidroximetilfurfural e furfural; esses compostos são capazes de se condensar com substâncias fenólicas, com aminas aromáticas, tiocompostos, uréia, etc. s complexos formados são algumas vezes coloridos e utilizados para a caracterização de certos grupos glicídicos. Neste caso situam-se: reação de Antrona, reação de Seliwanoff; reação de Bial. Reação de Antrona Teste geral para glicídios reagente da Antrona contém antranol em meio de S concentrado. calor liberado pela diluição do S é suficiente para que ocorra a reação. No caso de oligo e polissacarídeos, o S atua como catalisador de hidrólise convertendo-os a monossacarídeos (hexoses e pentoses) e também como agente desidratante levando à formação de hidroximetilfurfural e furfural que, em presença de Antranol, dão produtos de condensação coloridos. _ + _ hidroxi metil furfural antranol R R + composto verde azulado hidroximetilfurfural proveniente da desidratação de hexoses produz uma substância de coloração verde azulada relativamente estável enquanto que o furfural proveniente de pentoses fornece produto de cor análoga, mas que em alguns minutos se torna vermelho amarelado ou rubi. A exposição do hidroximetilfurfural por um intervalo de tempo longo a essas condições

2 Bioquímica Experimental II LT006 promove sua decomposição a ácido levulínico e ácido fórmico, o que redunda na formação de produtos de condensação escuros conhecidos como humina. utras substâncias orgânicas produzem descoloração do reagente e aparecimento de uma cor marrom, fruto de sua decomposição. teste de Antrona é muito sensível e pode ser usado, quando modificado, para quantificação de glicídios.. Reação de Seliwanoff Teste de diferenciação entre cetoses e aldoses A reação é feita com resorcinol em meio de l, à quente. As cetohexoses dão uma cor vermelha que se desenvolve rapidamente; as aldohexoses correspondentes reagem mais lentamente. Durante o tempo em que as cetohexoses são desidratadas e reagem com o resorcinol, fornecendo o produto de condensação vermelha, as aldohexoses dão apenas uma coloração rosa pálida. + cetohexose 3 hidroximetilfurfural resorcinol produto de coloração vermelha estrutura desconhecida teste de Seliwanoff pode ser modificado para ser utilizado quantitativamente. 3. Reação de Bial Teste para identificação de pentoses e certos ácidos urônicos (galacturônico, glicurônico, etc.) que se decompõem durante o aquecimento, em presença de +, formando pentoses. reagente consiste de orcinol em meio de l concentrado em presença de íons Fe 3+. furfural proveniente da desidratação de pentoses, quando aquecido em presença do reagente de Bial, dá uma cor verde. hidroximetilfurfural (hexoses) reage dando uma cor diferente (que vai de amarelo a marrom). 3 pentose furfural + orcinol ( metil, 3 dihidroxi benzeno) produto de coloração verde estrutura desconhecida

3 Bioquímica Experimental II LT006 teste de Bial foi modificado para permitir quantificar pentoses. Respondem também ao teste de Bial trioses e o ácido -cetoaldônico. As cetoheptoses dão uma cor púrpura enquanto que as cetohexoses e metilpentoses fornecem uma solução de cor laranja onde, posteriormente, em repouso, forma-se um precipitado de cor verde escura. Ácidos urônicos: produtos de oxidação do grupo álcool primário dos glicídios. Ácidos aldônicos: produtos de oxidação da carbonila aldeídica dos glicídios. Poder Redutor s açúcares contêm grupos aldeídos e cetonas capazes de reduzir sais de metais pesados; desses os mais usados são, geralmente, os sais de u +. princípio fundamental de todos os procedimentos analíticos que utilizam u + é sua dissolução em meio alcalino, em presença de ácidos orgânicos - como ácido cítrico e o ácido tartárico - capazes de formar complexo. Também podem ser empregados outros ácidos orgânicos como EDTA, ácido láctico e ácido trihidroxiglutárico, ou um ácido sacárico. Ácidos sacáricos são o produto da oxidação da carbonila aldeídica e do grupamento álcool primário dos glicídios sendo, portanto, ácidos dicarboxílicos. A reação de formação do complexo ocorre, em geral, em meio fortemente alcalino e isto promove profundas modificações na estrutura do açúcar. s açúcares, individualmente, apresentam poder redutor diferente sobre o u + ; isto significa que dois tipos de hexoses, numa mesma concentração fornecem quantidades diferentes de óxido cuproso (produto final da redução). De qualquer forma, os métodos podem ser adaptados de modo a se tornarem reprodutíveis e a haver proporcionalidade entre a quantidade de u produzido e a concentração de glicídios presente dentro de certo limite (certa faixa). A quantidade de íons cobre reduzida pelos diferentes glicídios é função do p, da temperatura, da concentração e tipo de glicídios e do tipo de íon orgânico complexante. á diversos métodos para determinação do teor de u, como, por exemplo, gravimetria e colorimetria. No último caso, o u formado é dissolvido num excesso de reagente como fosfomolibdato, fosfotungstato ou arsênio-molibdato, formando-se um complexo de cor azul. Este procedimento é muito adequado para verificação de glicídios em materiais biológicos. Dentre os testes baseados no poder redutor dos glicídios, podemos destacar os testes de Benedict e de Barfoed modificado.. Teste de Benedict Teste geral para glicídios redutores reagente consiste de uma única solução onde estão presentes íons de u +, citrato e carbonato de sódio. A reação é complexa e influenciada por uma série de fatores; podendo ser esquematizada por: u + + glicídio composto oxidado + u (precipitado vermelho) As transformações intermediárias sofridas pelo glicídio não são completamente conhecidas, mas foram identificados produtos como ácido metassacaríneos e osonas, resultantes de reações de oxirredução intramoleculares e rearranjos. 3

4 Bioquímica Experimental II LT006 ácido metas s acaríneo osona ácido dicarboxílico (ácido s acárico ou s acaríneo). Teste de Barfoed modificado Teste de diferenciação entre monossacarídeos e dissacarídeos redutores A reação é feita usando-se acetato de cobre em meio de ácido láctico ou de ácido acético (Reagente de Barfoed), a quente e por 30 segundos e o produto formado nesta primeira etapa é posteriormente revelado com solução de fosfomolibdato. Só os monossacarídeos darão um produto de coloração azul. Esta diferenciação pode ser explicada pelo fato de que, em meio ácido, a mutarrotação ocorre em velocidade cerca de 000 vezes menor do que em meio alcalino. Dentro de um curto intervalo de tempo os monossacarídeos, devido à sua estrutura, têm maior reatividade e talvez formem o enediol (um dos possíveis responsáveis pelo poder redutor dos glicídios) mais fácil e rapidamente que os dissacarídeos. A adição posterior do ácido fosfomolíbdico leva à formação de um complexo corado de cor azul intensa. u + + glicídio u + composto oxidado (ppt.) 3 P.Mo 3 omplexo de cor azul de estrutura desconhecida Deve-se atentar para o fato de que o teste também dará positivo se a concentração dos dissacarídeos redutores for muito maior do que a dos monossacarídeos. Teste com Iodo Teste de identificação do amido amido é composto de dois tipos de cadeia: a amilose e a amilopectina. Foi verificado que a amilose é capaz de formar um complexo de inclusão de coloração azul com o I. grau de adsorção do I, a partir de uma solução diluída de I -KI, pela amilose nativa é 9-0%, enquanto que a amilopectina adsorve 0,%. Para que a cor azul apareça é necessário que a amilose tenha no mínimo 0 resíduos (unidades) de glicose. adeias pequenas de amilose ou amilopectina também adsorvem o I, só que é necessário usar soluções mais concentradas de I -I -. Essas cadeias dão cores que variam entre o vermelho-marrom e o amarelo.

5 Bioquímica Experimental II LT006 mecanismo da reação envolve a inclusão de um arranjo linear de poli I -I -, na hélice da amilose. I parece interagir através de valências secundárias e sabe-se que os íons I - são necessários mas se desconhece a exata natureza do arranjo do poli I -I -. A estimativa do teor de amilose presente no amido pode ser feita através da determinação do I livre por titulação ou pela medida da intensidade de absorção do complexo azul num dado comprimento de onda, relacionando-se então com uma curva padrão. Infelizmente a cor azul depende não só do peso molecular da amilose, como também da sua forma de extração (impurezas presentes) e, portanto este método tem aplicabilidade restrita. A amilopectina dá uma cor violeta ou avermelhada com I. As dextrinas (formadas a partir da ação da β-amilase sobre a amilopectina) são muito ramificadas e produzem uma cor vermelha, assim como o glicogênio (composto apenas de amilopectina, ainda mais ramificada do que a existente no amido). As dextrinas de pequeno peso molecular não dão cor com I. A cor produzida pela reação com I e amilopectina é usada para indicar o seu grau de ramificação. Reação Propriedade Reagentes Aplicação Antrona Antrona + S Identificação de Desidratação com ácido glicídios Seliwanoff forte seguido de condensação com derivado Resorcinol + l conc. Diferenciação entre cetose e aldose fenólico Bial rcinol + L + Fel 3 Identificação de pentoses e certos ácidos urônicos Benedict Barfoed (modificado) xidação do glicídio com íons U + em meio us + citrato de sódio + carbonato de sódio alcalino ou ácido ) Acetato cúprico + ácido láctico ) Ácido fosfomolíbdico Identificação de glicídios redutores Diferenciação entre monossacarídeo e dissacarídeos redutores Iodo Formação de complexo de inclusão com a amilose I + KI (Lugol) Identificação de amido Referências: Manual de ursos Práticos em Bioquímica. Departamento de Bioquímica, Instituto de Química, UFRJ. Fundamentos de Bioquímica Experimental. José Raul isternas, José Varga, smar Monte. ª ed., Editora Atheneu, São Paulo, 00. LENINGER - Principles of Biochemistry David L. Nelson, Michael M. ox. Fifth Edition. W.. Freeman and ompany, New York, 008.

6 Bioquímica Experimental II LT006 Anexo D - Aldoses com 3 a 6 átomos de carbono _ _ D-gliceraldeído Legenda: D-eritrose D- treose D-ribose D-arabinose D-xilose D-lixose D-alose D-altrose D-glicose D-manose D-gulose D-idose D-galactose D-talose bservações: ) As setas indicam as relações estereoquímicas, não as vias biossintéticas. ) A configuração em torno do distingue os membros de cada par de monossacarídeos. 3) As formas L correspondentes a esses açúcares são suas imagens especulares. 6

7 Bioquímica Experimental II LT006 Anexo D - etoses com 3 a 6 átomos de carbono Diidroxiacetona Legenda: = D-eritrulose D-ribulose D-xilulose D-psicose D-frutose D-sorbose D-tagatose bservação: A configuração em torno do 3 distingue os membros de cada par. 7

8 Bioquímica Experimental II LT006 Anexo 3 Estrutura cíclica de oses Estrutura cíclica de Tollens onfiguração de aworth D-glicose forma aldeído livre hidrato de aldeído após ciclização: hemiacetal forma glucopiranose (ponte osídica -) α-d-glucopiranose = Estrutura cíclica de Tollens onfiguração de aworth 6 3 D-frutose forma cetona livre hidrato de cetona após ciclização: hemicetal forma frutofuranose (ponte osídica -) α-d-frutofuranose bservação: Quando um monossacarídeo se cicliza, o carbono da carbonila, denominado carbono anomérico, torna-se um centro quiral com duas configurações possíveis. 8

9 Bioquímica Experimental II LT006 Anexo D i s s a c a r í d e o s L a c t o s e e x t r e m i d a d e r e d u t o r a ( c a r b o n o a n o m é r i c o l i v r e ) D - g a l a c t o s e ( β ) D - g l i c o s e ( α ) p o n t e o s í d i c a β -, M a l t o s e e x t r e m i d a d e r e d u t o r a ( c a r b o n o a n o m é r i c o l i v r e ) D - g l i c o s e ( α ) D - g l i c o s e ( α ) p o n t e o s í d i c a α -, S a c a r o s e o u 6 3 D - g l i c o s e ( α ) β - D - f r u t o s e p o n t e o s í d i c a α -, 6 3 9

10 Bioquímica Experimental II LT006 Roteiro de Prática: Reações Químicas de Glicídios. MATERIAL Soluções de glicídios na concentração de 0,M Suspensões: Dextrina 0,% arboximetil celulose (M) 0,% Agar (*) 0,% Amido 0,% Ácido poligalacturônico 0,% Solução de furfural,3 µg/ml Solução de ácido glutâmico 0,M Reagente de Antrona: Antrona em S concentrado Reagente de Bial: orcinol em l concentrado Reagente de Seliwanoff: resorcinol em l Reagente de Benedict: us em meio alcalino Reagente de Barfoed modificado: us em meio levemente ácido Solução de Lugol: I e I - Banho termostatado a 00º. BJETIV aracterizar grupos de glicídios a partir de suas propriedades químicas 3. PREDIMENT a) Teste de Antrona Em tubo de ensaio colocar 0, ml das soluções a serem testadas. Adicionar cuidadosamente ml do reagente de antrona. Fazer o teste com soluções de glicose 0,M, sacarose 0,M, ácido glutâmico 0,M, amido 0,% e M 0, %. Fazer um branco de reação com 0, ml de água destilada. A reação é praticamente imediata e o teste é considerado positivo se apresentar cor verde intensa. bservar: a) com que glicídio aparece o anel verde b) em que tubo a coloração verde é mais intensa c) o aquecimento provocado pela diluição de S na água, tocando a base dos tubos com cuidado. Anotar os resultados na tabela anexa. b) Teste de Seliwanoff Em tubo de ensaio colocar 0, ml das soluções a serem testadas. (*) Polissacarídeo de estrutura não completamente estabelecida contém D-L-galactose com radicais sulfato. 0

11 Bioquímica Experimental II LT006 Adicionar ml do reagente de Seliwanoff. Aquecer em banho termostatado a 00º por 3 minutos. Fazer o teste com soluções de glicose 0,M, frutose 0,M, sacarose 0,M e lactose 0,M. Fazer um branco de reação com 0, ml de água destilada. teste é considerado positivo se apresentar cor vermelha. bservar: a) em que tubo(s) aparece a cor e o tempo necessário para que isto ocorra. b) a coloração obtida nos outros tubos. Anotar os resultados na tabela anexa. c) Teste de Bial Em tubo de ensaio colocar 0, ml das soluções a serem testadas. Adicionar ml do reagente de Bial. Aquecer em banho termostatado a 00º por minutos. Fazer o teste com soluções de glicose 0,M, arabinose 0,M, ácido poligalacturônico 0,M e furfural,3 µg/ ml. Fazer um branco de reação com 0, ml de água destilada. teste é considerado positivo se apresentar cor verde ou verde azulada. bservar: a) em que tubo(s) há aparecimento imediato da cor verde b) a coloração obtida nos outros tubos. Anotar os resultados na tabela anexa. d) Teste de Benedict Em tubo de ensaio colocar 0, ml das soluções a serem testadas. Adicionar ml do reagente de Benedict. Aquecer em banho termostatado a 00º por minutos. Fazer o teste com soluções de glicose 0,M, frutose 0,M, sacarose 0,M e lactose 0,M e amido 0,%. Fazer um branco de reação com 0, ml de água destilada. teste é considerado positivo se formar um precipitado vermelho. bservar: a) em que tubo(s) verifica-se a formação do precipitado. b) em que tubo(s) não há formação de precipitado. Anotar os resultados na tabela anexa. e) Teste de Barfoed modificado Em tubo de ensaio colocar 0, ml das soluções a serem testadas. Adicionar 0, ml da solução de Barfoed.

12 Bioquímica Experimental II LT006 Aquecer em banho termostatado a 00º por 30 segundos. Resfriar. Adicionar 0, ml da solução de Barfoed. Agitar levemente para misturar os reagentes Fazer o teste com soluções de glicose 0,M, lactose 0,M e sacarose 0,M. Fazer um branco de reação com 0, ml de água destilada. teste é considerado positivo quando apresentar cor azul intensa. bservar: a) em que tubo(s) ocorre o desenvolvimento de cor azul. b) em que tubo(s) ocorre coloração azul pálido. Anotar os resultados na tabela anexa. f) Teste com Iodo Em tubo de ensaio colocar ml das soluções a serem testadas. Adicionar 0, ml da solução de Lugol (I + KI) Fazer o teste com suspensões de amido 0,%, dextrina 0,%, M 0,%, agar 0,% Fazer um branco de reação com ml de água destilada teste é considerado positivo quando apresenta cor azul intensa bservar: a) em que tubo aparece o complexo de cor azul. b) qual(is) a(s) cor(es) que aparece(m) nos outros tubos. Anotar os resultados na tabela anexa.

13 Bioquímica Experimental II - BQ Tabela de Resultados Teste Substâncias Testadas bservações Antrona Seliwanoff Bial Benedict Barfoed (modificado) Iodo glicose sacarose amido M ácido glutâmico glicose frutose sacarose lactose glicose arabinose ácido poligalacturônico furfural glicose frutose sacarose lactose amido glicose lactose sacarose amido dextrina M agar 3