MECANISMOS MOLECULARES DE RESISTÊNCIA

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1 MECANISMOS MOLECULARES DE RESISTÊNCIA À INSULINA NA SÍNDROME METABÓLICA HENRIQUE GOTTARDELLO ZECCHIN, JOSÉ BARRETO CAMPELLO CARVALHEIRA, MARIO JOSÉ ABDALLA SAAD Departamento de Clínica Médica Faculdade de Ciências Médicas Universidade Estadual de Campinas UNICAMP Endereço para correspondência: Cidade Universitária Zeferino Vaz Barão Geraldo CEP Campinas SP A insulina é um hormônio anabólico com efeitos metabólicos potentes. Os eventos que ocorrem após a ligação da insulina são específicos e estritamente regulados. Definir as etapas que levam à especificidade desse sinal representa um desafio para as pesquisas bioquímicas, todavia podem resultar no desenvolvimento de novas abordagens terapêuticas para pacientes que sofrem de estados de resistência à insulina, especialmente a síndrome metabólica, que compreende o diabetes do tipo 2. O receptor de insulina pertence a uma família de receptores de fatores de crescimento que têm atividade tirosina quinase intrínseca. Após a ligação da insulina, o receptor sofre autofosforilação em múltiplos resíduos de tirosina. Isso resulta na ativação da quinase do receptor e na conseqüente fosforilação em tirosina de uma família de substratos do receptor de insulina (IRS). De forma similar a outros fatores de crescimento, a insulina usa fosforilação e interações proteína-proteína como ferramentas essenciais para transmitir o sinal. Dessa forma, o sinal é transmitido do receptor ao efetor final, promovendo a translocação de vesículas contendo transportadores de glicose (GLUT4) do conteúdo intracelular para a membrana plasmática, a ativação da síntese de glicogênio e de proteínas, e a transcrição de genes específicos. Palavras-chave: fosforilação em tirosina, tirosina quinase, ação insulínica, resistência à insulina, receptor de insulina, substratos do receptor de insulina. (Rev Soc Cardiol Estado de São Paulo 2004;4:574-89) RSCESP (72594)-1447 INTRODUÇÃO Após a descoberta da insulina por Banting e Best, em 1922 (1), o diabetes foi considerado uma doença causada exclusivamente pela deficiência da secreção desse hormônio. Dez anos depois, Himsworth notou variações nas respostas de pacientes diabéticos à insulina e sugeriu que a redução da sensibilidade à insulina, e não sua deficiência, constituía o mecanismo fisiopatológico central em muitos diabéticos (2). Essa idéia permaneceu desacreditada até o desenvolvimento do ra- dioimunoensaio (3-5), que comprovou definitivamente que pacientes com diabetes iniciado na vida adulta tinham, na realidade, altos níveis de insulina circulante. Estudos posteriores (6-9) sedimentaram as bases para a idéia de que a resistência à insulina é essencial para o desenvolvimento do diabetes do tipo 2. Clinicamente, a síndrome, também conhecida por síndrome X ou síndrome metabólica, compreende um espectro de distúrbios, com a hiperglicemia representando uma das características mais importantes do diagnóstico. Essas alterações 574 Rev Soc Cardiol Estado de São Paulo Vol 14 N o 4 Julho/Agosto de 2004

2 metabólicas incluem resistência à insulina com ou sem diabetes melito do tipo 2, hipertensão arterial, obesidade (especialmente central ou androgênica), dislipidemia, disfunção endotelial e doença cardiovascular acelerada, além da presença de partículas pequenas e densas de LDL, hipercoagulabilidade, hiperuricemia e síndrome de ovários policísticos (anovulação crônica e hiperandrogenismo) (9, 10). A anormalidade central associada à síndrome metabólica parece ser a resistência dos tecidos periféricos à insulina, a qual pode ser definida como um estado de resposta biológica subnormal aos níveis circulantes de insulina. A insulina é um hormônio polipeptídico anabólico produzido pelas células beta do pâncreas, cuja síntese é ativada pelo aumento dos níveis circulantes de glicose e aminoácidos após as refeições. A insulina age em vários tecidos periféricos, incluindo músculo, fígado e tecido adiposo. Seus efeitos metabólicos imediatos incluem: aumento da captação de glicose, principalmente nos tecidos muscular e adiposo, aumento da síntese de proteínas, ácidos graxos e glicogênio, bem como bloqueio da produção hepática de glicose (via diminuição da neoglicogênese e glicogenólise), da lipólise e da proteólise. Além disso, a insulina tem efeitos tardios na expressão de genes e síntese protéica, assim como na proliferação e na diferenciação celulares. Outras funções da insulina incluem o aumento da produção de óxido nítrico no endotélio, a prevenção da apoptose ou morte celular e a promoção da sobrevida celular. Para que sejam compreendidos os mecanismos moleculares da resistência à insulina da síndrome metabólica, é necessário inicialmente descrever como a insulina transmite seu sinal no meio intracelular desde seu receptor até os efetores finais. A compreensão das etapas moleculares da sinalização de insulina pode proporcionar novas abordagens terapêuticas para estados, incluindo obesidade, diabetes melito do tipo 2, hipertensão arterial e intolerância à glicose associada a diversas endocrinopatias. ETAPAS INICIAIS DA SINALIZAÇÃO INSULÍNICA O receptor de insulina A Figura 1 mostra um esquema simplificado das etapas de sinalização intracelular desde a ligação da insulina a seu receptor até a ativação do transporte de glicose. Os eventos que ocorrem após a ligação da in- Figura 1. Vias de sinalização da insulina. Rev Soc Cardiol Estado de São Paulo Vol 14 N o 4 Julho/Agosto de

3 sulina a seu receptor são altamente regulados e específicos (11). A sinalização intracelular da insulina começa com sua ligação a um receptor específico de membrana, uma proteína heterotetramérica com atividade quinase, composta por duas subunidades alfa e duas subunidades beta, que atua como uma enzima alostérica na qual a subunidade alfa inibe a atividade tirosina quinase da subunidade beta. A ligação da insulina à subunidade alfa permite que a subunidade beta adquira atividade quinase, levando à alteração conformacional e à autofosforilação do receptor nas subunidades beta em múltiplos resíduos de tirosina (1158, 1162, 1163), o que aumenta ainda mais sua atividade quinase (12-15). Os substratos do receptor de insulina Uma vez ativado, o receptor de insulina fosforila vários substratos protéicos em tirosina. Atualmente, dez substratos do receptor de insulina já foram identificados. Quatro desses pertencem à família dos substratos do receptor de insulina, as proteínas IRS (16). Outros substratos incluem Shc, Gab-1, p60 dok, Cbl, JAK2 e APS (11, 17-19). A fosforilação em tirosina das proteínas IRS cria sítios de reconhecimento para moléculas contendo domínios com homologia a Src 2 (SH2). Dentre elas destaca-se a fosfatidilinositol 3-quinase (PI 3-quinase). As funções fisiológicas do IRS-1 e do IRS-2 foram estabelecidas por meio da produção de camundongos sem os genes que codificam esses substratos (camundongos knockout para IRS-1 e IRS-2). O camundongo que não expressa IRS-1 apresenta resistência à insulina e retardo de crescimento, mas não é hiperglicêmico (20). Foi sugerido que o IRS-2 poderia compensar parcialmente a ausência de IRS-1, o que explicaria o fenótipo sem hiperglicemia do camundongo knockout para IRS-1. O camundongo que não expressa o IRS-2 foi gerado há alguns anos (21) e apresenta um fenótipo diferente do camundongo sem IRS-1: hiperglicemia acentuada decorrente de diversas anormalidades na ação da insulina nos tecidos periféricos e falência da atividade secretória das células beta acompanhada de redução significativa da massa de células beta pancreáticas. Em contraste, camundongos knockout para IRS-3 e IRS-4 têm crescimento e metabolismo de glicose quase normais (22, 23). Inibição da sinalização do receptor de insulina O receptor de insulina, além de ser fosforilado em tirosina, também pode ser fosforilado em serina, o que atenua a transmissão do sinal pela diminuição da capacidade do receptor em se fosforilar em tirosina após estímulo com insulina (24). Essas fosforilações inibitórias causam feedback negativo na sinalização insulínica e podem provocar resistência à insulina (25). Estudos recentes indicam que a resistência à insulina induzida pela obesidade pode ser decorrente da ativação seqüencial da proteína quinase C (PKC) e da quinase inibidora do fator nuclear kb (IKkB); entretanto, os detalhes dessa via de sinalização ainda não são claros (26, 27). A ação da insulina também é atenuada por proteínas fosfatases de tirosina, que catalisam a rápida desfosforilação do receptor de insulina e de seus substratos. Várias proteínas fosfatases de tirosina foram identificadas; dentre elas, destaca-se a PTP1B. Camundongos knockout para PTP1B têm aumento da fosforilação em tirosina do receptor de insulina e das proteínas IRS no músculo; conseqüentemente, apresentam aumento da sensibilidade à insulina (28). Além disso, camundongos PTP1B -/- também são resistentes à obesidade induzida por dieta, sugerindo que o cérebro pode ser um importante local de ação da insulina e implicando a PTP1B como alvo terapêutico potencial no diabetes e na obesidade. A PI 3-quinase e a proteína quinase B (PKB/Akt) A PI 3-quinase é importante na regulação da mitogênese, na diferenciação celular e no transporte de glicose estimulado pela insulina (29-32). Atualmente, essa é a única molécula intracelular considerada essencial para o transporte de glicose (33). A PI 3-quinase foi originalmente identificada como um dímero composto de uma subunidade catalítica (p110) e uma subunidade regulatória (p85). A ligação dos sítios YMXM e YXXM (em que Y = tirosina, M = metionina e X = qualquer aminoácido) fosforilados das proteínas IRS ao domínio SH2 da subunidade p85 da PI 3-quinase ativa o domínio catalítico associado da subunidade p110 (34). A enzima catalisa a fosforilação dos fosfoinositídeos na posição 3 do anel de inositol, produzindo fosfatidilinositol-3-fosfato, fosfatidilinositol-3,4-difosfato e fosfatidilinositol-3,4,5-trifosfato (35). Este último produto liga-se aos domínios PH ( pleckstrin homology ) de diversas moléculas sinalizadoras, alterando sua atividade e localização subcelulares (35). Além disso, a PI 3-quinase também possui atividade serina-quinase; e como suas duas subunidades podem interagir com outras proteínas sinalizadoras, estudos recentes sugerem que essa enzima pode ser importante na ação da insulina independentemente da produção de fosfatidilinositol-3,4,5- trifosfato (36). O produto fosfatidilinositol-3,4,5-trifosfato gerado pela PI 3-quinase pode regular a PDK-1 ( phosphoinositide-dependent kinase 1 ), uma serina/treonina quinase que fosforila e ativa outra serina/treonina quinase 576 Rev Soc Cardiol Estado de São Paulo Vol 14 N o 4 Julho/Agosto de 2004

4 conhecida por Akt ou PKB (37). Akt possui um domínio PH que interage diretamente com fosfatidilinositol-3,4,5-trifosfato, promovendo o direcionamento da proteína para a membrana celular, bem como sua atividade catalítica. Seus efeitos são dependentes da ativação de várias quinases intracelulares envolvidas na transmissão do sinal de insulina até a captação de glicose, a síntese de glicogênio e a síntese protéica. Além de fosforilar a Akt, há evidências de que a PDK-1 seja capaz de, em resposta à insulina, fosforilar isoformas atípicas da PKC (ζ e λ) envolvidas na síntese protéica e no transporte de vesículas de GLUT4 para a membrana celular para promover a captação de glicose (38-42). Isso demonstra que o transporte de glicose pode ser mediado por diferentes vias de sinalização intracelular (Akt e PKCζ/λ)); essa diversidade de sinalização pode abrir mecanismos compensatórios em casos de mutações afetando a Akt ou isoformas da PKC. Permanecem obscuros os mecanismos pelos quais as etapas iniciais de sinalização da insulina convergem para as vesículas que contêm GLUT4, incitando seu transporte para a membrana celular. No jejum, GLUT4 é continuamente reciclado entre a membrana celular e os vários compartimentos intracelulares. Na presença do estímulo da insulina, a taxa de exocitose das vesículas contendo GLUT4 aumenta intensamente, além de ocorrer pequena redução da taxa de internalização. A exocitose estimulada pela insulina é similar à exocitose de vesículas sinápticas (43, 44). As vesículas de GLUT4, em particular, contêm as proteínas V-SNARE, VAMP2 e VAMP3, que fisicamente interagem com seus pares t-snare (sintaxina 4 e SNAP23) na membrana celular durante a translocação das vesículas de GLUT4. Apesar de essas interações serem essenciais para a translocação do GLUT4, nenhuma dessas proteínas parece ser alvo da insulina. No entanto, pode-se especular que alterações específicas dos complexos de proteínas SNARE, que atuam paralelamente à via da PI 3-quinase, possam contribuir para a resistência à insulina. A via CAP/Cbl Além da ativação da PI 3-quinase, outros sinais também podem ser necessários para que a insulina estimule o transporte de glicose (11). Essa segunda via envolve a fosforilação do protooncogene c-cbl (45) e é aparentemente independente da ativação da PI 3-quinase. Na maioria dos tecidos sensíveis à insulina, Cbl está associado com a proteína adaptadora CAP ( Cbl-associated protein ) (46). Após a fosforilação, o complexo Cbl-CAP migra para a membrana celular e interage com a proteína adaptadora CrkII, que também está constitutivamente associada com a proteína C3G (47, 48). A C3G é uma proteína trocadora de nucleotídeos que catalisa a troca de GDP por GTP da proteína TC10, ativando-a. Uma vez ativada, a TC10 desencadeia um segundo sinal para a translocação da proteína GLUT4 para a membrana celular, em paralelo à ativação da via da PI 3-quinase (48). Recentemente foi demonstrado que a insulina estimula agudamente a fosforilação em tirosina de Cbl e sua associação com a CAP no tecido adiposo de animais normais, e também que essa via pode participar do controle da adiposidade em modelos animais (49). Cascatas de fosforilação estimuladas pela insulina Semelhante a outros fatores de crescimento, a insulina estimula a mitogen-activated protein (MAP) quinase. Essa via inicia-se com a fosforilação das proteínas IRS e/ou Shc, que interagem com a proteína Grb2 (50). A Grb2 está constitutivamente associada à SOS, proteína que troca GDP por GTP da Ras, ativando-a. A ativação da Ras requer a participação da SHP2. Uma vez ativada, a Ras estimula a fosforilação em serina da cascata da MAP quinase, o que estimula a proliferação e a diferenciação celulares (51). O bloqueio farmacológico dessa via previne a ação da insulina no crescimento celular, mas não tem efeito nas ações metabólicas do hormônio (52). A insulina aumenta a síntese e bloqueia a degradação de proteínas por meio da ativação da mtor. Essa proteína controla a translação de proteínas diretamente por meio da fosforilação da p70-ribossomal S6 quinase (p70rsk), a qual ativa a síntese ribossomal de proteínas pela fosforilação da proteína S6 (52). A mtor também fosforila a PHAS1, que aumenta a síntese protéica via aumento da translação de proteínas (53). Diversos estudos têm demonstrado que a ativação da via da MAP quinase pela insulina não está reduzida no diabetes do tipo 2 e em outros estados de resistência à insulina, podendo até mesmo estar aumentada (54-56). Possivelmente assim a hiperinsulinemia crônica, à qual os tecidos estão expostos nesses estados, exerceria efeitos deletérios sobre o crescimento celular na vasculatura, resultando em doença cardiovascular. Regulação da síntese de glicogênio A insulina inibe a produção e a liberação de glicose no fígado por meio do bloqueio da neoglicogênese e da glicogenólise (Fig. 2). A insulina estimula o acúmulo de glicogênio pelo aumento do transporte de glicose no músculo e a síntese de glicogênio no fígado e no músculo. Este último efeito é obtido via desfosforilação Rev Soc Cardiol Estado de São Paulo Vol 14 N o 4 Julho/Agosto de

5 livres liberados da gordura visceral (61). O fluxo direto de ácidos graxos na veia porta para o fígado modula a sensibilidade à insulina nesse órgão, regulando a produção de glicose. Regulação da síntese e degradação de lipídios A homeostase de lipídios em células de vertebrados é regulada por uma família de fatores de transcrição designada sterol regulatory element-binding proteins (SREBP) (Fig. 3). SREBPs ativam diretamente a expressão de aproximadamente 30 genes que se de- Figura 2. Regulação do metabolismo de glicose no fígado. da glicogênio-sintetase. Após estímulo com insulina, a Akt fosforila e inativa a GSK-3, o que diminui a taxa de fosforilação da glicogênio-sintetase, aumentando sua atividade (57). A insulina também ativa a proteína fosfatase 1, por um processo dependente da PI 3-quinase, que desfosforila a glicogênio-sintetase diretamente (58). Na neoglicogênese, a insulina inibe diretamente a transcrição de genes que codificam a fosfoenolpiruvato-carboxiquinase (PEPCK), enzima- chave no controle desse processo. O hormônio também diminui a taxa de transcrição do gene que codifica a frutose-1,6-bifosfatase e a glicose 6-fosfatase e aumenta a transcrição de genes de enzimas glicolíticas, como a glicoquinase da piruvato quinase (59, 60). As vias de sinalização que regulam a transcrição desses genes permanecem desconhecidas, mas envolvem a Akt e fatores de transcrição da família forkhead e o coativador do PPARy, PGC-1. A insulina também altera a quantidade de ácidos graxos dicam à síntese e captação de colesterol, ácidos graxos, triglicérides e fosfolipídios, assim como a de NA- DPH, um co-fator necessário para a síntese dessas moléculas (62-65). No fígado, três SREBPs regulam a produção de lipídios. SREBP-1c aumenta preferencialmente a transcrição de genes envolvidos na síntese de ácidos graxos, entre eles a acetil-coa carboxilase (ACC), que converte a acetil-coa em malonil-coa, e a ácido graxo-sintetase (FAS), que converte a malonil-coa em palmitato. Uma ação clássica da insulina é estimular a síntese de ácidos graxos no fígado em períodos de excesso de carboidratos. Várias evidências sugerem que esses efeitos da insulina são mediados pelo au- 578 Rev Soc Cardiol Estado de São Paulo Vol 14 N o 4 Julho/Agosto de 2004

6 mento de SREBP-1c (66-68). In vivo, a quantidade total de SREBP-1c no fígado é reduzida pelo jejum, que suprime a secreção de insulina, e aumenta com a realimentação (69, 70). De forma semelhante, os níveis de mrna de SRE- BP-1c diminuem em animais com diabetes induzido por estreptozotocina e aumentam após tratamento com insulina. A hiperexpressão de SREBP-1c no fígado de animais transgênicos previne a redução do mrna das enzimas lipogênicas. Muitos indivíduos com obesidade e resistência à insulina apresentam esteatose hepática. As evidências indicam que a esteatose hepática da resistência à insulina é causada pelo acúmulo de SREBP-1c, que está elevado em resposta aos altos níveis circulantes de insulina. De maneira semelhante, os níveis de SRE- BP-1c estão elevados no fígado de camundongos ob/ ob (70, 71). Apesar da presença nos tecidos periféricos, a insulina continua a ativar a transcrição de SREBP-1c no fígado desses camundongos. O nível elevado de SREBP-1c nuclear aumenta a expressão de genes lipogênicos, a síntese de ácidos graxos e o acúmulo de triglicérides (71, 72). Em adipócitos a insulina também reduz a lipólise por meio da inibição da lipase hormônio-sensível (73). Essa enzima é ativada pela PKA (proteína quinase A). A insulina inibe a atividade da PKA, ativando a fosfodiesterase AMP cíclico específica (PDE3B), que reduz os níveis de AMP cíclico nos adipócitos (74). A ativação da PDE3B é dependente e distal à ativação de PI 3-quinase e Akt pela insulina. O que causa resistência à insulina? A resistência à insulina da obesidade e do diabetes do tipo 2 é caracterizada por alterações em diversos pontos, com redução da concentração e da atividade quinase do receptor, da concentração e da fosforilação do IRS-1 e -2, da atividade da PI 3-quinase, da translocação dos transportadores de glicose (GLUTs) e da atividade das enzimas intracelulares (11). Isso pode ocorrer em paralelo à manutenção da ativação normal da via mitogênica, representada pela MAP quinase (54-56). Fatores genéticos e adquiridos podem influenciar a sensibilidade à insulina. Defeitos genéticos no receptor de insulina são relativamente raros, mas represen- Figura 3. Regulação do metabolismo lipídico no fígado. Rev Soc Cardiol Estado de São Paulo Vol 14 N o 4 Julho/Agosto de

7 tam as formas mais graves, e são exemplificados pelo leprechaunismo, pela síndrome de Rabson Mendenhall e pela síndrome de resistência à insulina tipo A (6, 75). Diferenças na apresentação clínica podem ser decorrentes da gravidade do defeito genético, da capacidade dos receptores mutantes de formar híbridos com outros receptores (como, por exemplo, o de IGF-1), e outros fatores de base, genéticos e adquiridos, que modificam o estado. A síndrome de resistência à insulina e o diabetes do tipo 2 são poligênicos e podem envolver polimorfismos em vários genes que codificam as proteínas envolvidas nas vias de sinalização da insulina, na secreção de insulina e no metabolismo intermediário (76). Deleções selecionadas de componentes da sinalização de insulina in vivo usando recombinação homóloga permitiram novas interpretações sobre a complexidade desses mecanismos. Embora alguns defeitos únicos na via de sinalização da insulina possam resultar em diabetes ( knockout do receptor de insulina, do IRS-2 ou da Akt2), em outros não se observa o mesmo resultado ( knockout da subunidade p85 da PI 3-quinase, do IRS-1 e do GLUT4). Além disso, knockout de genes envolvidos em desligar o sinal de insulina, como a PTP1B e a SHIP2, melhoram o diabetes em roedores obesos (28, 77). Combinações de knockouts foram produzidas para mimetizar o diabetes do tipo 2 poligênico, com deleções heterozigotas do receptor de insulina e do IRS- 1 (78), do receptor de insulina, do IRS-1 e do IRS-2 (79) e do IRS-1 e da glicoquinase (80). Em algumas dessas combinações, houve clara evidência de epístase genética (interação gene-gene). Por exemplo, embora o knockout heterozigoto do receptor de insulina ou do IRS-1 isolados não resultem em diabetes, o knockout duplo-heterozigoto leva 50% dos camundongos a desenvolver diabetes. Esse achado marcante propiciou alguns insights sobre o diabetes do tipo 2, no qual alterações únicas na expressão do receptor de insulina ou do IRS-1 geram alterações modestas na capacidade de transmissão intracelular do sinal, que, quando combinadas, podem levar à doença. Um modelo genético que produziu um fenótipo intrigante com relação à homeostase de glicose surgiu a partir dos knockouts das subunidades regulatórias p85α da PI 3-quinase. Embora a PI 3-quinase seja central nas ações metabólicas da insulina, o camundongo knockout heterozigoto para a p85α exibe aumento da sensibilidade à insulina (81, 82). Além disso, quando essa mutação é produzida em conjunto com o duplo knockout heterozigoto receptor de insulina/irs-1, ela protege contra o diabetes (83-85). Essa surpreendente proteção parece ser decorrente de um fator único na via de sinalização da insulina, na qual o balanço estequiométrico entre a p85α, a subunidade catalítica p110 e as proteínas IRS é crítico para a transmissão do sinal. A participação de tecidos específicos na patogênese da resistência à insulina e do diabetes do tipo 2 tem sido explorada por meio da técnica de recombinação de DNA Cre-lox para criar knockouts tecido-específicos do receptor de insulina (86-89) e do GLUT4 (90, 91). Apesar da ausência de diabetes em camundongos com knockout global de GLUT4 (92), knockouts tecido-específicos do GLUT4 no músculo (91) e no tecido adiposo (90) resultaram em intolerância à glicose acentuada. Os knockouts tecido-específicos do receptor de insulina também produziram resultados interessantes. Como observado acima, apesar do conhecimento prévio de que a insulina estimula a captação de glicose primariamente no músculo, camundongos com knockout do receptor de insulina no músculo apresentam tolerância à glicose normal (86). Isso ocorre, ao menos parcialmente, como resultado do redirecionamento da captação de glicose para a gordura, com subseqüente aumento da massa de tecido adiposo, dos ácidos graxos livres circulantes e dos triglicérides (93). Camundongos com knockout adiposo-específico do receptor de insulina também apresentam tolerância à glicose normal, enquanto o knockout fígado-específico do receptor de insulina apresenta diminuição da tolerância à glicose e redução do clearance de insulina, com acentuada hiperinsulinemia (89). Talvez os resultados mais surpreendentes, entretanto, tenham surgido de estudos de camundongos com knockout tecido-específicos do receptor de insulina na célula beta e no sistema nervoso central (87). O primeiro exibe defeito acentuado na secreção de insulina estimulada por glicose, semelhante ao observado no diabetes do tipo 2, enquanto o último exibe aumento da ingesta alimentar, adiposidade discreta, resistência à insulina e hipertrigliceridemia, assim como redução da fertilidade em decorrência de hipogonadismo hipotalâmico. Em conjunto, esses achados sugerem uma hipótese unificadora para o diabetes do tipo 2, na qual a resistência à insulina em órgãos-alvo clássicos (fígado, músculo e tecido adiposo), combinada à resistência à insulina na célula beta, no cérebro e em outros tecidos, pode resultar no diabetes do tipo 2. RESISTÊNCIA À INSULINA RELACIONADA AO SEDENTARISMO O sedentarismo é um fator que contribui para o de- 580 Rev Soc Cardiol Estado de São Paulo Vol 14 N o 4 Julho/Agosto de 2004

8 senvolvimento ou o aumento da resistência à insulina. Foi demonstrado que a sensibilidade à insulina pode aumentar com a atividade física, independentemente da redução do peso e de mudanças na composição corporal, e que o principal efeito do exercício pode ser o aumento da expressão de elementos intracelulares da via de sinalização da insulina, em particular dos transportadores de glicose na musculatura esquelética (94-98). Indivíduos insulino-resistentes filhos de portadores de diabetes do tipo 2 submetidos a seis semanas de treinamento físico apresentaram melhora da sensibilidade à insulina, demonstrada por aumento da captação de glicose e síntese de glicogênio no músculo (99). Além do efeito do exercício sobre os transportadores de glicose, o aumento do fluxo sanguíneo pode acarretar maior disponibilidade de insulina para os tecidos periféricos, contribuindo para a melhora metabólica observada durante o treinamento físico (100, 101). Outro efeito não-insulino-dependente do exercício é a liberação local de bradicinina, a qual estimula a captação de glicose (102). Além da melhora da sensibilidade à insulina na musculatura, há evidências de que a resistência à insulina no fígado também pode ser reduzida (caracterizada pela redução da produção hepática de glicose), bem como pode ocorrer aumento da captação de glicose pelos adipócitos após o exercício ( ). Portanto, aceita-se que o exercício físico pode melhorar a sensibilidade à insulina por meio de efeitos no músculo, no fígado e no tecido adiposo (106). RESISTÊNCIA À INSULINA RELACIONADA À OBESIDADE O impacto negativo do aumento da quantidade de gordura corporal sobre a sensibilidade à insulina pode ser claramente demonstrado na maioria dos indivíduos, assim como a redução da resistência à insulina observada com a perda de peso e o exercício físico (107). Inicialmente os ácidos graxos livres (AGL) foram implicados nesse processo, mas nos últimos anos vários hormônios produzidos por adipócitos foram descritos, bem como o papel que desempenham no desenvolvimento da resistência à insulina. Ácidos graxos livres O tecido adiposo desempenha papel fundamental na resistência à insulina. Os AGL circulantes provenientes dos adipócitos por meio da lipólise estão elevados em muitos estados e tem sido sugerida sua participação na resistência à insulina do diabetes do tipo 2 e da obesidade pela inibição da captação de glicose, da síntese de glicogênio e da oxidação de glicose, e também da maior produção hepática de glicose (108). A presença de elevados níveis de AGL circulantes também está associada à redução da fosforilação insulino-estimulada do IRS-1 em tirosina e de sua associação com a PI 3-quinase (109). A ligação entre elevação de AGL e resistência à insulina pode envolver o acúmulo de triglicérides e metabólitos derivados de ácidos graxos (diacilglicerol, acetil-coa e ceramidas) no músculo e fígado. Estudos inovadores com ressonância magnética nuclear e radioisótopos (carbono-13 e fósforo-31) demonstraram correlação muito estreita entre o conteúdo de triglicérides intramiocelular e resistência à insulina em pacientes com obesidade e diabetes do tipo 2 (110). Camundongos transgênicos com hiperexpressão específica da lipoproteína-lipase no músculo ou fígado exibiram aumento do conteúdo de triglicérides tecidual, que foi correlacionado com redução da ação da insulina e ativação da PI 3- quinase associada ao IRS (111). A ativação da PKC e/ou da quinase IkB e a fosforilação em serina do receptor de insulina e de seus substratos podem ser importantes nesse processo (109). Adipocinas Além de servir como estoque de lipídios, a célula adiposa produz e secreta diversos hormônios, chamados coletivamente de adipocinas, as quais podem influenciar profundamente o metabolismo e o gasto energético. A expressão de fator de necrose tumoral-alfa (TNF-α) está aumentada na gordura de roedores e de humanos obesos, e pode promover a fosforilação do IRS-1 em serina, resultando em menor atividade quinase do receptor de insulina e resistência à insulina (24, 112). Em roedores, anticorpos anti-tnf-α melhoram significativamente a resistência à insulina (113), bem como a ausência total do receptor de TNF-α ( ). Em humanos, no entanto, a importância desse mecanismo ainda é controversa, visto que estudos limitados com anticorpos anti-tnf-α demonstraram pouco ou nenhum efeito sobre o estado (117). A leptina, um hormônio da família das citocinas, é produzida pelo tecido adiposo e age em receptores no sistema nervoso central e em outros locais para inibir a ingesta alimentar e promover o gasto energético (118, 119). O mecanismo molecular por meio do qual a leptina e outros agentes anorexigênicos reduzem o apetite parece envolver a inativação hipotalâmica da AMPK ( AMP-activated protein kinase ) pela hiperleptinemia gerada pela adiposidade excessiva, elevando os níveis locais de malonil CoA e inibindo a fome (120). A resistência à insulina caracteriza estados de deficiência ou resistência graves à leptina, como os camundongos ob/ Rev Soc Cardiol Estado de São Paulo Vol 14 N o 4 Julho/Agosto de

9 ob ou db/db, ou modelos genéticos de diabetes lipoatrófico ( ). Em alguns desses, a administração de leptina exógena melhora a tolerância à glicose e a sensibilidade à insulina, independentemente dos efeitos na ingesta alimentar, provavelmente afetando vias neuroendócrinas que modulam a ação da insulina no fígado (70, 124), embora essa citocina possa também ter efeitos diretos nos hepatócitos (125). Em humanos, a deficiência congênita de leptina ou mutações em seu receptor ocorrem em casos extremamente raros e têm sido associadas com obesidade grave, mas não com diabetes (126), porém os casos estudados são de indivíduos jovens e ainda não é possível prever se eles irão desenvolver resistência à insulina ou diabetes no futuro. Adiponectina (também chamada Acrp30 ou adipoq) é um peptídeo derivado de adipócitos, que possui domínio colagenoso na sua porção aminoterminal e um domínio globular homólogo ao fator do complemento C1q (127). Estudos recentes demonstraram que a expressão de mrna da adiponectina está reduzida em humanos obesos e camundongos e em alguns modelos de diabetes lipoatrófico. O tratamento agudo de camundongos com essa adipocina reduz a resistência à insulina, os níveis plasmáticos de AGL e o conteúdo de triglicérides no músculo e no fígado, e aumenta a expressão de genes envolvidos na oxidação de ácidos graxos e no gasto energético (128). Em camundongos lipoatróficos, a resistência à insulina é revertida pela combinação de doses fisiológicas de adiponectina e leptina, mas só parcialmente por essas adipocinas isoladas (129). Em hepatócitos isolados, a adiponectina aumenta a capacidade da insulina de suprimir a produção de glicose (130, 131). Uma pesquisa recente utilizando a técnica de rastreamento do genoma em humanos mapeou um lócus para suscetibilidade ao diabetes do tipo 2 e síndrome metabólica no cromossomo 3q27, em uma região próxima ao gene da adiponectina (132). A resistina, o hormônio peptídico secretado por adipócitos descoberto mais recentemente, pertence a uma família de proteínas relacionadas conhecidas por REL- Ms ( resistin-like molecules ) e FIZZ ( found in inflammatory zone ). Estudos iniciais sugeriram que a resistina poderia causar resistência à insulina, já que foram documentados elevados níveis circulantes e teciduais desse hormônio em camundongos obesos, que eram reduzidos pela drogas antidiabéticas da classe das tiazolidinedionas (133). Além disso, a administração de anticorpos anti-resistina reduziu a glicemia e melhorou a ação da insulina em camundongos com obesidade induzida por dieta. No entanto, estudos subseqüentes não confirmaram esses achados iniciais (134). O papel potencial da resistina na síndrome ainda é incerto e complicado, em decorrência das incertezas sobre a existência de um homólogo desse hormônio em humanos (135). PERSPECTIVAS Resistência à insulina e diabetes do tipo 2 como processo inflamatório subclínico Estudos transversais têm demonstrado que marcadores inflamatórios e de disfunção endotelial podem predizer o desenvolvimento do diabetes e o ganho de peso em adultos (136). As associações mais significativas com marcadores inflamatórios são observadas com o índice de massa corporal, já que, como visto anteriormente, os adipócitos, especialmente nos obesos, produzem grande variedade de citocinas pró-inflamatórias, tais como leptina, TNF-α, IL-6, além de PAI-1. Há mais de cem anos, Williamson e colaboradores demonstraram que o tratamento com altas doses de salicilatos, incluindo salicilato sódico e aspirina, reduzia a intensidade da glicosúria em pacientes diabéticos, e em 1957 Reid e colaboradores demonstraram que o tratamento com aspirina por 10 a 14 dias melhorava os resultados dos testes de tolerância à glicose oral em pacientes diabéticos (137). O mecanismo por meio do qual o salicilato pode afetar a homeostase de giicose permaneceu desconhecido até que foi descoberto que essa droga inibe a atividade de uma serina-quinase conhecida por IkB quinase-ß (IKK-ß) (138). Essa serina-quinase participa da via de transmissão do sinal de TNF-α e IL-1, importantes no desenvolvimento do processo inflamatório, que cuimina com a regulação de fatores de transcrição, como o NF-kB. NF-kB corresponde a uma família de fatores de transcrição celulares envoividos na expressão de uma grande variedade de genes que regulam a resposta inflamatória (139). NF-kB permanece seqüestrado no citoplasma por proteínas inibitórias, as IkB, que são fosforiladas por um complexo de quinases conhecidas por IKK. IKK é composto de 2 quinases, IKK-α e IKK-ß, as quais fosforilam IkB, desencadeando sua degradação e permitindo, assim, a translocação do NF-kB para o núcleo. A atividade quinase de IKK é estimulada pelo TNF-α e peia hiperexpressão de MEKK1 e NIK; por outro lado, os agentes antiinflamatórios aspirina e salicilato sódico inibem especificamente a IKK-ß, evitando assim a ativação, pela NF-kB, de genes envolvidos na resposta inflamatória. Para testar a hipótese de que a resistência à insulina pode envolver a ativação induzida por lipídios de uma cascata de serina-quinases envolvendo a IKK-ß, 582 Rev Soc Cardiol Estado de São Paulo Vol 14 N o 4 Julho/Agosto de 2004

10 foi estudada a transmissão do sinal de insulina em ratos durante clamp euglicêmico-hiperinsulinêmico após infusão de lipídios, precedida ou não de tratamento com salicilato (26). A infusão de lipídios reduziu a captação de glicose estimulada por insulina e a ativação da PI 3-quinase associada ao IRS-1 no músculo esquelético, mas o pré-tratamento com salicilato evitou esses efeitos induzidos por lipídios. Para examinar o mecanismo de ação do salicilato, foram estudados os efeitos da infusão de lipídios na sinalização de insulina em camundongos knockout para IKKß. Ao contrário da resposta observada no animal controle, o camundongo que não expressa IKK-ß não apresentou a alteração na sinalização de insulina observada após a infusão de lipídios. Adicionalmente, a aspirina pode aumentar a sensibilidade à insulina protegendo o IRS-1 da fosforilação em serina promovida por diversas quinases, especialmente JNK e IKK do IRS-1 em serina (140). Ou seja, altas doses de salicilatos e a inativação da IKK-ß evitam a resistência à insulina induzida por lipídios no músculo esquelético, bloqueando defeitos induzidos por lipídios na sinalização e na ação da insulina. Em estados, mediadores como TNF-α e AGL levam à ativação do IKK por meio de vias de sinalização intermediárias. Tal ativação, por sua vez, aumenta indiretamente o número de resíduos de serina e treonina fosforilados no IRS-1, transformando-o em uma proteína com ação inibitória sobre o sinal de insulina. Na presença de salicilatos, a atividade do IKK é inibida, reduzindo a fosforilação do IRS-1 em serina e treonina e permitindo que esse substrato seja mais fosforilado em tirosina, podendo se ligar e ativar a PI 3-quinase, iniciando vias de sinalização reguladoras do metabolismo (141). Recentemente, foi investigado o efeito de altas doses de salicilatos na resistência à insulina de animais obesos (camundongos ob/ob) e foi demonstrada melhora acentuada da resistência a esse hormônio, associado à redução dos níveis de AGL e triglicérides (27). Nesse mesmo estudo, o uso de outros antiinflamatórios que inibem as cicloxigenases não alterou a sensibilidade à insulina, sugerindo que o efeito não depende da inibição dessas enzimas. O efeito dos salicilatos parece ser conseqüência da inibição da serina-quinase IKK-ß. Tais dados sugerem que pode ocorrer um fenômeno inflamatório (provavelmente subclínico) na patogênese da resistência à insulina, na obesidade e no diabetes do tipo 2, e a serina-quinase IKK-ß aparece como uma molécula com grande potencial terapêutico para melhora da sensibilidade à insulina. Existem mais de cem resíduos de serina que podem ser fosforilados no IRS-1, e muitas proteínas quinases fosforilam o IRS-1, incluindo JNK, PKCζ, IKK-ß, mtor, MAP quinase e AMPK, embora a JNK tenha recebido mais atenção recentemente por ser capaz de se associar ao IRS-1 e promover sua fosforilação no resíduo 307 de serina (Ser 307 ), tornando esse substrato mais refratário à associação com o receptor de insulina e, conseqüentemente, reduzindo sua fosforilação em tirosina, o que pode contribuir para a resistência à insulina durante situações de estresse fisiológico, como inflamação e obesidade (142). CONCLUSÕES Houve um progresso científico considerável na compreensão dos mecanismos moleculares de ação da insulina e nas alterações protéicas que levam à resistência à insulina. No entanto, muitas lacunas não foram preenchidas. É necessário definir algumas das etapas das vias de transmissão do sinal, elucidar os mecanismos de cross-talk com outros hormônios, e determinar a suscetibilidade genética da resistência à insulina e as interações entre os genes e o ambiente. Esses estudos provavelmente irão propiciar uma abordagem terapêutica individualizada para os pacientes portadores da síndrome, bem como fornecer medidas para sua prevenção. Rev Soc Cardiol Estado de São Paulo Vol 14 N o 4 Julho/Agosto de

11 MOLECULAR MECHANISMS FOR INSULIN RESISTANCE IN THE METABOLIC SYNDROME HENRIQUE GOTTARDELLO ZECCHIN, JOSÉ BARRETO CAMPELLO CARVALHEIRA, MARIO JOSÉ ABDALLA SAAD Insulin is an anabolic hormone with powerful metabolic effects. The events after insulin binds to its receptor are highly regulated and specific. Defining the key steps that lead to the specificity in insulin signaling presents a major challenge to biochemical research, but the outcome should offer new therapeutic approaches for treatment of patients suffering from insulin-resistant states, including type 2 diabetes. The insulin receptor belongs to the large family of growth factor receptors with intrinsic tyrosine kinase activity. Following insulin binding, the receptor undergoes autophosphorylation on multiple tyrosine residues. This results in activation of the receptor kinase and tyrosine phosphorylation of a family of insulin receptor substrate proteins. Like other growth factors, insulin uses phosphorylation and the resultant protein-protein interactions as essential tools to transmit and compartmentalize its signal. These intracellular protein-protein interactions are pivotal in transmitting the signal from the receptor to the final cellular effect, such as translocation of vesicles containing GLUT4 glucose transporters from the intracellular pool to the plasma membrane, activation of glycogen or protein synthesis, and initiation of specific gene transcription. Key words: tyrosine phosphorilation, tyrosine kinase, insulinic action, insulin resistance, insulin receptor, insulin receptor substracts. (Rev Soc Cardiol Estado de São Paulo 2004;4:574-89) RSCESP (72594)-1447 REFERÊNCIAS 1. Banting FG, Best CH. Pancreatic extracts J Lab Clin Med. 1990;115: Himsworth HP. Diabetes mellitus: its differentiation into insulin-sensitive and insulin-insensitive types. Lancet. 1936;1: Berson SA, Yalow RS. Some current controversies in diabetes research. Diabetes. 1965;14: Yalow RS, Berson SA. Plasma insulin concentrations in nondiabetic and early diabetic subjects. Determinations by a new sensitive immuno-assay technique. Diabetes. 1960;9: Yalow RS, Berson SA. Immunoassay of plasma insulin in man. Diabetes. 1961;10: Kahn CR, Flier JS, Bar RS, et al. The syndromes of insulin resistance and acanthosis nigricans. Insulinreceptor disorders in man. N Engl J Med. 1976;294: Kolterman OG, Insel J, Saekow M, Olefsky JM. Mechanisms of insulin resistance in human obesity: evidence for receptor and postreceptor defects. J Clin Invest. 1980;65: Olefsky J, Farquhar JW, Reaven G. Relationship between fasting plasma insulin level and resistance to insulin-mediated glucose uptake in normal and diabetic subjects. Diabetes. 1973;22: Reaven GM. Role of insulin resistance in human disease (syndrome X): an expanded definition. Annu Rev Med. 1993;44: Reaven GM. Banting Lecture Role of insulin resistance in human disease Nutrition. 1997;13: Pessin JE, Saltiel AR. Signaling pathways in insulin action: molecular targets of insulin resistance. J Clin Invest. 2000;106: Rev Soc Cardiol Estado de São Paulo Vol 14 N o 4 Julho/Agosto de 2004

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