BIOLOGIA MOLECULAR. Bases moleculares e fisiológicas da resistência à insulina. Introdução FIGURA 1. Autores:

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1 BIOLOGIA MOLECULAR Bases moleculares e fisiológicas da resistência à insulina Autores: José Barreto Campello Carvalheira Henrique Gottardello Zecchin Médicos e Pós-Graduandos do Departamento de Clínica Médica Faculdade de Ciências Médicas, Universidade Estadual de Campinas Mario José Abdalla Saad* Professor Livre-Docente do Departamento de Clínica Médica Faculdade de Ciências Médicas, Universidade Estadual de Campinas Introdução Após a descoberta da insulina por Banting e Best em 1922, o diabete em humanos foi considerado uma doença causada exclusivamente pela deficiência de secreção desse hormônio. Entretanto, dez anos depois, Himsworth 1 notou variações nas respostas de pacientes diabéticos à insulina e sugeriu que a insensibilidade à insulina, e não a deficiência na secreção desse FIGURA 1 ESTÁGIOS DO DESENVOLVIMENTO DO DM-2 *Endereço para correspondência: Departamento de Clínica Médica Faculdade de Ciências Médicas Universidade Estadual de Campinas Rua Tessália Vieira de Camargo, Campinas SP Tel.: (19) msaad@fcm.unicamp.br hormônio, era o mecanismo fisiopatológico em muitos diabéticos. Essa idéia foi desacreditada até o desenvolvimento do radioimunoensaio por Berson e Yalow 2, que mostraram definitivamente que pacientes com diabete iniciado na vida adulta (tipo 2) tinham altos níveis de insulina circulante. Estudos posteriores de Roth 3, Reaven 4,5, Olefsky 6, e outros sedimentaram as bases para a idéia de que a resistência à insulina é essencial para o desenvolvimento do diabete. Atualmente, acredita-se que a fisiopatologia do diabete tipo 2 envolve alterações em três sistemas orgânicos que conspiram para produzir um metabolismo anormal de glicose e lipídeos 7 : fígado, tecidos periféricos (músculo e adiposo) e célula β, apesar de existir certa incerteza em relação à lesão primária e à importância relativa dos diferentes tecidos. A resistência à insulina, que é definida como um estado de menor resposta metabólica aos níveis circulantes de insulina, é agora reconhecida como uma característica inerente do DM-2 e contribui para as anormalidades em todos os tecidos acima mencionados. Vários estudos epidemiológicos prospectivos em diversos grupos populacionais indicaram que o DM-2 progride em paralelo com a piora da ação insulínica, começando com resistência periférica à insulina e terminando com a redução na secreção de insulina (figura 1). Na maioria dos pacientes, a resistência à insulina pode ser detectada muito antes da deterioração do metabolismo glicídico. Resistência à insulina é um estado comum associado a obesidade, envelhecimento, hábito de vida sedentário, bem como a predisposição genética. O desequilíbrio da regulação do metabolismo de carboidratos e lipídeos decorrente da resistência à insulina gera um círculo vicioso com maior redução da sensibilidade à insulina. As células β pancreáticas inicialmente compensam o estado de resistência à insulina aumentando a secreção desse hormônio. Com o avançar da resistência, as células β falham em responder apropriadamente à glicose, levando ao desenvolvimento de intolerância à glicose. Anualmente, 5% a 10% dos pacientes intolerantes à glicose desenvolvem diabete com a piora da resistência à insulina. Mesmo na ausência de diabete, a resistência à insulina é uma característica marcante de outras doenças. Resistência à insulina e hiperinsulinemia estão associadas a anormalidades, tais como: hipertrigliceridemia, baixos níveis de HDL, aumento na secreção de VLDL, distúrbios de coagulação, aumento da resistência vascular, mudanças nos níveis de hormônios esteróides e aumento de peso. Desse modo, a resistência à insulina está freqüentemente associada com obesidade central, hipertensão, síndrome dos ovários policísticos, dislipidemia e Volume 5 / Número 1/ Sem título-12 33

2 aterosclerose. Essa constelação de sintomas é chamada de síndrome plurimetabólica 8. Não está claro se a resistência à insulina é a responsável direta por todos esses sintomas. Entretanto, a associação de resistência à insulina e essas alterações metabólicas é aceita universalmente. Nesta revisão, será abordada a fisiopatologia da resistência à insulina, mas antes de considerar as bases moleculares desse estado é essencial que se compreenda a ação insulínica em células normais. FIGURA 2 MECANISMO MOLECULAR DE AÇÃO DA INSULINA Transmissão intracelular do sinal insulínico A figura 2 mostra um esquema simplificado das etapas de sinalização intracelular desde a ligação da insulina ao seu receptor até a ativação do transporte de glicose. A sinalização intracelular da insulina começa com a sua ligação a um receptor específico de membrana, uma proteína heterotetramérica com atividade quinase, composta por duas subunidades α e duas subunidades β. A ligação da insulina à subunidade α estimula a autofosforilação da região intracelular da subunidade β do receptor. Uma vez ativado, o receptor de insulina fosforila vários substratos protéicos em tirosina, incluindo membros da família dos substratos dos receptores de insulina (IRS1/2/3/4), Shc, Gab-1 e Cbl. A fosforilação em tirosina das proteínas IRS cria sítios de reconhecimento para moléculas contendo domínios com homologia a Src 2 (SH2). Dentre essas, destaca-se a fosfatidilinositol 3-quinase (PI 3-quinase). As funções fisiológicas do IRS-1/2 foram recentemente estabelecidas através da produção de camundongos sem os genes que codificam o IRS-1 e IRS-2 ( knockout de IRS-1 e IRS-2). O camundongo que não expressa IRS-1 apresenta resistência à insulina e retardo de crescimento, mas não é hiperglicêmico 9. Foi demonstrado que o IRS-2 poderia compensar parcialmente a ausência de IRS-1, o que explicaria o fenótipo de resistência à insulina sem hiperglicemia do camundongo knockout de IRS-1. O camundongo que não expressa o IRS-2 foi recentemente gerado 10 e apresentou um fenótipo diferente do camundongo sem IRS-1: hiperglicemia acentuada devido a diversas anormalidades na ação da insulina nos tecidos periféricos e falência da atividade secretória das células β acompanhada de redução significativa da massa de células β pancreáticas. A fosforilação das proteínas IRSs cria sítios de ligação para a PI 3-quinase, promovendo sua ativação. Atualmente, a PI 3- quinase é a única molécula intracelular inequivocamente considerada essencial para o transporte de glicose 11. As proteínas-alvo conhecidas dessa enzima são a AKT e as isoformas atípicas da PKC (ζ e λ), porém a função das proteínas-alvos da PI 3-quinase no transporte de glicose ainda não está bem estabelecida Permanecem obscuros os mecanismos pelos quais as etapas iniciais da sinalização insulínica convergem para as vesículas que contêm GLUT4 incitando o transporte dessas vesículas para a superfície celular. No estado basal, GLUT4 é continuamente reciclado entre a membrana celular e os vários compartimentos intracelulares. Após o estímulo com insulina, a taxa de exocitose das vesículas contendo GLUT4 aumenta intensamente, além de ocorrer uma pequena diminuição na taxa de internalização. A exocitose estimulada por insulina é similar à exocitose de vesículas sinápticas 17,18. As vesículas de GLUT4, em particular, contêm as proteínas V-SNARE, VAMP2 e VAMP3, que fisicamente interagem com seus pares t-snare (sintaxina 4 e SNAP23) na membrana celular durante a translocação das vesículas de GLUT4. Apesar dessas interações serem essenciais para a translocação do GLUT4, nenhuma dessas proteínas parece ser alvo da insulina. É tentador especular que alterações específicas dos complexos de proteína SNARE e/ou vias de sinalização que atuam paralelamente à via da PI 3-quinase também contribuem para a resistência à insulina. Mecanismos celulares de resistência à insulina A seguir, serão abordados alguns dos avanços recentes no entendimento da gênese da resistência à insulina. Inicialmente, avaliaremos o efeito da obesidade e da hipertensão na modulação da sensibilidade à insulina e em seguida a influência dos fatores genéticos na indução da resistência à insulina. Obesidade O impacto negativo do aumento da quantidade de gordura corporal sobre a sensibilidade à insulina pode ser claramente demonstrado na maioria dos indivíduos, assim como a redução da resistência à insulina observada com a perda de peso e o exercício físico 19,20. Assim, pesquisadores vêm sendo atraídos pela procura de um fator produzido pelo tecido adiposo que module a sensibilidade insulínica. Inicialmente os ácidos graxos livres (AGL) foram implicados nesse processo, mas nos últimos anos vários hormônios produzidos por adipócitos foram descritos, bem como o papel que desempenham no desenvolvimento da resistência à insulina. n O papel dos ácidos graxos livres (AGL) na resistência à insulina relacionada à obesidade. Dentre as moléculas sinalizadoras produzidas por adipócitos, os AGL têm sido implicados na patogênese da resistência à insulina. Os AGL são gerados através da lipólise, principalmente nos adipócitos. Em indivíduos obesos insulino-resistentes pode- 34 HIPERTENSÃO Sem título-12 34

3 se encontrar níveis elevados de AGL no plasma. A resistência à insulina relacionada à obesidade leva à redução dos efeitos antilipolíticos da insulina. Outro mecanismo através do qual a obesidade poderia contribuir para a maior produção de AGL é a hiperatividade do sistema nervoso simpático, o que já foi demonstrado tanto em pacientes obesos como em diabéticos tipo 2. Os AGL são captados pelo fígado e músculo esquelético e se contrapõem aos efeitos da insulina, inibindo a captação e oxidação de glicose. Estudos recentes propuseram que a elevação de AGL plasmático resultaria em ativação da proteína quinase C-θ (PKCθ), uma serina-quinase, levando à fosforilação em serina do IRS- 1, o que reduz a capacidade do IRS-1 de se ligar e ativar a PI 3- quinase, resultando em transmissão reduzida do sinal de insulina em direção à translocação de GLUT4 para a membrana celular. Dessa forma, os ácidos graxos livres podem reduzir a captação de glicose celular interferindo diretamente na cascata de proteínas envolvidas na transmissão do sinal de insulina, e não através da inibição da atividade da hexoquinase (figura 3). n Adipocinas: TNF-α, leptina, adiponectina e resistina. Além de sua função de depósito de lipídeos, os adipócitos produzem e secretam hormônios, coletivamente chamados de adipocinas, que podem influenciar intensamente o metabolismo e o gasto energético. O TNF-α foi primeiro identificado como uma citocina endógena produzida por macrófagos e linfócitos após estímulo inflamatório. O TNF-α é expresso em muitos tipos de células, incluindo o tecido adiposo. Adipócitos de animais obesos e humanos hiperexpressam TNF-α em quantidades positivamente correlacionadas ao índice de massa corporal e à hiperinsulinemia, e a redução de peso diminui a expressão do TNF-α 24. Embora a liberação local de TNF-α exerça pouco efeito sobre as concentrações sistêmicas dessa citocina, as concentrações locais de TNF-α livre e ligado à membrana estão aumentadas na obesidade. Spiegelman et al. recentemente propuseram que o TNF-α é capaz de alterar a transmissão do sinal de insulina através do aumento da fosforilação em serina do IRS-1 e possivelmente de outras proteínas IRS 25. O IRS-1 fosforilado em serina inibe a atividade tirosino-quinase do receptor de insulina e é também menos fosforilado em tirosina, reduzindo assim a sinalização de insulina. Foi elaborada a hipótese de que a fosforilação do IRS-1 em serina induzida pelo TNF-α ativa um fator inibitório adicional sobre o receptor de insulina, provavelmente uma tirosina fosfatase ou um inibidor de serina-fosfatase, inibindo ainda mais a atividade tirosina quinase do receptor de insulina 26. Camundongos com ausência total do receptor de TNF-α (principalmente das isoformas p55 e p75 do receptor) apresentam melhora da sensibilidade à insulina 27. Em 1994, Friedman 28 identificou a leptina como um hormônio derivado de adipócitos e permitiu classificar o tecido adiposo como parte do sistema endócrino. A leptina reduz o peso corporal através de receptores específicos em áreas hipotalâmicas que regulam o gasto energético e a saciedade 29. FIGURA 3 EFEITO DOS AGL NAS VIAS DE TRANSMISSÃO DO SINAL DE INSULINA A deficiência na produção de leptina, bem como mutações no seu receptor em roedores, causa obesidade acentuada com hiperglicemia e resistência à insulina. Em alguns desses camundongos, a administração de leptina exógena melhora a tolerância à glicose e a sensibilidade à insulina, independentemente de seus efeitos na ingestão alimentar, provavelmente por modular vias neuroendócrinas que controlam as ações da insulina no fígado 30,31, embora a leptina possa exercer alguns de seus efeitos de forma direta nos hepatócitos 32. A adiponectina é um hormônio derivado de adipócitos. A redução da expressão dessa proteína está implicada no desenvolvimento de resistência à insulina em modelos animais de obesidade e lipoatrofia 33. A adiponectina reduz a resistência à insulina através da redução do conteúdo intracelular de triglicérides no músculo e fígado em camundongos obesos. Esse efeito é resultado do aumento da expressão de moléculas envolvidas tanto na metabolização de ácidos graxos quanto na dissipação de energia no músculo. Além disso, a resistência à insulina em camundongos lipoatróficos foi completamente revertida com a combinação de doses fisiológicas de adiponectina e leptina, mas apenas parcialmente pela adiponectina ou leptina isoladas. Esses dados indicam um possível papel terapêutico da reposição de adiponectina na resistência à insulina e diabete tipo 2. Resistina é a adipocina mais recentemente descoberta. Estudos iniciais sugeriram que a resistina poderia causar resistência à insulina, uma vez que seus níveis estavam aumentados em camundongos obesos e eram reduzidos por drogas antidiabéticas da classe das tiazolidinodionas. Além disso, a administração de anticorpo anti-resistina parecia melhorar a glicemia e a ação insulínica em camundongos obesos 34. Entretanto, estudos subsequentes não confirmaram esses achados iniciais 35. Hipertensão arterial Pacientes com hipertensão arterial apresentam intolerância a carboidratos, hiperinsulinemia e resistência à insulina em relação aos controles normotensos. Essas alterações podem persistir, independentemente do sucesso do tratamento farmacológico da hipertensão, e estão presentes em indivíduos obesos e não-obesos. Entretanto, há diferenças raciais importantes, e foi demonstrada a associação da resistência à Volume 5 / Número 1/ Sem título-12 35

4 insulina/hiperinsulinemia e hipertensão arterial (HA) em caucasóides, mas não em negróides ou índios Pima. Além dessas possíveis diferenças raciais, a presença de resistência à insulina só é observada em 50% dos indivíduos hipertensos. Atualmente, o mecanismo mais aceito para o desenvolvimento de hipertensão em pacientes com resistência à insulina é a existência de resistência à ação insulínica no endotélio vascular, podendo dificultar a ação vasodilatadora desse hormônio e/ou facilitar a vasoconstrição 36. Estudos em indivíduos com obesidade, ou com hipertensão arterial e resistência à insulina na utilização de glicose, demonstram que o aumento dos níveis de insulina nesses pacientes não é acompanhado de vasodilatação como em indivíduos normais. Além dos efeitos metabólicos da insulina, a ativação da PI 3-quinase, pelo menos em célula endotelial, estimula a produção de óxido nítrico (NO), fato que pode explicar a ação vasodilatadora da insulina. Assim, a insulina ativa seu receptor, que induz a fosforilação em tirosina dos IRSs, que, por sua vez, ligam-se à PI 3-quinase e a ativam; a PI 3-quinase, atuando através de outra enzimas vai finalmente estimular a produção de NO, que é um potente vasodilatador 37. Nesse sentido, é possível que mecanismos reguladores da PI 3-quinase no fígado, músculo e tecido adiposo venham a induzir resistência à ação insulínica na utilização de glicose. A diminuição da atividade da PI 3-quinase no endotélio pode induzir resistência à ação vasodilatadora da insulina e contribuir para a HA. Em resumo, a regulação das vias de transmissão do sinal insulínico em diferentes tecidos unifica os mecanismos moleculares que induzem resistência à insulina e HA. Corroborando esses dados, o camundongo sem IRS-1 apresenta redução da produção de NO, e, conseqüentemente, o relaxamento da aorta endotélio-dependente está reduzido nesse animal 37. Assim, na ausência de IRS-1, observa-se resistência à insulina associada a alterações hemodinâmicas encontradas na síndrome plurimetabólica. Isso reforça a hipótese de que defeitos moleculares comuns possam induzir resistência à insulina e HA. Fatores genéticos Existem fortes evidências para um papel importante de fatores genéticos no desenvolvimento de resistência à insulina 38, entretanto a identificação dos genes responsáveis pelo desenvolvimento da resistência à insulina têm sido extremamente difícil. Talvez a análise do genoma humano auxilie a revelar os fatores genéticos envolvidos nesse estado. O estudo de formas raras de diabete tem sido a forma mais efetiva para definir genes que causam resistência à insulina. Embora resistência à insulina seja o defeito mais precoce detectado na maioria dos pacientes com DM-2 38, mutações do receptor de insulina são muito raras e são usualmente observadas em pacientes com diferentes síndromes de resistência grave à insulina 39. Em torno de 0,1% 1% do DM-2 de herança materna, associado com defeitos na audição, têm mutações do DNA mitocondrial. Algumas formas de diabete lipoatrófico são causadas por mutações de laminas nucleares A/C 40, enquanto a síndrome de Wolfram (diabete, atrofia óptica e surdez) é causada por uma proteína ainda não caracterizada que possui dez segmentos transmembrana 41. Tentativas de identificar diabetogenes responsáveis pelas formas mais comuns de DM-2 dependem de estudos de linkage ou estudos de genes candidatos. A fase de pré-seqüenciamento do projeto genoma humano 42 permitiu rastreamento do genoma para identificação de regiões cromossômicas que estão ligadas com o DM-2 (cosegregação). Um locus na posição 2q37, designado NIDDM1, está ligado ao diabete e corresponde a um polimorfismo de um único nucleotídeo no gene que codifica a calpaina Esse locus parece agir junto com outro gene no cromossomo 15 para aumentar a suscetibilidade para o DM Outros loci envolvidos com DM-2 são o 20q12 e 1q21-24, mas os diabetogenes específicos ainda não foram determinados 45,46. Muitos genes candidatos envolvidos na ação insulínica têm sido examinados na procura de genes de suscetibilidade a resistência à insulina. Embora algumas formas variantes de muitos destes genes tenham sido identificadas, alguns desses mostraram associação com resistência à insulina ou diminuição da função da proteína estudada. Polimorfismos do IRS-1 e mutações do PPARγ apresentam redução da sensibilidade insulínica 21,22. Entretanto, para a maioria dos indivíduos, os genes envolvidos no desenvolvimento de resistência à insulina permanecem desconhecidos. Resistência à insulina e diabete tipo 2 processo inflamatório subclínico Estudos transversais têm demonstrado que marcadores inflamatórios e de disfunção endotelial podem predizer o desenvolvimento do diabete e ganho de peso em adultos 49. As associações mais significativas com marcadores inflamatórios são observadas com o índice de massa corporal. De fato, os adipócitos, especialmente nos obesos, produzem uma grande variedade de citocinas pró-inflamatórias e outros mediadores, como a leptina, TNF-α, IL-6 e PAI-1. Há mais de 100 anos, Williamson et al. mostraram que o tratamento com altas doses de salicilatos, incluindo salicilato sódico e aspirina, reduzia a intensidade da glicosúria em pacientes diabéticos e, em 1957, Reid et al. demonstraram que o tratamento com aspirina por 10 a 14 dias melhorava os resultados dos testes de tolerância à glicose oral em pacientes diabéticos 50. O mecanismo através do qual o salicilato pode afetar a homeostase de glicose permaneceu desconhecido até que Yin et al. descobriram que essa droga inibe a atividade de uma serina-quinase conhecida por IkB quinase-β (IKK-β) 51. Essa serina-quinase participa da via de transmissão do sinal de TNF-α e IL-1, importantes no desenvolvimento do processo inflamatório, que culmina com a regulação de fatores de transcrição, como o NF-κB. NF-κB corresponde a uma família de fatores de transcrição celulares envolvidos na expressão de uma grande variedade de genes que regulam a resposta inflamatória 52. NF-κB permanece seqüestrado no citoplasma por proteínas inibitórias, IkB, que são fosforiladas por um complexo de quinases conhecidas por IKK. IKK é composto de 2 quinases, IKK-α e IKK-β, as quais fosforilam IκB desencadeando a sua degradação e permitindo assim a translocação do NF-κB para o núcleo. A atividade quinase de IKK é estimulada pelo TNF-α e pela hiperexpressão de MEKK1 e NIK; por outro lado, os agentes antiinflamatórios aspirina e salicilato sódico inibem especificamente a IKK-β, evitando assim a ativação, pela NF-kB, de genes envolvidos na resposta inflamatória (figura 4). 36 HIPERTENSÃO Sem título-12 36

5 FIGURA 4 VIAS DE COMUNICAÇÃO DO SINAL DE TNF-α E IL-1 Para testar a hipótese de que a resistência à insulina pode envolver a ativação induzida por lipídeos de uma cascata de serinaquinases envolvendo a IKK-β, Kim et al. 53 estudaram a transmissão do sinal de insulina em ratos durante clamps euglicêmicoshiperinsulinêmicos após infusão de lipídeos, antecedida ou não de tratamento com salicilato. A infusão de lipídeos reduziu a captação de glicose estimulada por insulina e a ativação da PI 3-quinase associada ao IRS-1 no músculo esquelético, mas o pré-tratamento com salicilato evitou esses efeitos induzidos por lipídeos. Para examinar o mecanismo de ação do salicilato, o autor estudou os efeitos da infusão de lipídeos na sinalização de insulina em camundongos knockout de IKK-β. Ao contrário da resposta observada no animal controle, o camundongo que não expressa IKK-β não apresentou a alteração na sinalização de insulina observada após a infusão de lipídeos. Em resumo, altas doses de salicilatos e inativação da IKK-β evitaram a resistência à insulina induzida por lipídeos no músculo esquelético, bloqueando defeitos induzidos por lipídeos na sinalização e ação da insulina, e representam uma classe terapêutica potencial para diabete tipo 2. Em estados de resistência à insulina, alguns mediadores, como TNF-α e AGL, levam à ativação do IKK através de vias de sinalização intermediárias. Tal ativação, por sua vez, indiretamente aumenta o número de resíduos de serina e treonina fosforilados no IRS-1, transformando-o em uma proteína com ação inibitória sobre o sinal de insulina. Na presença de salicilatos, a atividade do IKK é inibida, reduzindo a fosforilação do IRS-1 em serina e treonina e permitindo que esse substrato seja mais fosforilado em tirosina, podendo se ligar e ativar a PI 3-quinase, iniciando vias de sinalização reguladoras do metabolismo 54. Recentemente Yuan et al. 55 investigaram o efeito de altas doses de salicilatos na resistência à insulina de animais obesos (camundongos ob/ob) e demonstraram uma melhora acentuada da resistência a esse hormônio, associada à redução dos níveis de AGL e triglicerídeos. Nesse mesmo estudo, o uso de outros antiinflamatórios que inibem as cicloxigenases não alterou a sensibilidade à insulina, sugerindo que o efeito independe da inibição dessas enzimas. O efeito dos salicilatos parece ser conseqüência da inibição da serina-quinase IKK-β. Tais dados sugerem que pode ocorrer um fenômeno inflamatório (provavelmente subclínico) na patogênese da resistência à insulina, na obesidade e no diabete tipo 2, e a serina-quinase IKK-β aparece como uma molécula com grande potencial terapêutico para melhora da sensibilidade à insulina. Perspectivas Houve um progresso científico considerável na compreensão dos mecanismos de ação da insulina e nas alterações moleculares que levam à resistência à insulina. No entanto, muitas lacunas permanecem. É necessário definir algumas das etapas das vias de transmissão do sinal de insulina, elucidar os mecanismos de inter-relação ( cross-talk ) com outros hormônios, determinar a suscetibilidade genética da resistência à insulina e as interações entre os genes e o ambiente. Esses estudos irão propiciar novos insights em relação a diabete e resistência à insulina, talvez permitindo uma abordagem terapêutica individualizada, incluindo a prevenção dessas doenças. Bibliografia recomendada 1. HIMSWORTH HP. Diabetes mellitus: its differentiation into insulin-sensitive and insulin insensitive types. Lancet, v. 1, p , YALOW RS, BERSON SA. Plasma insulin concentrations in nondiabetic and early diabetic subjects. Diabetes, v. 4, p , KAHN CR et al. The syndromes of insulin resistance and acanthosis nigricans. Insulin-receptor disorders in man. N Engl J Med, v. 294, p , OLEFSKY J, FARQUHAR JW, REAVEN G. 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