UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM GENÉTICA E BIOLOGIA MOLECULAR

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1 UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM GENÉTICA E BIOLOGIA MOLECULAR ANÁLISE PROTEÔMICA COMPARATIVA DO PROCESSO DE DIFERENCIAÇÃO CELULAR DO FUNGO PATOGÊNICO Paracoccidioides brasiliensis Dissertação de Mestrado Candidato: Alessandro Fernandes Vaz Orientadora: Dr a. Célia Maria de Almeida Soares Goiânia GO Julho de 2014

2 TERMO DE CIÊNCIA E DE AUTORIZAÇÃO PARA DISPONIBILIZAR AS TESES E DISSERTAÇÕES ELETRÔNICAS (TEDE) NA BIBLIOTECA DIGITAL DA UFG Na qualidade de titular dos direitos de autor, autorizo a Universidade Federal de Goiás (UFG) a disponibilizar, gratuitamente, por meio da Biblioteca Digital de Teses e Dissertações (BDTD/UFG), sem ressarcimento dos direitos autorais, de acordo com a Lei nº 9610/98, o documento conforme permissões assinaladas abaixo, para fins de leitura, impressão e/ou download, a título de divulgação da produção científica brasileira, a partir desta data. 1. Identificação do material bibliográfico: [X] Dissertação [ ] Tese 2. Identificação da Tese ou Dissertação Autor (a): Alessandro Fernandes Vaz Seu pode ser disponibilizado na página? [X]Sim [ ] Não Vínculo empregatício do autor Agência de fomento: Sigla: País: UF: CNPJ: Título: Análise Proteômica Comparativa do Processo de Diferenciação Celular do Fungo Patogênico Paracoccidioides brasiliensis Palavras-chave: Paracoccidioides sp.; dimorfismo; proteoma. Título em outra língua: Comparative proteomic analysis of the cell differentiation process in Paracoccidioides sp. Palavras-chave em outra língua: Paracoccidioides sp.; dimorphism; proteomic analysis. Área de concentração: Genética e Biologia Molecular Data defesa: (dd/mm/aaaa) 31/07/2014 Programa de Pós-Graduação: Pós-graduação em Genética e Biologia Molecular Orientador (a): Célia Maria de Almeida Soares Co-orientador (a):* *Necessita do CPF quando não constar no SisPG 3. Informações de acesso ao documento: Concorda com a liberação total do documento [x] SIM [ ] NÃO 1 Havendo concordância com a disponibilização eletrônica, torna-se imprescindível o envio do(s) arquivo(s) em formato digital PDF ou DOC da tese ou dissertação. O sistema da Biblioteca Digital de Teses e Dissertações garante aos autores, que os arquivos contendo eletronicamente as teses e ou dissertações, antes de sua disponibilização, receberão procedimentos de segurança, criptografia (para não permitir cópia e extração de conteúdo, permitindo apenas impressão fraca) usando o padrão do Acrobat. Data: / / Assinatura do autor (a) 1 Neste caso o documento será embargado por até um ano a partir da data de defesa. A extensão deste prazo suscita justificativa junto à coordenação do curso. Os dados do documento não serão disponibilizados durante o período de embargo.

3 UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM GENÉTICA E BIOLOGIA MOLECULAR ANÁLISE PROTEÔMICA COMPARATIVA DO PROCESSO DE DIFERENCIAÇÃO CELULAR DO FUNGO PATOGÊNICO Paracoccidioides brasiliensis Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Genética e Biologia Molecular do Instituto de Ciências Biológicas da Universidade Federal de Goiás como requisito parcial para obtenção do título de Mestre em Genética e Biologia Molecular. Candidato: Alessandro Fernandes Vaz Orientadora: Dr a. Célia Maria de Almeida Soares Goiânia GO Julho de 2014 ii

4 Ficha catalográfica elaborada automaticamente com os dados fornecidos pelo(a) autor(a), sob orientação do Sibi/UFG. Vaz, Alessandro Fernandes Análise Proteômica Comparativa do Processo de Diferenciação Celular do Fungo Patogênico Paracoccidioides brasiliensis [manuscrito] / Alessandro Fernandes Vaz xii, 122 f.: il. Orientador: Profa. Dra. Célia Maria de Almeida Soares. Dissertação (Mestrado) - Universidade Federal de Goiás, Instituto de Ciências Biológicas (ICB), Programa de Pós-Graduação em Genética e Biologia Molecular, Goiânia, Bibliografia. Inclui siglas, mapas, fotografias, abreviaturas, símbolos, gráfico, tabelas. 1. Paracoccidioides sp.. 2. Dimorfismo. 3. Proteoma. I. Soares, Célia Maria de Almeida, orient. II. Título.

5 TRABALHO REALIZADO NO LABORATÓRIO DE BIOLOGIA MOLECULAR, DO DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA E BIOLOGIA MOLECULAR, DO INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS DA UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS. iii

6 BANCA EXAMINADORA TITULARES: Profa. Dra. Célia Maria de Almeida Soares Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Bioquímica e Biologia Molecular, Universidade Federal de Goiás. Prof. Dr. Alexandre Siqueira Guedes Coelho Escola de Agronomia, Setor de Melhoramento de Plantas, Universidade Federal de Goiás. Dra. Patrícia de Sousa Lima Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Bioquímica e Biologia Molecular, Universidade Federal de Goiás. SUPLENTES: Prof. Dr. Evandro Novaes Escola de Agronomia, Setor de Melhoramento de Plantas, Universidade Federal de Goiás. Dra. Luciana Casaletti Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Bioquímica e Biologia Molecular, Universidade Federal de Goiás. iv

7 ... Desterra dos teus estudos a arrogância; não fiques presumido pelo que sabes, porque tudo quando sabe o mais sábio homem do mundo nada é em comparação com o muito que lhe falta saber... Juan Luis Vives v

8 Dedico este trabalho às pessoas mais importantes da minha vida... Aos meus pais, Lindomar e Irma, pelo esforço de me educar, ensinando que a honestidade e o respeito são essenciais à vida. Por todos os conselhos sábios que me deram durante todos esses vinte e poucos anos... À minha irmã Layssa, pela atenção e por sempre estar comigo... Estendo a dedicatória a toda a minha família, por compreender os momentos de ausência em algumas reuniões sociais, por sempre se preocuparem com meu bem estar e pelo reconhecimento à minha profissão... Família é tudo! vi

9 AGRADECIMENTOS Agradeço a Deus, pela vida e força que me foi conferida durante toda a caminhada. Agradeço de forma especial minha orientadora, professora Célia Soares, por me ter aceitado em seu grupo de pesquisa, pelas condições de trabalho, pela postura profissional e pela dedicação exercida em orientar os seus alunos. Célia, sua competência, compromisso e sabedoria a tornaram um exemplo de pesquisadora. Sou grato pela oportunidade e confiança em mim depositada. A senhora tem o meu respeito e a minha gratidão. Obrigado! Agradeço a todos os professores do Laboratório de Biologia Molecular, Alexandre Bailão, Clayton Borges, Juliana Parente, Maristela Pereira e Silvia Salem-Izaac, pelas dicas e por todas as explicações que contribuíram para minha formação. Agradeço de forma muito sincera a pesquisadora Tereza Cristina que me ensinou muita coisa no início... Cris, eu aprendi muito com você, lembro que foi você quem me ensinou a repicar, fazer inóculo e a extrair proteínas sem contar os inúmeros géis (uni e bidimensionais) que fizemos juntos... Você se tornou para mim um exemplo de pessoa por sua humildade e caráter. Muito obrigado Cris! À Lilian, por toda a ajuda que me ofereceu. Obrigado por me auxiliar a fotografar o Pb, pela ajuda relacionada às tabelas de proteínas e por me ajudar com as PCRs durante a etapa final do trabalho. Sou muito grato a você. Sucesso! Ao professor Alexandre Coelho pela acessibilidade e pelas contribuições que fez para o andamento do trabalho. Muito obrigado! Aos órgãos financiadores de pesquisa, CNPq, FINEP, FAPEG e, em especial, a CAPES, pela bolsa durante o mestrado. Aos meus amigos, Danielle e Paulo Henrique, que sempre estiveram ao meu lado e que fizeram o tempo passar mais rápido... Estar com vocês durante esses dois anos (e alguns meses) me fez uma pessoa melhor, levo comigo um pouquinho de cada um de vocês e espero que possa ter deixado em vocês um pouco do meu eu... Dani, não sei se você se lembra, mas a primeira pessoa que se ofereceu a me ensinar a fazer meio de cultura foi você, rs... Vou sentir falta de vocês, mas mesmo tendo escolhido caminhos diferentes sei que continuaremos com nossa amizade. Abraço!!! vii

10 Aos meus amigos, Lucas Nojosa e Igor, pela companhia e pelas brincadeiras... Lucas, não se preocupe, quando eu me casar eu te chamo pra festa, rs. Você sempre me falava isso. Desejo muito sucesso na carreira e na vida de vocês... À Laura (Laurita), Fabiana e Vanessa, pela companhia, pela ajuda e pelas boas conversas que tivemos. Sei que são pessoas muito inteligentes e que se esforçam muito em conquistar seus alvos. Estou na torcida por vocês, ainda quero ouvir falar de vocês... Abraços! À Juliana (Jú) e à Marielle, que sempre foram uma dupla muito especial... por isso meu agradecimento a vocês é em dose dupla. Sucesso!!! À Edilânia, Amanda e Karla, pela companhia e pelos momentos em que reuníamos a galera para almoçar. Era a hora mais esperada do dia, rs. Desejo sucesso a vocês! Ao Leandro Nascimento, Lucas Oliveira e à Sheyla, pela companhia e pelos ensinamentos que me passaram... Leandro, que foi meu colega na sala de estudos, quase todos os dias estávamos lá, lendo os artigos, escrevendo e tentando entender nossas proteínas, rs. Desejo muito sucesso a vocês! À Mariana, Luciana, Mirelle e Elisa, recebam meus sinceros agradecimentos. Sempre que eu tinha dúvidas eu me recorria a vocês. Muito obrigado meninas! À Laurine, Ana Flávia e Patrícia Lima por todas as inúmeras dicas e explicações que me deram. Sempre recorria à Laurine quando surgiam dúvidas relacionadas aos experimentos, quantas e quantas vezes eu te pedi fungo para repicar, rs... Patrícia, obrigado pelas explicações, lembro-me de pelo menos três vezes você me explicar log2 e loge, acho que chegou a pensar que eu não iria aprender, mas eu aprendi (rs), você me ajudou bastante. A vocês o meu muito obrigado! À Paula e Mirian pelas conversas que tivemos e pelo companheirismo. Abraços! Aos amigos do laboratório, Alex, Luiz Paulo, André, Gabriel, Neto, Lívia, Felipe, Joyce, Kleber e Wesley. Desejo muito sucesso a vocês! Aos alunos de iniciação científica, Isabela, Amanda, Anna Clara, Dienny, Diandra, Divina, Mariana, Bianca, Pâmela, Tathy, Guilherme, Raul e Zairo pela convivência diária que tivemos. viii

11 À Hanna pela alegria contagiante que trazia sempre que chegava ao laboratório e ao Leandro (Lele) pela ajuda nos inóculos que tive que fazer a noite. Vocês foram alunos muito aplicados e desejo muito sucesso na carreira profissional de vocês. Abraço! À Diana e Angêla (colombianas) que também trouxeram toda a simpatia e alegria para o laboratório nos meses que ficaram aqui conosco... Obrigado! À Daciene e ao Juscelino (marido) pelas conversas que tivemos, pelas dicas e pela hospedagem que me ofereceram em Brasília... vocês foram muito legais comigo. Abraço e sucesso! Às alunas que iniciam carreira no laboratório: Janaina, Geovana, Raiane, Marta, Deize, Isabela, Rosi e Mirlane. Desejo a vocês, boa sorte nos experimentos e que consigam alcançar seus alvos! A todas as alunas que passaram pelo LBM e deixaram saudades: Renata, Simone Vitoriano, Simone Weber, Dayane, Priscila, Patrícia Zambuzzi e Kelly. Aos professores da banca, por terem aceitado, tão prontamente, o convite para participarem da minha defesa de dissertação. A todos os meus familiares, em especial aos meus pais, que me deram todo o suporte necessário para que eu pudesse percorrer esse caminho... Obrigado! Aos amigos fora do laboratório que foram muito especiais, e que me deram força, apoio e continuam torcendo por mim. À amiga Kássia, pela amizade e pelo incentivo para que eu prestasse a seleção... A vocês o meu muito obrigado! A todos que contribuíram de alguma maneira para a realização desse trabalho. Muito obrigado! ix

12 SUMÁRIO RESUMO... xi ABSTRACT... xii 1. INTRODUÇÃO Aspectos gerais dos fungos Paracoccidioides spp Classificação taxonômica Biologia dos fungos Paracoccidioides spp A doença paracoccidioidomicose (PCM) Dimorfismo e virulência JUSTIFICATIVA OBJETIVOS MANUSCRITO CONSIDERAÇÕES FINAIS PERSPECTIVAS REFERÊNCIAS BILIOGRÁFICAS x

13 RESUMO Paracoccidioides spp. é o agente etiológico da paracoccidioidomicose, a mais importante micose sistêmica endêmica da América Latina. Paracoccidioides spp. é um fungo dimórfico, que apresenta alteração morfológica de acordo com a temperatura do ambiente. A forma miceliana é encontrada no solo a temperaturas inferiores a 25 ºC, enquanto que em tecidos do hospedeiro e sob temperaturas de ºC o fungo assume forma leveduriforme. A infecção se inicia com a inalação de conídios presentes na forma filamentosa do fungo, os quais ao atingirem os pulmões se diferenciam na forma leveduriforme, estabelecendo a paracoccidioidomicose. A transição de micélio para levedura está envolvida na virulência desse patógeno e esse aspecto da morfogênese do fungo não está totalmente compreendido. No presente estudo, foi utilizada a cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massas (nanouplc-ms E ) para avaliar o perfil proteômico durante a transição de micélio para levedura após 22 h da mudança da temperatura de 22ºC para 36ºC (P. brasiliensis isolado Pb18). Um total de 991 proteínas foram identificadas (350 em micélio, 288 na transição e 353 em levedrua) e 251 foram diferencialmente expressas durante o processo de diferenciação celular. Entre as proteínas que foram abundantes em micélio estão as subunidades da ATPase que participa na cadeia transportadora de elétrons e enzimas envolvidas na fermentação alcoólica. Proteínas relacionadas à via glicolítica e alguns potenciais fatores de virulência começam sua acumulação após 22 h do início da transição morfológica. Em levedura enzimas relacionadas com a glicólise e a beta-oxidação tiveram alta expressão. As análises das categorias funcionais a que essas proteínas pertencem, forneceram uma melhor compreensão da reorganização metabólica que ocorre durante a transição morfológica de micélio para levedura, incluindo possíveis fatores de virulência. Palavras-chave: Paracoccidioides sp.; dimorfismo, proteoma. xi

14 ABSTRACT Paracoccidioides spp. is the etiological agent of paracoccidioidomycosis, the most important endemic systemic mycosis in Latin America. Paracoccidioides spp. is a dimorphic fungus; mycelia is found in soil at temperatures below 25ºC, while in host tissues, and temperature around 36-37ºC the fungus takes the yeast form. Infection begins with the inhalation of conidia or mycelia propagules that upon reaching the host lungs differentiate into yeast, establishing disease. The morphological transition from mycelia-to-yeast is involved in the virulence of this pathogen and this aspect of morphogenesis deserves special attention due to its relevance to the fungal virulence. In the present study, we employed proteomic strategies using liquid chromatography coupled to mass spectrometry to evaluate the differential proteomic profile of cells ongoing transition from mycelia-to-yeast after 22 h of temperature shift from 22ºC to 36ºC (P. brasiliensis Pb-18 phylogenetic lineage S1). Nine hundred and ninety-one proteins were identified (350 in the mycelia, 288 in the transition and 353 in the yeast), and 251 were differentially regulated. The analysis of the functional categories to which those proteins belong provided us a comprehension on the metabolic reprogramming that occurs during the cell differentiation process, providing putative virulence factors. Keywords: Paracoccidioides sp.; dimorphism; proteomic analysis. xii

15 Análise proteômica comparativa do processo de diferenciação celular do fungo patogênico Paracoccidioides brasiliensis Alessandro Fernandes Vaz 1. INTRODUÇÃO 1.1. Aspectos gerais dos fungos Paracoccidioides spp. Paracoccidioides spp. são fungos termo-dimórficos, descritos primeiramente por Adolpho Lutz em 1908, um médico brasileiro, que isolou o micro-organismo de pacientes que apresentavam lesões nas mucosas da cavidade oral (Lutz, 1908; Sturme et al., 2011). Esses fungos são os agentes etiológicos da paracoccidioidomicose (PCM), a mais prevalente micose sistêmica endêmica na América Latina (Brummer et al., 1993). Paracoccidioides spp. são caracterizados por apresentarem dimorfismo térmico, aspecto importante no mecanismo de virulência e patogenicidade (San-Blas; Niño-Vega; Iturriaga, 2002). Em condições naturais, o fungo se encontra no solo como sapróbio crescendo na forma de micélio a temperaturas inferiores a 25 ºC, enquanto que em tecidos de animais sob temperatura de ºC o fungo assume a forma leveduriforme, o que pode levar ao desenvolvimento da PCM (Bagagli et al., 2006). A forma miceliana, visualizada no microscópio de luz, apresenta hifas finas e septadas com raros clamidósporos terminais ou intercalares e com vários núcleos enquanto a forma leveduriforme é caracterizada por apresentar uma estrutura com natureza multinuclear e com múltiplos brotamentos (Franco et al., 1989; Sturme et al., 2011) Classificação taxonômica Paracoccidioides spp. são filogeneticamente considerados ascomicetos pertencente à ordem Onygenales, família Ajellomycetaceae, constituída por fungos Onygenales que se associam a animais vertebrados (Untereiner et al. 2004; Sturme et al., 2011). Esta família também inclui outras espécies patogênicas como Blastomyces dermatitidis, Histoplasma capsulatum, Emmonsia parva e E. crescens. O fungo patogênico Lacazia loboi também é incluído nesse grupo como uma espécie irmã do gênero Paracoccidioides (Theodoro et al., 2012; Teixeira et al., 2009). Até 2006, o gênero Paracoccidioides incluía somente uma espécie, P. brasiliensis, mas em estudos de polimorfismos genéticos, Matute et al. (2006) descreveram a existência de pelo menos três diferentes espécies filogenéticas de P. brasiliensis: S1 (espécie 1), PS2 (espécie filogenética 2) e PS3 (espécie filogenética 3). O clado S1 engloba 38 isolados distribuídos no Brasil, Argentina, Paraguai, Peru e Venezuela; a espécie filogenética PS2 é 13

16 Análise proteômica comparativa do processo de diferenciação celular do fungo patogênico Paracoccidioides brasiliensis Alessandro Fernandes Vaz descrita em 5 isolados distribuídos no Brasil e um isolado da Venezuela; e a espécie filogenética PS3 é composta de 21 isolados, conhecidos até o momento, restritos geograficamente na Colômbia (Matute et al., 2006). Apesar das espécies apresentarem variabilidade genética, todas são capazes de induzir a infecção em humanos e animais, com uma menor virulência atribuída à espécie PS2. Os estudos de Teixeira et al. (2009), por meio do Método de Reconhecimento de Espécies Filogenéticas por Concordância Genealógica (GCPSR do inglês Method of Genealogic Concordance for Phylogenetic Especies Recognition), permitiram identificar uma nova espécie dentro do gênero Paracoccidioides, composta do isolado Pb01-like, o qual é altamente divergente das três espécies até então identificadas (S1, PS2 e PS3) e endêmica da região Centro-Oeste do Brasil, especificamente, nos estados de Mato Grosso e Goiás. Os autores sugerem que esta nova espécie composta dos isolados Pb01-like seja chamada de Paracoccidioides lutzii, como tributo ao micologista médico brasileiro, Adolpho Lutz, quem primeiro descreveu P. brasiliensis em 1908 (Teixeira et al., 2009). Recentemente, tem sido proposto mais um diferente clado: PS4 (espécie filogenética 4) com cinco isolados identificados até o momento, provenientes da Venezuela, porém essa espécie filogenética é pouco caracterizada (Bocca et al., 2013). Além das diferenças quanto ao genoma entre os isolados do gênero Paracoccidioides, diferenças morfológicas podem ser observadas entre isolados de espécies filogenéticas diferentes [Figura 1] (Bocca et al., 2013). Porém, as características morfológicas não são tão discrepantes entre os isolados e devido a isso, a classificação desse fungo não pode ser realizada levando em consideração apenas essas diferenças. Sendo necessário, dados moleculares para melhor compreender e classificar de maneira mais precisa as espécies filogenéticas que o complexo Paracoccidioides apresenta. 14

17 Análise proteômica comparativa do processo de diferenciação celular do fungo patogênico Paracoccidioides brasiliensis Alessandro Fernandes Vaz Figura 1 - Diferenças morfológicas (levedura e conídios) entre Paracoccidioides brasiliensis Pb18 e Paracoccidioides lutzii Pb01. A e B Diferenças no tamanho da levedura em brotamento por microscopia de luz; C e D por microscopia eletrônica de varredura; E e F diferenças morfológicas dos conídios por microscopia de luz (Fonte: adaptado de Bocca et al., 2013) Biologia dos fungos Paracoccidioides spp. A forma filamentosa não patogênica do fungo tem sido descrita como saprobiótica, a qual se alimenta da matéria em decomposição encontrada no solo seja ela animal ou vegetal (Desjardins et al., 2011). Através da inalação de propágulos micelianos ou de conídios pelo hospedeiro, o fungo se diferencia na forma leveduriforme, iniciando assim a infecção. Este patógeno tem sido repetidamente recuperado de amostras clínicas de humanos e tecidos de algumas espécies de tatus, tais como Dasypus novemcinctus, e ocasionalmente de Cabassous centralis. Já foi detectado em cachorros e esporadicamente têm sido isolado do solo, pinguins e fezes de morcegos (Bagagli et. al., 2003; Corredor et. al., 2005; Ricci et. al., 2004; Farias et. al., 2011; Restrepo et. al., 2001.). Isso demonstra que Paracoccidioides spp. têm ocupado 15

18 Análise proteômica comparativa do processo de diferenciação celular do fungo patogênico Paracoccidioides brasiliensis Alessandro Fernandes Vaz diferentes nichos ecológicos e que esses diferentes ambientes podem contribuir para os eventos de evolução e especiação do fungo. Muitos organismos podem ocupar mais de um nicho ecológico durante seu ciclo de vida e isso ocorre com membros do complexo Paracoccidioides. Durante a fase saprobiótica, o patógeno está sob a influência de diferentes condições, como alterações na temperatura e umidade e competição com outros micro-organismos. Durante a fase patogênica, ou seja, leveduriforme, o fungo deve se adaptar a condições diversas, tais como aumento da temperatura, influência hormonal e resposta imune do hospedeiro (Bagagli et al., 2008) (Figura 2). A detecção de Paracoccidioides spp. em diferentes órgãos de espécies hospedeiras denota que esses fungos podem ter diferentes perfis de disseminação. Figura 2 - Ciclo biológico hipotético de Paracoccidioides sp., destacando algumas forças seletivas que podem atuar em seus supostos nichos ecológicos, em hospedeiros e em ambientes saprobióticos (Fonte: adaptado de Bagagli et al., 2008). Na última década, os avanços tecnológicos, especialmente aqueles relacionados à biologia molecular, têm contribuído significativamente para o conhecimento da biologia do fungo. Os genomas estruturais de três isolados do gênero Paracoccidioides (Pb01 [P. lutzii], Pb03 [PS2] e Pb18 [S1]) foram sequenciados por meio do projeto denominado Genômica Comparativa de Coccidioides e outros Fungos Dimórficos. Os genomas desses três diferentes isolados foram depositados no banco de dados do Broad Institute e estão disponíveis para acesso em: https://www.broadinstitute.org/. Os genomas de Pb01, Pb03 e Pb18 são assim compostos: 32,9 Mb, para Pb01, com um total de genes preditos; este isolado apresenta um maior genoma em relação ao número de bases e em quantidade de genes 16

19 Análise proteômica comparativa do processo de diferenciação celular do fungo patogênico Paracoccidioides brasiliensis Alessandro Fernandes Vaz quando comparado com o genoma dos isolados Pb03 e Pb18. Os genomas dos isolados Pb03 e Pb18 são similares em tamanho, o primeiro é composto de 29,1 Mb com genes preditos e o genoma do Pb18 apresenta o tamanho de 30,0 Mb sendo genes preditos para codificação de proteínas (Desjardins et al., 2011). Desjardins et al. (2011) mapearam 94% do genoma do Pb18 e descrevem que seu conteúdo genético está organizado em cinco cromossomos. Um aspecto interessante quanto à biologia dos fungos Paracoccidioides spp. são as formas de reprodução. Fungos podem se reproduzir assexuada ou sexualmente; o gênero Paracoccidioides se reproduz assexuadamente por fragmentação de hifas, produção de conídios e por brotamento na fase leveduriforme. Além disso, um ciclo sexual pode ocorrer, pois dados moleculares e morfológicos têm suportado a existência de um ciclo sexual em espécies do complexo Paracoccidioides. O processo de cruzamento (do inglês Mating) de ascomicetos filamentosos é controlado pela presença e expressão de dois genes, MAT1-1 e MAT1-2, conferindo uma identidade sexual a esses fungos. Fernandes et al. (2005) identificaram proteínas envolvidas com cruzamento (MAT-1 e MAT-2) por meio de análises transcritômicas e sugeriram a existência de um ciclo sexual em Paracoccidioides spp. Os isolados Pb03 e Pb18 apresentam o gene MAT1-2 enquanto que Pb01 (P. lutzii) tem o MAT1-1 (Desjardins et al., 2011). Em um estudo recente, Teixeira et al. (2013) avaliaram a expressão dos componentes do cruzamento (MAT1-1 e MAT1-2) de sete isolados do gênero Paracoccidioides e essa análise revelou que a expressão preferencial desses genes ocorre na fase filamentosa. Embora não se conheça sua reprodução sexual, sabe-se que o gênero Paracoccidioides apresenta a maquinaria genética responsável por esse tipo de reprodução. Estes resultados, citados acima, fornecem informações importantes sobre atributos genômicos que contribuem para a compreensão da divergência e da diversidade genética existente entre os isolados de Paracoccidioides spp. e aumentam nosso entendimento acerca da biologia desses fungos A doença paracoccidioidomicose (PCM) Como já mencionado anteriormente, o fungo se instala no hospedeiro usualmente através da via respiratória, pois, por meio da inalação de conídios ou propágulos de micélio juntamente com o aumento da temperatura encontrada no hospedeiro, o patógeno sofre uma alteração morfológica para células leveduriformes estabelecendo a infecção. A PCM, também chamada de doença de Lutz ou blastomicose Sul Americana, é endêmica na América Latina e 17

20 Análise proteômica comparativa do processo de diferenciação celular do fungo patogênico Paracoccidioides brasiliensis Alessandro Fernandes Vaz foi somente reconhecida oficialmente como paracoccidioidomicose pela Organização Mundial de Saúde em 1971 (Ramos-e-Silva; Saraiva, 2008). Como a PCM não é uma doença de notificação compulsória os dados de incidência no Brasil são imprecisos. Acredita-se que sua incidência em zonas endêmicas seja de 1 a 3 novos casos para cada 100 mil habitantes ao ano. Muitos países da América Latina relatam a ocorrência do fungo, com grande incidência no Brasil, Venezuela, Colômbia e Equador com raros casos no México (Figura 3) (Shikanai- Yasuda et al., 2006). Figura 3 - Distribuição geográfica da PCM (Fonte: Shikanai-Yasuda et al., 2006). De acordo com os registros do Ministério da Saúde e do trabalho realizado por Coutinho et al. (2002), de 1980 a 1995 ocorreram no Brasil casos de óbito por PCM (Figura 4) resultando numa taxa de mortalidade de 1,45 casos por milhão de habitantes. Esses dados apontam a PCM como oitava causa de mortalidade por doenças infecciosas e parasitárias, maior ainda que a mortalidade por leishmanioses, e a mais alta taxa entre as micoses sistêmicas (Shikanai-Yasuda et al., 2006). No Brasil, a doença ocorre mais frequentemente nos estados de São Paulo, Paraná, Rio Grande do Sul, Goiás e Rio de Janeiro. A distribuição da doença entre os estados brasileiros parece estar sendo alterada nas últimas décadas, afetando principalmente as áreas do norte e centro-oeste do país, provavelmente pela abertura de novas fronteiras agrícolas (Ramos-e-Silva; Saraiva, 2008). Brown et al. (2012), em um estudo sobre infecções fúngicas humanas, apontaram a PCM ocupando a nona posição entre as 10 mais significantes infecções fúngicas invasivas; e 18

21 Análise proteômica comparativa do processo de diferenciação celular do fungo patogênico Paracoccidioides brasiliensis Alessandro Fernandes Vaz entre as micoses dimórficas endêmicas, a PCM aparece em quarto lugar com aproximadamente 4 mil infecções, com risco de vida, estimadas no Brasil, com uma taxa de mortalidade de 5-27% nas populações infectadas. A PCM atinge predominantemente trabalhadores rurais do sexo masculino na sua idade mais produtiva, trazendo um importante impacto social (Barrozo et al., 2009). Observase que a grande maioria dos pacientes exerceu atividade agrícola nas duas primeiras décadas de vida, tendo nessa época provavelmente adquirido a infecção, embora as manifestações clínicas tenham surgido muitos anos depois. A apresentação de manifestações clínicas ou a evolução da doença ocorre mais frequentemente entre 30 e 50 anos. A razão de acometimento da PCM em adultos varia de 10 a 15 homens para 1 mulher; na infância a infecção e a doença se distribuem uniformemente entre ambos os sexos (Shikanai-Yasuda et al., 2006). Esses dados epidemiológicos levaram à hipótese de uma interação entre os hormônios esteroides mamíferos com o patógeno e pela ausência ou menor contato das mulheres com as fontes de infecção. A alta incidência da PCM em homens sugere que fatores hormonais podem desempenhar um importante papel na patogênese, visto que hormônios femininos podem bloquear a transição morfológica impedindo o fungo de causar a doença (Restrepo et al., 1984; Shankar et al., 2011). Figura 4 - Distribuição da mortalidade por paracoccidioidomicose no Brasil entre 1980 a 1995 (Fonte: adaptado de Countino et al., 2002). 19

22 Análise proteômica comparativa do processo de diferenciação celular do fungo patogênico Paracoccidioides brasiliensis Alessandro Fernandes Vaz A PCM é uma micose infecciosa, granulomatosa, aguda/subaguda, crônica e sistêmica. A PCM tem duas importantes apresentações clínicas: a forma crônica e a forma aguda/subaguda. A mais comum é a forma crônica (adulta) que afeta principalmente pacientes com idade de 30 a 60 anos e tem um longo período de latência (que varia de meses até décadas); essa forma da doença ocorre em cerca de 90% dos casos (Bocca et al., 2013). A forma menos frequente da doença é a aguda ou subaguda (juvenil) que geralmente é mais grave e desenvolve mais rapidamente, afetando crianças, adolescentes e adultos jovens (Barrozo et al., 2009) Dimorfismo e virulência É amplamente aceito que fungos patogênicos têm uma enorme influência sobre a vida animal e vegetal. A alta taxa de mortalidade associada a infecções fúngicas invasivas é preocupante, pois muitas vezes supera a 50%, apesar da disponibilidade de várias drogas antifúngicas (Brown et al., 2012). Nesse respeito, muitas pesquisas estão sendo realizadas na tentativa de se compreender melhor os fungos patogênicos, bem como a relação destes com o hospedeiro, para encontrar métodos de diagnóstico mais eficientes e possíveis fatores de virulência que podem despertar novos alvos antifúngicos. Esses últimos, quando alcançados, podem significar tratamentos mais eficazes e melhor qualidade de vida para o paciente. Como já mencionado, a PCM é uma micose sistêmica cuja infecção se inicia com a inalação de conídios ou fragmentos de micélios pelo hospedeiro, seguida pela sua diferenciação em células leveduriformes. Essa diferenciação entre duas morfologias distintas, isto é, a capacidade do fungo em existir como micélio e também em levedura é definida como dimorfismo (Rappleye; Goldman, 2006). Assumindo que fator de virulência seja qualquer fator que o fungo apresenta que possa aumentar sua infecção no hospedeiro, o dimorfismo térmico que Paracoccidioides spp. exibem, pode ser considerado como fator de virulência, visto que a transição para a forma parasitária é essencial para a patogenicidade em fungos dimórficos, o que destaca a necessidade de se entender melhor os mecanismos moleculares envolvidos nesse processo (Hogan et al., 1996). Dessa forma, concordamos com Rezende et al. (2011) ao relatar que a capacidade de Paracoccidioides spp. em sofrer uma alteração morfogenética de micélio para levedura é de interesse particular, porque isso representa uma parte da estratégia de virulência global desse fungo patogênico. 20

23 Análise proteômica comparativa do processo de diferenciação celular do fungo patogênico Paracoccidioides brasiliensis Alessandro Fernandes Vaz No processo de transição, fungos patogênicos, tais como Coccidioides immitis, Histoplasma capsulatum, Paracoccidioides spp., Sporothrix schenkii e Penicillium marneffei, apresentam regulação na expressão de genes, que resultam em várias alterações na morfologia celular, na composição da parede celular, presença de moléculas antigênicas e a expressão de fatores de virulência (Nunes et al., 2005; Theodoro et al., 2008; Klein; Tebbets, 2007). Assim, a grande questão a ser compreendida é: como esses fungos detectam a mudança na temperatura e regulam a fase da transição dimórfica? Os mecanismos que regulam essa mudança permanecem incompreendidos (Nemecek et al., 2006). Como a fase parasitária está intimamente relacionada ao aumento da temperatura que é encontrada no corpo do hospedeiro mamífero, o desenvolvimento de fatores que auxiliam a virulência, provavelmente, incluem proteínas de choque térmico (heat shock proteins, HSPs) e outras respostas ao estresse relacionadas com a temperatura. Desse modo, proteínas específicas em levedura são potenciais fatores de virulência; por exemplo, em Paracoccidioides sp. a proteína HSP70 é altamente produzida depois do estabelecimento da fase leveduriforme podendo desempenhar papel na virulência (Rappleye; Goldman, 2006). Demais candidatos a fatores de virulência em Paracoccidioides spp. incluem: proteínas de ligação a estrógenos, constituintes da parede celular como α-1,3 glucana e β-glucana, e o antígeno extracelular gp43 (Hogan et al., 1996). Além disso, a capacidade do fungo de resistir a espécies reativas de oxigênio e espécies reativas de nitrogênio (ROS e RNS), que são produzidas pelas células fagocitárias do hospedeiro, é predita para estar entre os mecanismos de virulência. Catalases são descritas como importantes fatores de virulência que conferem resistência ao patógeno. Paracoccidioides spp. apresentam catalases que são induzidas durante a transição de micélio para levedura e na fase parasitária. Chagas et al. (2008) relatam que em resposta ao estresse oxidativo, Paracoccidioides sp. (Pb01) produz três catalases, PbCatA, PbCatP e PbCatC, sendo que PbCatA manifesta alta atividade em micélio e PbCatP em células leveduriformes. Consistente com isso, estudos apontam que PbCatA está associada a proteção contra o estresse oxidativo endógeno, enquanto que PbCatP fornece proteção contra a produção exógena de peróxido de hidrogênio como os produzidos pelos macrófagos durante a infecção (Grossklaus et al., 2013). A proteína enolase encontrada na superfície de Paracoccidioides spp. também é apontada como um potencial fator de virulência, visto que se liga ao plasminogênio e medeia a interação de leveduras na fase parasitária com células do hospedeiro mamífero, uma vez que, a enolase é capaz de se ligar aos componentes da matriz extracelular facilitando a adesão 21

24 Análise proteômica comparativa do processo de diferenciação celular do fungo patogênico Paracoccidioides brasiliensis Alessandro Fernandes Vaz às células do hospedeiro (Nogueira et al., 2010; Bailão et al., 2012). Como já mencionado, a glicoproteína secretada gp43 ( Da) é considerada como fator de virulência. O gene PbGP43 codifica uma proteína de 416 aminoácidos, e reage 100% com o soro de pacientes com PCM (Cisalpino et al., 1996). A proteína gp43 é parcialmente responsável pela adesão aos componentes da matriz extracelular e pode mediar a interação célula-célula nos alvéolos pulmonares por se ligar à laminina e fibronectina. Estudos realizados por Torres et al. (2013), por meio de transformação mediada por Agrobacterium tumefaciens, mostraram que a proteína gp43 desempenha um importante papel na interação patógeno-hospedeiro, pois a baixa expressão de gp43 reduziu a carga fúngica nos pulmões de camundongos. Recentemente, rbt5, um receptor de hemoglobina ortólogo, foi apontado como potencial fator de virulência e alvo para o desenvolvimento de drogas. Esse receptor demonstra ser capaz de se ligar à hemoglobina do hospedeiro para que Paracoccidioides spp. consiga adquirir ferro, um micronutriente essencial, desempenhando papel na manutenção da homeostase (Bailão et al., 2014). Existem vários estudos de perfis transcricionais de Paracoccidioides spp. visando a identificação de transcritos específicos das fases de micélio, levedura e da transição dimórfica. Por exemplo, Felipe et al. (2005) identificaram 328 genes que foram diferencialmente expressos durante a fase de transição (Pb01), 58 em micélio e 270 em levedura. A análise global desses genes sugere que a produção de ATP (adenosina trifosfato) se dá preferencialmente através da fermentação alcoólica em levedura e por meio da cadeia respiratória em micélio. Quanto aos genes relacionados à resposta ao estresse, oito genes foram diferencialmente expressos: genes que codificam calnexina, hsp60 citoplasmática (cct7), co-chaperonas HSP90/70 (sba1) foram mais expressos em micélio; co-chaperonas HSP90/70 (cpr1), hsp42, hsp60, HSP70 (ssc1) e hsp90 foram mais expressas em levedura. Genes que codificam as enzimas malato sintase e isocitrato liase também foram detectados no transcritoma de Paracoccidioides sp., sendo que a última enzima é mais expressa em levedura, o que indica que o ciclo do glioxilato é ativado durante a transição do fungo; esse ciclo tem sido relatado como um requisito à virulência de Paracoccidioides sp. (Felipe et al., 2005; Wills et al., 2000). Bastos et al. (2007) avaliaram o perfil transcricional de Paracoccidioides sp. (Pb01) durante o início da transição de micélio para levedura por meio da análise de ESTs (expressed sequence tags). Os autores identificaram 34 genes relatados para síntese/remodelamento da parede celular/membrana, tais como fosfoglicomutase, UDPglicose pirofosforilase e alpha-1,3 glucana sintase; 10 genes potencialmente relacionados com a transdução de sinal, como proteína quinase C, proteína de ligação ao GTP, proteína 22

25 Análise proteômica comparativa do processo de diferenciação celular do fungo patogênico Paracoccidioides brasiliensis Alessandro Fernandes Vaz ativadora GTPase Rho e calcineurina subunidade b; e 12 genes para codificação de fatores virulência manifestaram aumento na expressão, como alfa-1,3 glucana sintase, catalase peroxissomal, fosfolipase A2, gliceraldeído 3-fosfato desidrogenase e alfa-1,2 mannosiltransferase. Para identificar e caracterizar genes envolvidos na transição de micélio para levedura de Paracoccidioides sp. (Pb01) sequências ESTs (expressed sequence tags) foram examinadas a partir de biblioteca de cdna. Essas análises revelaram 43 genes que foram induzidos durante o início da transição, os quais se relacionam a alguns aspectos metabólicos, como o aumento da síntese de proteínas, na glicosilação de proteínas, e no controle do enovelamento de proteínas (Parente et al., 2008). Como mencionado acima, a transição é um fator essencial para a patogenicidade em Paracoccidioides spp. Linhagens incapazes de se diferenciar para levedura não são virulentas. Sobre esse assunto, um dos aspectos importantes da relação entre Paracoccidioides spp. e o hospedeiro é o efeito de hormônios no dimorfismo do fungo. O hormônio ssssssssssssfeminino 17β-estradiol tem sido relacionado com a diferenciação do fungo. Shankar et al. (2011) examinaram a influência do hormônio 17β-estradiol na expressão de genes durante a transição morfológica do fungo. Os autores descreveram que ocorre a modulação da expressão de genes de várias categorias funcionais incluindo: resposta a choque térmico, manutenção/remodelamento da parede celular, metabolismo de energia, transporte e detoxificação, sinalização celular e elementos retro-transponíveis, durante a transição de micélio para leveduras. Devido à importância de se compreender a biologia do fungo, especificamente seu dimorfismo celular, fator essencial para o estabelecimento da doença, Rezende et al. (2011) realizaram um estudo proteômico visando a identificação das proteínas expressas durante as fases morfológicas de Paracoccidioides sp. (Pb01). Nos estudos foram identificadas 18 proteínas diferencialmente expressas na fase de micélio, entre elas, peroxiredoxina mitocondrial PRX1, Mn superóxido dismutase e aldeído desidrogenase; 30 proteínas na fase de transição (22 h) de micélio para levedura, como enolase, fosfoglicomutase, transaldolase e transcetolase; e 33 proteínas na fase de levedura, como fosfoglicerato quinase, frutose 1,6- bisfosfato aldolase 1, gliceraldeído 3-fosfato desidrogenase, isocitrato liase, enoil-coa hidratase e metilcitrato desidratase. As análises das categorias funcionais a que essas proteínas pertencem forneceu uma visão integrada da reorganização metabólica que ocorre durante a morfogênese do fungo. Nesse sentido, foi observado que a via glicolítica é induzida em levedura, sendo que algumas enzimas dessa via começam a se acumular durante a fase de transição; a via das pentoses fosfato é induzida durante a transição de micélio para levedura 23

26 Análise proteômica comparativa do processo de diferenciação celular do fungo patogênico Paracoccidioides brasiliensis Alessandro Fernandes Vaz podendo fornecer substratos para a glicólise, e proteínas envolvidas na manutenção do potencial redox intracelular e proteção contra o estresse oxidativo foram mais expressas em micélio (Rezende et al., 2011). Visto que o estudo do proteoma fornece informações sobre a natureza do produto final do gene, tais como a ocorrência de modificações pós-traducionais, localização subcelular e quantidade de proteínas (Cash, 2011), o presente estudo, realizou uma análise do processo de diferenciação celular de Paracoccidioides sp., a exemplo dos estudos realizados em nosso laboratório por Rezende et al. (2011). O isolado estudado foi o Pb18 (S1). Foram analisadas as proteínas diferencialmente expressas nas três fases do fungo: micélio, transição de micélio para levedura e levedura. A caracterização das proteínas relacionadas à diferenciação para a fase parasitária pode trazer novas percepções para a patogênese do fungo. Foi escolhido o tempo de 22 h de incubação após o início da transição, pois os trabalhos anteriores demonstraram alterações na expressão de transcritos nesse período de tempo (Bastos et al., 2007). A ferramenta utilizada foi cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massas para identificação das proteínas do isolado Pb18 durante o processo de diferenciação celular induzida pela alteração da temperatura. 24

27 Análise proteômica comparativa do processo de diferenciação celular do fungo patogênico Paracoccidioides brasiliensis Alessandro Fernandes Vaz 2. JUSTIFICATIVA Um dos aspectos necessários para que os fungos patogênicos Paracoccidioides spp. sejam bem sucedidos na colonização do hospedeiro é a alteração morfológica que ocorre durante a transição de micélio para levedura devido ao aumento da temperatura. Essa alteração é chamada de dimorfismo, uma capacidade que o fungo tem em sofrer uma mudança morfogenética para se adaptar ao ambiente. Assim, a patogenicidade está intimamente relacionada à diferenciação celular, visto que isolados que não são capazes de se diferenciar na forma leveduriforme não são virulentos. Esse dimorfismo é essencial para a patogenicidade e alguns aspectos dessa característica não foram ainda elucidados. Estudos anteriores no Laboratório de Biologia Molecular, com foco na diferenciação celular de Paracoccidioides sp. (Pb01), revelaram proteínas diferencialmente expressas nas fases de micélio, transição e levedura indicando que o fungo é capaz de passar por uma reorganização metabólica durante o dimorfismo térmico. Para uma melhor compreensão dos aspectos bioquímicos envolvidos na diferenciação celular do complexo Paracoccidioides, a proposta do presente estudo foi realizar uma análise proteômica do processo de diferenciação celular do isolado Pb18, para identificar quais proteínas são diferencialmente expressas nas fases de micélio, transição e levedura. A tecnologia empregada foi a proteômica e suas abordagens por cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massas foram utilizadas nesse estudo. Ao se investigar o proteoma, estudamos o produto final do gene no intuito de entender melhor os mecanismos moleculares da regulação da expressão gênica. Sendo assim, acreditamos que os dados obtidos podem contribuir para um melhor conhecimento dos processos envolvidos na morfogênese, virulência, resposta ao hospedeiro, bem como para o desenvolvimento de potenciais alvos antifúngicos. 25

28 Análise proteômica comparativa do processo de diferenciação celular do fungo patogênico Paracoccidioides brasiliensis Alessandro Fernandes Vaz 3. OBJETIVOS O objetivo geral desta proposta foi realizar estudos proteômicos para detectar e avaliar diferenças qualitativas e quantitativas nas proteínas de Paracoccidioides brasiliensis Pb18 nas três fases morfológicas do fungo: micélio, transição de micélio para levedura (22 h) e levedura, com o intuito de se propor um modelo da reorganização metabólica que ocorre durante o processo de diferenciação celular do fungo. 26

29 4. MANUSCRITO Title: Comparative proteomic analysis of the cell differentiation process in Paracoccidioides sp. Authors: Alessandro Fernandes Vaz a, Alexandre Siqueira Guedes Coelho b, Tereza Cristina Vieira Rezende a, Lilian Cristiane Baeza a, Célia Maria de Almeida Soares a, * a Laboratório de Biologia Molecular, Instituto de Ciências Biológicas, Universidade Federal de Goiás, Goiânia, GO, Brazil b Laboratório de Genética e Genômica de Plantas, Escola de Agronomia, Universidade Federal de Goiás, Goiânia, GO, Brazil Abstract: Paracoccidioides spp. are the etiological agents of paracoccidioidomycosis, the most important endemic systemic mycosis in Latin America. Paracoccidioides spp. are dimorphic fungi; mycelia is found in soil at temperatures below 25ºC, while in host tissues, and temperature around 36-37ºC the fungus takes the yeast form. Infection begins with the inhalation of conidia or mycelia propagules that upon reaching the host lungs differentiate into yeast, establishing disease. The morphological transition from mycelia-to-yeast is involved in the virulence of this pathogen and this aspect of morphogenesis deserves special attention due to its relevance to the fungal virulence. In the present study, we employed proteomic strategies using liquid chromatography coupled to mass spectrometry to evaluate the differential proteomic profile of cells (P. brasiliensis Pb-18 phylogenetic lineage S1) ongoing transition from mycelia-to-yeast after 22 h of temperature shift from 22ºC to 36ºC. Nine hundred and ninety-one proteins were identified (350 in the mycelia, 288 in the transition and 353 in the yeast), and 251 were differentially regulated. The analysis of the functional categories to which those proteins belong provided us a comprehension on the metabolic reprogramming that occurs during the cell differentiation process, providing putative virulence factors. Keywords: Paracoccidioides sp.; dimorphism; proteomic analysis. 1. Introduction 27

30 Paracoccidioides, a complex of several phylogenetic species, are dimorphic fungi first described by Adolpho Lutz in 1908 and are phylogenetically considered ascomycete from the family Ajellomycetaceae, order Onygenales (Lutz, 1908; Untereiner et al., 2004; Sturme et al., 2011). The fungi are the etiological agent of paracoccidioidomycosis (PCM), the most important endemic systemic mycosis in Latin America (Brummer et al., 1993). Paracoccidioides sp. is characterized by having thermal dimorphism, important in the mechanism of virulence and pathogenicity (San-Blas et al., 2002). The non-pathogenic filamentous fungus form has been described as saprophytic, which feeds from the decaying matter in the soil, either animal or vegetable growing in the mycelia form at temperatures below 25 C. The parasitic form grows at C, in which the fungus takes the yeast form (Bagagli et al., 2006; Desjardins et al., 2011). In vitro, the morphological transition can be reservibly reproduced by shifting the growth temperature from 22 C to 36 C (McEwen et al., 1987; Restrepo et al., 2001). It is currently accepted that the genus Paracoccidioides comprises four phylogenetic species: S1, PS2, PS3 and P. lutzzi harboring Pb01-like isolates (Matute et al., 2006; Teixeira et al., 2009). PCM is a systemic mycosis in which infection begins with inhalation of conidia or mycelia propagules that upon reaching the host lungs differentiate into yeast, establishing the disease. The capacity of the fungus to exist in two distinct morphologies, as mycelium and also as yeast cells, is defined as dimorphism and is considered virulence factor (Rappleye; Goldman, 2006). Strains which are not able to differentiate into yeast form, are not virulent. Since the transition to the parasitic form is essential for pathogenicity in the dimorphic fungi, the better understanding of the molecular mechanisms involved in this process is necessary (Hogan et al., 1996). In the transition, pathogenic fungi regulate gene expression, resulting in various changes in cell morphology, cell wall composition, presence of antigenic molecules and expression of virulence factors (Nunes et al., 2005; Theodoro et al., 2008; Klein et al., 2007). Thus, it is necessary to better understand how these fungi detect changes in temperature and regulate the transition, but the mechanisms that control this morphological change remain poorly understood (Nemecek et al., 2006). Studies of transcriptional profiles of Paracoccidioides sp. in order to identify specific transcripts of the stages of mycelium, yeast and dimorphic transition have been performed, and overall analysis of these genes suggests that ATP production is through the alcoholic fermentation in yeast and by respiratory chain in mycelium (Felipe et al., 2005). Bastos et al. (2007) evaluated the transcriptional profile of Paracoccidioides sp. during the early myceliato-yeast transition through analysis of expressed sequence tags (ESTs). The authors identified 28

31 the induction of 34 genes encoding proteins related to the synthesis and remodeling of the cell wall and membrane. Among genes the authors identified phosphoglucomutase, UDP-glucose pyrophosphorylase and alpha-1,3 glucan; 10 genes encoding to signal transduction proteins such as GTP binding protein and GTPase activating protein and 12 genes encoding putative virulence factors such as alpha-1,3 glucan synthase, peroxisomal catalase and glyceraldehyde- 3-phosphate dehydrogenase. Although these studies mentioned above have provided a basic understanding of probable cell alterations during the transition process, there are still some issues to be understood. In this context, proteomic approaches can be very useful to investigate the differentially expressed proteins during Paracoccidioides spp. morphogenesis, which could help us to understand the biochemical aspects involved in cell differentiation. Proteomic studies conducted by our group on the morphological transition of P. lutzii (Pb01) using twodimensional gel electrophoresis (2-DE) coupled to mass spectrometry allowed identifying 18, 30 and 33 proteins preferentially expressed, respectively in, mycelium, mycelia-to-yeast transition (during 22 h) and yeast cells (Rezende et al., 2011). The analysis of the functional categories to which those proteins belong provided an integrated view of the metabolic reorganization that occurs during morphogenesis of the fungus. It was observed that the glycolytic pathway was up-regulated in yeast. The pentose phosphate pathway was upregulated during the mycelia-to-yeast transition, providing substrates for glycolysis. Proteins involved in maintaining intracellular redox potential and protection against oxidative stress were more expressed in mycelia (Rezende et al., 2011). Here, we describe the cell differenciation process induced by temperature of Paracoccidioides brasiliensis using proteomic strategies. The presente study provides detailed data regarding the proteome of the tree fungal stages: mycelia, mycelia-to-yeast transition and yeast cells in the isolate Pb18. One thousand and forty one proteins, being 251 differentially expressed proteins, were identified using liquid chromatography (nanouplc) coupled to mass spectrometry. These proteins enable us to propose a model for the metabolic pathways that are preferentially used in mycelia and yeast cells increasing our understanding of the morphological transition and metabolic diversity depicted by phylogenetic species of genus Paracoccidioides.We believe that the obtained data can be relevant on the understanding of the thermal dimorphism to the fungal establishment in the host. 2. Materials and methods 29

32 2.1. Strain and culture conditions Paracoccidioides brasiliensis - Pb18, phylogenetic lineage S1, was used in this study. The yeast and mycelia phases were maintained in vitro by subculturing every 7 and 15 days, at 36 C and 22 C, respectively, in Fava Netto s semisolid medium [1% (w/v) peptone, 0.5% (w/v) yeast extract, 0.3 % (w/v) proteose peptone, 0.5% (w/v) beef extract, 0.5% (w/v) NaCl, 4% (w/v) glucose, 1.2% (w/v) agar, ph 7.2]. Cell differentiation of mycelia-to-yeast transition was performed in the same medium without the addition of agar. The mycelia phase was grown in liquid medium for 16 h at 22 C followed by incubation for 22 h at 36 C, as reported in other studies (Bastos et al., 2007; Rezende et al., 2011) Extraction of soluble proteins The cultures from the mycelia, the mycelia-to-yeast transition and the yeast cells were collected by centrifugation at 10,000xg for 10 min at 4 C, followed by three washing steps with sterile phosphate buffered saline solution 1X. The collected cells were ground in the presence of liquid nitrogen with mortar and pestle. The extraction buffer (20 mm Tris-HCl ph 8.8; 2 mm CaCl 2 ) containing protease inhibitors (serine, cysteine and calpain) (GE Healthcare, Uppsala, Sweden) was added to the material. After the addition of glass beads (0.45 mm), the material was vigorously mixed for 1 h at 4 C, followed by centrifugation at 10,000xg for 15 min at 4 C. The supernatant was collected and centrifuged at 20,000xg for 20 min at the same temperature. Next, the supernatant was then collected and samples were stored in aliquots at -80 C. Before samples were digested with trypsin, the protein extracts were washed (three times) with ammonium bicarbonate buffer (50 mm ph 8.5) and concentrated in Amicon Ultra 0.5 ml Centrifugal Filters (Millipore Corporation, MA, USA). The protein concentrations were determined using the Bradford reagent (Sigma- Aldrich), and bovine serum albumin (BSA) was used as a standard (Bradford, 1976) Sample preparation for nanouplc-ms E acquisition The protein extracts were subjected to tryptic digestion and analyzed using nanoscale liquid chromatography coupled with tandem mass spectrometry. Sample aliquots were prepared for nanouplc-ms E as previously described by Murad et al. (2011) and Murad and Rech (2012) with some modifications. A total of 300 µg (for each of the conditions evaluated) 30

33 of the protein samples was added to 10 µl of 50 mm ammonium bicarbonate in a microcentrifuge tube. Next, 150 µl of RapiGEST TM (Waters, USA) (0.2% v/v) was added, and the sample was vortexed and placed in a block heater set at 80 C for 15 min. The sample was briefly centrifuged, and 5 µl of 100 mm DTT (dithiothreitol) solution was added. The sample was vortexed and placed in a block heater set at 60 C for 30 min followed by centrifugation. Then, 5 µl of a 300 mm iodocetamide was added, and the sample was briefly vortexed and incubated in the dark at room temperature for 30 min. Next, a 60 µl aliquot of trypsin (Promega, Madison, WI, USA) prepared with 50 mm ammonium bicarbonate, to 50 ng/ µl, was added. The sample was briefly vortexed. The sample was digested at 37 C in a block heater overnight. To cleave and precipitate the RapiGEST TM, 18 µl of a 5% TFA (trifluoroacetic acid) solution was added, and the sample was vortexed, incubated at 37 C for 90 min in a block heater, and centrifuged at 20,000xg at 6 C for 30 min. The supernatant was transferred to a Waters Total Recovery vial (Waters, USA) and a solution of one pmol/ µl MassPREP Digestion Standard [rabbit phosphorilase B (PHB)] (Waters, USA) was used to prepare the final concentration of 750 fmol/µl of the PHB. The buffer solution of 20 mm ammonium formate was used to increase the ph NanoLC-MS E acquisition The nanoscale LC separation of tryptic peptides was performed using a nanoacquity TM system (Waters Corporation, USA) equipped with a nanoease TM 5µm x Bridge TM BEH130 C18 300µm x 50mm precolumn; trap column 5µm, 180µm x 20mm and BEH130 C µm, 100µm x 100mm analytical reversed-phase column (Waters, USA). The peptides were separated using a gradient of 10.8%, 14%, 16.7%, 20.4% and 65% of acetonitrile. The protein GFP ([Glu1]-Fibrinopeptide B human (Sigma-Aldrich) was used for calibration of the apparatus. The tryptic peptides were analyzed using a Synapt mass spectrometer (Waters, Manchester, UK) with a quadrupole/time-of-flight (Q-TOF). All analyses were performed using a positive nanoelectrospray ion mode (nanoesi +) and the TOF analyzer of the mass spectrometer was externally calibrated with GFP Data processing and protein identification The MS data that were obtained from the LC-MS E analysis were processed and searched using the ProteinLynx Global Server version 2.4 (Waters, Manchester, UK) as 31

34 previously described (Murad et al., 2011). Protein identifications and quantitative data packaging were performed using dedicated algorithms (Silva et al., 2006; Li et al., 2009) and a search against the Paracoccidioides database (http://www.broadinstitute.org/annotation/genome/paracoccidioides_brasiliensis/multihome. html). The ion detection, clustering, and log-scale parametric normalizations were performed in ProteinLynx Global Server with an Expression E license installed (Waters, Manchester, UK). The intensity measurements were typically adjusted for these components, i.e., the deisotoped and charge state reduced EMRTs (exact mass retention time) that were replicated throughout the entire experiment for the analysis at the EMRT cluster level. Components were typically clustered with a 10 ppm mass precision and a 0.25 min time tolerance against the database-generated theoretical peptide ion masses with a minimum of one matched peptide. The alignment of elevated-energy ions with low-energy precursor peptide ions was performed with an approximate precision of 0.05 min. The searches were performed with fixed modification of carbamidomethyl-c, and variable modifications were phosphorylation of serine, threonine and tyrosine. One missed cleavage site was allowed. The precursor and fragment ion tolerances were determined automatically. The protein identification criteria also included the detection of at least two fragment ions per peptide, five fragments per protein and the determination of at least one peptide per protein; the identification of the protein was allowed with a maximum 4% false positive discovery rate in at least three technical replicate injections. For the analysis of the protein identification and quantification level, the observed intensity measurements were normalized to the intensity measurement of the identified peptides of the digested internal standard. Protein tables generated by ProteinLynx Global Server were merged, and the dynamic range of the experiment was calculated using the software program MassPivot v1.0.1 (Murad; Rech, 2012). The peptide and protein tables were compared using the Spotfire v8.0 software, suitable graphics were generated for all data. Microsoft Excel (Microsoft, USA) was used for table manipulations Bioinformatics analysis For hypothetical proteins the BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) on NCBI database (www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/) search was performed (were considered as significance criterion for alignment e-value less than about 9-66 and a value of identity upper 58%). For cellular localization prediction, the WoLF PSORT bioinformatics tool was used 32

35 (Horton et al., 2007). To classify proteins according the functional categories they belong, the identified proteins were analyzed by using the Pedant - Gene and Genetic Element Search of Biomax (http://pedant.gsf.de.) and were classified following the model of MIPS FunCat2 (Munich Information Center for Protein Sequences Functional Catalogue) database (Ruepp et al., 2004) Comparative analysis of the conditions Following identification of proteins from mycelia, mycelia-to-yeast transition and yeast, a comparative analysis was performed as follows: transition versus mycelia, transition versus yeast, and mycelia versus yeast. For all these comparisons the cutoff based on the log2 fold change, proteins with log2 higher than 0.38 or less than (1.3-threshold) were selected and classified as up- and down-regulated proteins, respectively Statistical analysis of the three conditions The differences in protein expression levels among the three conditions were tested using the one-way ANOVA procedure. When declared statistically significant by ANOVA, the differences among the means were evaluated using Tukey s test. The statistical analyses were performed using R software (http://www.r-project.org/). A p-value equal to or less than 0.1 was considered statistically significant. For this analysis, only proteins detected in at least two replicates were evaluated, in at least one of three conditions. Then, 347 proteins were analyzed (Table S1, Supporting Information). The MultiExperiment Viewer (MeV) software V.4.9 (www.tm4.org/mev/) was used to group the comparative proteomic data, as previously described by Pigosso et al. (2013). To analyze the difference in expression of proteins, the levels estimated for each protein were used to build a heat map. The differences in the proteomic profiles were examined by hierarchical clustering using the Pearson correlation as a measure of similarity. 3. Results 3.1. Cell differentiation of P. brasiliensis 33

36 To identify the proteins differentially expressed during cell differentiation of P. brasiliensis isolate Pb18 we submitted the fungus to mycelia-to-yeast morphological transition by induction of temperature increase of 22 C to 36 C for 22 h, since it is the temperature that induces phase change in dimorphic fungi (Maresca; Kobayashi, 1989). The morphological transition of P. brasiliensis may be observed in Figure 1. This mycelia-to-yeast transition or thermal dimorphism is required for pathogenicity and establishment of PCM in the mammalian host (Nemecek et al., 2006) Identifying proteins by nanouplc-ms E In this study, we applied a proteomic strategy to identify proteins that were differentially expressed by the mycelia phase, mycelia-to-yeast transition and yeast cells of P. brasiliensis Pb18. The proteomic approach was performed using nanouplc-ms E as previously described (Murad et al., 2011; Murad; Rech, 2012). The resulting nanouplc-ms E peptide data generated by the ProteinLynx Global Server version 2.4 (Waters, Manchester, UK) process are shown in Figure S1. In this study 2,138 peptides were identified in mycelia, 1,901 in mycelia-to-yeast transition and 2,851 peptides in yeast. The false positive rates of proteins from of the three conditions data were 0%. Figure S2 shows the peptide parts per million error (ppm) indicating that more than 86% of the peptides were detected with an error of less than 10 ppm in the three conditions. Figure S3 shows the results obtained from dynamic range detection indicating that a 3-log range concentration and a good detection distribution of high and low molecular weights were obtained for the three conditions. The experiment revealed 991 proteins were identified in total from three protein extracts (mycelia, mycelia-to-yeast transition and yeast), as shown in Figure 2. This methodology allowed us to identify a larger number of proteins than the 2DE technique (two-dimensional gel electrophoresis) used by Rezende et al. (2011) to study the morphogenesis of P. lutzii Bioinformatics results The 991 identified proteins in total (350 in the mycelia, 288 in the transition and 353 in the yeast), corresponds to 555 different types of protein. Within this latter group, 124 (22%) proteins belong to the group of hypothetical proteins (conserved hypothetical protein, hypothetical protein and predicted protein). We performed BLAST on NCBI for these 124 proteins, and observed that 55 proteins had a significant alignment to known others, and 69 34

37 proteins remained hypothetical. According to the cellular localization, most of the identified proteins are cytoplasmic (42.16%) while the total protein (8,755 proteins) annotated in the database for P. brasiliensis - Pb18 most are nuclear proteins followed by mitochondrial and cytoplasmic proteins (Figure S4). We identified a large number of cytoplasmic proteins, since it does not use specific protocols for subcellular proteome and the aim of this study was to identify soluble proteins in the cytoplasm to better understand cellular metabolism of the differentiation process in P. brasiliensis Proteomes of the differentiation process in P. brasiliensis Pb18 A comparative proteomic analysis was performed among the protein profiles comparing mycelia and yeast phases, transition and mycelia phases, and transition and yeast phases (Tables S2, S3, S4, S5, S6 and S7). The criteria for the comparison were based on log2 fold change (1.3-threshold). The analysis of these proteins provides an overview of the metabolic reorganization that occurs during the morphological transition of P. brasiliensis Pb Up- and down-regulated processes in the mycelia and yeast phases When comparing mycelia and yeast phases, 412 proteins were differentially expressed. Among them, 200 proteins were up-regulated in the mycelia phase compared to the parasitic phase and 212 showed higher level of expression (up-regulated) in the yeast phase, as shown in the Tables S2 and S3, respectively. The abundantly proteins expressed in the mycelia phase include proteins related to the process of transcription, protein synthesis and cellular transport, while in yeast phase proteins related to metabolism, energy and protein fate had increased expression (Figure S5). In the category of metabolism, yeast presents many proteins related to amino acid and lipid metabolism whereas mycelia had proteins related do nitrogen metabolism (Table S2 and S3). Regarding to the category of energy, yeast had proteins related to pathways associated with glycolysis and gluconeogenesis, pentose-phosphate, betaoxidation and tricarboxylic-acid cycle; mycelia had proteins related to respiratory chain and fermentation (Table S2 and S3). Proteins related to maintenance of the intracellular redox and protection against oxidative stress were also identified in this comparison, such as Mnsuperoxide dismutase (PADG_01755 and PADG_01954), catalase A, mitochondrial peroxiredoxin PRX1 and aldehyde dehydrogenase (PADG_05081 and PADG_03099), that 35

38 were up-regulated in the mycelia phase. On the other hand, Cu/Zn-superoxide dismutase, cytochrome c peroxidase and peroxisomal catalase were abundant in the yeast form. The upregulated metabolic processes in mycelium and yeast phases are summarized in Figure Up- and down-regulated processes in the mycelia-to-yeast transition and mycelia phases In this comparison 403 proteins were differentially expressed. In the mycelia-to-yeast transition 169 proteins were up-regulated (Table S4) and 234 proteins were overexpressed in the mycelia phase (Table S5). These identified proteins were classified into different functional categories according to MIPS FunCat2, such as metabolism, energy, protein synthesis, protein fate, and cell rescue, defense and virulence (Figure S6). Eight proteins of the glycolytic pathway, as hexokinase, phosphoglucomutase, glucose-6-phosphate isomerase, triosephosphate isomerase, glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, 2,3- bisphosphoglycerate-independent phosphoglycerate mutase, enolase and pyruvate kinase were up-regulated after 22 h of fungal transition from mycelia-to-yeast (Table S4). Proteins related to the tricarboxylic-acid cycle, such as pyruvate dehydrogenase E1 component subunit alpha and beta, 2-oxoglutarate dehydrogenase E1, succinyl-coa ligase (PADG_02260 and PADG_00317) and fumarate reductase were abundant in mycelia compared with transition phase (Table S5). Proteins involved with transcription process and protein synthesis were more expressed in the mycelia phase, particularly ribosomal proteins Up- and down-regulated processes in the mycelia-to-yeast transition and yeast phases By observing the comparison of the mycelia-to-yeast transition against yeast form we note that 380 proteins were modulated. In the mycelia-to-yeast transition 159 proteins were up-regulated and 221 proteins were most abundantly in the yeast phase (Table S6 and S7, respectively). These proteins are implicated in a variety of biological processes, such as metabolism, energy, protein fate, protein synthesis, and cell rescue, defense and virulence (Figure 7). Among the proteins up-regulated in the transition stage that are related to the process of obtaining energy, 4 proteins play a role in alcoholic fermentation, such as pyruvate decarboxylase and alcohol dehydrogenase (PADG_02271, PADG_06709, and PADG_07885). The up-regulated proteins in the yeast phase include those associated with 36

39 pathways of beta-oxidation, glycolysis and tricarboxylic-acid (Table S7). The proteins involved in the metabolism of amino acids were also more expressed in the yeast phase, compared to the transition Comparative analysis of the three stages A comparative analysis was performed among the protein profiles depicted by the mycelia, mycelia-to-yeast transition and yeast phases using the one-way ANOVA procedure. Using protein identification in at least two replicates, in at least one of three conditions as a filter, 347 were evaluated (Table S1). Statistical analysis showed that 251 of the 347 proteins were significant with p-value less than 0.1. The 251 differentially expressed proteins gave rise to six tables containing proteins up-regulated in the mycelia, mycelia-to-yeast transition and yeast cells (Tables 1, 2 and 3, respectively) and proteins down-regulated in each phase of cell differentiation (Tables 4, 5 and 6). In the mycelia phase 62 proteins were up-regulated (Table 1). The proteins are involved in several biological processes, as energy related to electron transport and energy conservation, cell cycle and DNA processing, transcription and protein synthesis. During the morphological transition 41 proteins were up-regulated (Table 2), proteins related with pathway of glycolysis, glyoxylate cycle and biogenesis of cellular components associated with cell wall had increased expression. In the parasitic phase 72 proteins were most abundant (Table 3); proteins associated with amino acid metabolism, glycolysis and gluconeogenesis, tricarboxylic-acid cycle and cell rescue, defense and virulence were up-regulated in the yeast form. The levels of abundance of proteins related major metabolic pathways were combined and used in building of the heat map, as shown in Figure 4 (and Figure S8). 4. Discussion The morphological transition that Paracoccidioides spp. presents is essential for the establishment of the PCM and the thermal dimorphism is considered a virulence factor (Hogan et al., 1996; Rappleye; Goldman, 2006). This highlights the need to better understand the molecular mechanisms involved in this process. In order to better understand the cell differentiation process in Paracoccidioides spp. transcriptional profiles of each phase of the fungus as well as the morphological transition have been studied previously (Felipe et al., 2005; Nunes et al., 2005; Bastos et al, 2007). The first proteome study related to the 37

40 morphological transition of mycelia-to-yeast was conducted by Rezende et al. (2011) using 2- DE approach. The present work was the first to investigate the proteomic profile of the differentiation process in P. brasiliensis using liquid chromatography (nanouplc) coupled to mass spectrometry. By analyzing the proteome of mycelia, mycelia-to-yeast transition and yeast phases we identified 991 proteins (350 in the mycelia, 288 in the transition and 353 in the yeast), among which, 251 were differentially expressed. When comparing mycelia and yeast phases we note that yeast cells of P. brasiliensis Pb18 had differential expression of proteins related to the glycolytic pathway and the betaoxidation. The mycelia phase preferentially expressed proteins related to the respiratory chain and surprisingly, proteins involved in alcoholic fermentation (Figure 3) in contrast to previous descriptions. Felipe et al. (2005), analysed the transcriptional profiles of mycelia and yeast phases, and suggested that yeast cells have a more anaerobic metabolism with ATP production from alcoholic fermentation, compared to mycelia. Rezende et al. (2011) analyzing the proteome of P. lutzii (Pb01) also demonstrated that the fermentation process occurs preferentially during the morphological transition from mycelia-to-yeast and yeast phase. In our analysis, the enzyme pyruvate decarboxylase responsible for the conversion of pyruvate to acetaldehyde had a higher expression in mycelia and mycelia-to-yeast transition than in yeast form (Table S2 and Figure 4C). In accordance with this, the protein aldehyde dehydrogenase was up-regulated in mycelia phase (Tables 1 and S2), being responsible for the conversion of acetaldehyde into acetyl-coa. As the product of the pyruvate decarboxylase (acetaldehyde) is toxic to cell, the aldehyde dehydrogenase participates in detoxification. This demonstrates the metabolic diversity that phylogenetic species of genus Paracoccidioides present and shows the need for more studies of this fungus. When comparing the three stages of the differentiation process of P. brasiliensis Pb18, we found that glycolysis may occur in higher intensity in yeast cells (Figure 4A). The beta-oxidation may occur in more activity in the yeast form (Figure 3 and 4B). Consistent with these results, the proteomic analysis of yeast cells of Paracoccidioides spp. showed that the Pb339 isolate, belonging the same phylogenetic species (S1) that the Pb18 isolate, metabolically favor the degradation of lipids by beta-oxidation to yield energy (Pigosso et al., 2013). The metabolism of fatty acids seems important for the virulence of Cryptococcus neoformans in mammals, since transcriptional profiles of C. neoformans revealed that genes for peroxisomal-oxidation, fatty acid import and lipid degradation were up-regulated upon pathogen internalization and during pulmonary infection (Kretschmer et al., 2012). The betaoxidation can generate acetyl-coa and propionyl-coa. The latter could be assimilated by the 38

41 methylcitrate cycle to produce pyruvate. In this context, proteins such as fumarate hydratase and 2-methylcitrate dehydratase are up-regulated in yeast phase, suggesting that methylcitrate cycle can be induced in the parasitic phase (Table 3 and Figure 3). If this metabolic aspect can influence the virulence of yeast cells of Pb18, could be the subject of further studies. The proteins that are involved in mitochondrial electron transport associated to respiration were identified in higher abundance in mycelia and yeast stages (Figure 4E). Subunits of ATP synthase (such as ATPase alpha subunit, ATP synthase subunit beta and ATP synthase D chain mitochondrial) were more expressed in the mycelia form, suggesting that in this phase the process of obtaining energy through aerobic respiration may be activated as previously described by transcriptional and proteomic analysis (Felipe et al., 2005; Rezende et al., 2011). About the process of obtaining energy, two enzymes related to gluconeogenesis, pyruvate carboxylase and phosphoenolpyruvate carboxykinase, were up-regulated in yeast cells (Table 3). One of the reasons to find enzymes of gluconeogenesis is the fact that the majority of yeast cells would be phagocytosed by neutrophils and monocytes in the blood, thus exposing the fungus to the phagosome, a microenvironment poor in glucose. For fungi survive the low availability of glucose yeast cells begin the glucose production by gluconeogenesis pathway (Tavares et al., 2014). Furthermore, a study of carbon starvation of the fungus indicates that in glucose absence the pathogen use the gluconeogenesis process as the fungal adaptation to the host (Lima et al., 2014). In fungi, heat shock proteins (HSPs) are modulated in response to various stimuli, including temperature (Burnie et al., 2006). As the process of cell differentiation in Paracoccidioides spp. to the parasitic phase is related to increase of the temperature, the HSPs are expected to accumulate during the morphological transition (Rappley; Goldman, 2006). Several HSPs have been found in our analysis (Tables 1-3); the heat shock protein (PADG_07715) was more abundant in mycelia phase and HSPs up-regulated in yeast cells includes SSC1, Hsp88 and STI1 (Figure S8). The hsp70-like protein (PADG_03562) was overexpressed in the mycelia-to-yeast transition and hsp70- like protein (PADG_08118) during the transition and yeast phase. Although identified in mycelia phase, both hsp70 proteins were more abundant in the mycelia-to-yeast transition and yeast phases, suggesting that hsp70 may be associated with the adaptation of the fungus at high temperatures. About it, Goldmam et al. (2003) showed by transcriptional analysis that hsp70 was clearly induced at 5 h after the temperature increase. 39

42 In the filamentous form, proteins associated to cell rescue, defense and virulence includes the catalase A (PbCatA), whereas in yeast cells the protein peroxisomal catalase (PbCatP) was more abundant (Tables S2 and S3, respectively). We related this finding to the fact that PbCatA is associated to Paracoccidioides spp. protection against endogenous oxidative stress and the PbCatP provides protection against exogenous production of hydrogen peroxide as those produced by macrophages during infection (Chagas et al., 2008; Grossklaus et al., 2013). The Mn-superoxide dismutase (MnSOD) and mitochondrial peroxiredoxin PRX1 (PRX) proteins were abundant in mycelia stage (Table 1, 5 and S2).These proteins are involved in preventing oxidative stress in mitochondria (Luk et al., 2005; Chae et al., 1994). The up-regulation of MnSOD and PRX suggests a need for increased protection against reactive oxygen species derived from respiration due to the fact the mycelia favor aerobic metabolism (Rezende et al., 2011; Felipe et al., 2005). Regarding the possible virulence factors and proteins important in cell dimorphism of Paracoccidioides spp. we identified: gp43 (glucan 1,3-beta-glucosidase), glyceraldehyde-3- phosphate dehydrogenase (GAPDH), enolase and 4-hydroxylphenyl pyruvate dioxygenase (4- HPPD). The gp43 protein is a secreted glycoprotein of 43 kda with 416 amino acids and is partially responsible for yeast cell adhesion to components of the extracellular matrix and seems to play an important role during host-pathogen interaction, since low expression of gp43 reduced fungal burden in mice lungs (Cisalpino et al., 1996; Torres et al., 2013). In this work, the protein gp43 (PADG_07615) was up-regulated in the mycelia-to-yeast transition and may play a role in adherence to host cells during morphological transition, crucial for the establishment of PCM (Hogan et al., 1996). Enolase protein, which is involved in glycolysis and gluconeogenesis pathways, has been described as a virulence factor that binds to plasminogen and mediates the interaction of yeast forms with host cells and was found on the cell surface and secretome of Paracoccidioides sp. (Nogueira et al., 2010; Bailão et al., 2012; Weber et al., 2012). Herein, the enolase was up-regulated in the mycelia-to-yeast transition being abundant in yeast phase too (Table 2). Like enolase, GAPDH was characterized as an adhesin from Paracoccidioides sp. (Pb01), which can be related to fungus adhesion and invasion. Moreover, the treatment of Paracoccidioides sp. with anti-gapdh and the incubation of pneumocytes with the recombinant protein promoted inhibition of adherence and internalization of the fungus (Barbosa et al., 2006). In our analysis, the GAPDH was down-regulated in the mycelia phase, and highly expressed in the mycelia-to-yeast transition and the parasitic phase (Table 4). The proteome profiling of the dimorphic fungus Penicillium marneffei also reported GAPDH as an 40

43 importat adhesion factor for conidial attachment (Lau et al., 2013). The gene encoding the enzyme 4-HPPD, involved in the second step of aromatic amino acid catabolism, has been evaluated as a new potencial drug target through the use of NTBC [2-(2-nitro-4- trifluoromethyl-benzoyl)-cyclohexane-1,3-dione], a specific 4-HPPD inhibitor (Surme et al., 2011). Nunes et al. (2005), by transcriptome analysis, observed that 4-HPPD was higly overexpressed during the mycelia-to-yeast transition and that NTBC was able to inhibit the dimorphic transition in a dose-dependent manner. In our study, 4-HPPD was dow-regulated in the mycelia phase with increased expression during the mycelia-to-yeast differentiation process (Table 4). Taken together, our data reinforce that during the morphological transition of myceliato-yeast cells, P. brasiliensis undergoes a metabolic reorganization seeking for adaptation to the increased temperature in the host. This study evidences that P. brasiliensis Pb18 favors the beta-oxidation and glycolysis pathways in the parasitic phase. Surprisingly the fermentation process is activated in mycelia along with ATP production by the respiratory chain, compared to yeast cells. Some virulence factors were also accumulated in the dimorphic transition and yeast cells, showing that the first 22 h of the cell differentiation process is the beginning of the production of proteins associated to the cell adhesion for establishment of PCM. 41

44 Figures Figure 1 - Cell differentiation of Paracoccidioides brasiliensis Pb18. A - mycelium cultured on potato agar for 13 days at 22 C; the arrows indicate the production of conidia (1) and chlamydospores (2) (magnification x 1,000). B - cells undergoing the mycelia-to-yeast transition at 36 C after 22 h in Fava Netto's medium; arrows indicate the morphological change that occurs in hyphae to yeast (magnification x 400). C yeast cells cultured in Fava Netto's medium during 7 days at 36 C (magnification x 400). Cells were stained with lactophenol cotton-blue. Microscope Axio Scope A1 (Zeiss). 42

45 Figure 2 - Venn diagram showing identified proteins overlap of the three protein conditions. The number in parentheses indicates the number of identified proteins for each sample (mycelia, mycelia-to-yeast transition and yeast). 43

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