Allium cepa test system as a bio indicator of cytogenotoxicity of watercourses

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1 Sistema teste de Allium cepa como bioindicador da citogenotoxicidade de cursos d'água Cristina Copstein Cuchiara, Clarissa de Souza Borges, Vera Lucia Bobrowski 1 Universidade Federal de Pelotas, Instituto de Biologia, Departamento de Botânica, Laboratório de Cultura de Tecidos de Plantas, Campus Universitário s/n, Caixa Postal 354, CEP , Capão do Leão, RS, Brasil (cccuchiara@hotmail.com) 2 Universidade Federal de Pelotas, Instituto de Biologia, Departamento de Zoologia e Genética, Laboratório de Genética, Campus Universitário s/n, Caixa Postal 354, CEP , Capão do Leão, RS, Brasil. Resumo - O objetivo deste trabalho foi avaliar a citogenotoxicidade do Arroio Padre Doutor por meio do sistema teste Allium cepa (cebola comum) como bioindicador. Realizaram-se testes de análise de crescimento de raízes e índice mitótico (IM) em células meristemáticas radiculares tratadas com águas de 4 pontos do arroio e água destilada como controle. Na primavera, para crescimento das raízes, apenas a amostra do diferiu do controle. No outono, os resultados para IM e crescimento das raízes foram significativos nas diferentes amostras de água testadas, comprovando o efeito tóxico e citotóxico das mesmas. A estação do ano em estudo foi mais sensível aos testes realizados e aos efeitos dos mesmos. No inverno, os resultados da análise do IM foram significativos nos pontos testados, onde o controle não diferiu dos demais pontos enquanto apenas o diferiu do, onde se observou diminuição no IM. Por meio do bioensaio realizado não foram detectados efeitos genotóxicos significativos nos parâmetros macroscópicos analisados nas diferentes estações do ano nem efeitos citotóxicos influenciando o índice mitótico as células meristemáticas de cebola. Palavras-chave: cebola, citotoxicidade, genotoxicidade, biomonitoramento, mutagenicidade, aberrações cromossômicas Allium cepa test system as a bio indicator of cytogenotoxicity of watercourses Abstract - The objective of the present study was to evaluate the cytogenotoxicity of the Arroio Padre Doutor stream using the Allium cepa (common onion) system as a bio indicator. For both tests analysis of root growth and the mitotic index (MI) of meristematic root cells, treated with water from four points of the stream, was performed. Distilled water was used as a control. In the spring, only the sample taken from Point 3 of the stream differed from control, for the variable root growth. In the autumn, the statistical results for the variables MI and root growth were highly significant for the different water samples tested, confirming the toxic and cytotoxic effect. This season of study was most sensitive to the tests and the effects thereof. In winter, the results of MI analysis were highly significant for the points tested, as control did not differ from other points, while only Point 4 differed from Point 2, where a decrease in MI was observed. Bioassay performed using the Allium test did not detect significant genotoxic effects in macroscopic study in different seasons, and cytotoxic effects influencing the mitotic index of onion meristematic cells were not observed. Keywords: onion, cytotoxicity, genotoxicity, biomonitoring, mutagenicity, chromosomes aberrations Introdução Muitos problemas de saúde humana, incluindo alguns tipos de câncer, atualmente, são atribuídos à presença de diversos contaminantes presentes no meio ambiente e na água (Fatima & Ahmad, 2006; Barbério et al., 2009). Resíduos industriais, urbanos e agrícolas são lançados indiscriminadamente nos cursos d'água acrescentando vários contaminantes às águas superficiais e sedimentos (Egito et al., 2007). Para a avaliação, monitoramento e detecção de contaminantes no ambiente, os bioensaios com plantas superiores têm sido recomendados (Grant, 1999). O teste de Allium cepa desenvolvido por Levan (1938) é considerado uma ferramenta útil para a pesquisa básica do potencial genotóxico e citotóxico de produtos químicos, substâncias complexas como extratos de plantas, dejetos industriais e, principalmente, águas contaminadas. A utilização de Allium cepa L. (cebola comum) tem sido recomendada para análises de efluentes devido a sua elevada sensibilidade, baixo custo, rapidez, facilidade de manipulação e da utilização de amostras sem tratamento prévio, determinando-se a diminuição do índice mitótico e a formação de aberrações cromossômicas (Leme & Marin- Morales, 2009). Sendo utilizado rotineiramente em todo o mundo em laboratórios que trabalham com testes de genética toxicológica, considerado uma ferramenta valiosa quanto à determinação da contaminação ambiental, havendo extenso banco de dados de substâncias químicas já testadas (Fiskesjö, 1993). O Allium Teste fornece dois tipos de toxicidade. Parâmetros macroscópicos que podem ser observados consistem em formação de tumores, avaliação de crescimento de raízes e raízes torcidas, entre outros. Índice mitótico, para a análise de taxa de divisão celular, aberrações cromossômicas, como: cromossomos em anel, pontes 33

2 cromossômicas, cromossomos pegajosos, retardos cromossômicos, que ocorrem principalmente nas fases de metáfase e anáfase e formação de micronúcleos, como indicadores de anormalidades no DNA, perfazem parâmetros microscópicos (Monarca et al., 2000). Este teste tem sido validado internacionalmente como bioindicador de amostras ambientais (Evseeva et al., 2003), sendo utilizado como teste preliminar para avaliar o potencial genotóxico e citotóxico de substâncias cancerígenas e como bioindicador de contaminação ambiental (Barbério et al., 2009). Devido ao crescimento da população, consequente aumento do consumo e variações climáticas sazonais bem definidas, estudos com cursos d'água tornam-se necessários para o monitoramento das condições da água utilizada pela população (Cuchiara, 2007). O objetivo desse trabalho foi avaliar a citotoxicidade e a genotoxicidade de cursos d'água por meio do sistema teste Allium cepa como bioindicador, verificando os danos causados em células meristemáticas radiculares. Material e Métodos A Universidade Federal de Pelotas (UFPel), que tem seu campus universitário situado na cidade do Capão do Leão, Estado do Rio Grande do Sul, Brasil (31º 48' 24,85 S e 52º 24' 46,16 O) consome água do Arroio Padre Doutor, que atravessa zonas industriais, urbanas e rurais, considerado de importância econômica e social para a região (Cuchiara, 2007). O estudo foi realizado ao longo do Arroio Padre Doutor de forma sazonal nas estações de primavera, verão, outono e inverno, nos meses de outubro de 2006, fevereiro de 2007, maio de 2007 e junho de 2007, respectivamente, entre 8 e 12h da manhã. Foram coletadas amostras de água de superfície em diferentes pontos pré-determinados e selecionados de forma a se abordar quatro áreas de influência, de acordo com a Tabela 1. Em cada ponto a água foi coletada em recipiente de polietileno de 5 L e esses foram mantidos sob refrigeração e transportados ao Laboratório de Genética, Departamento de Tabela 1. Localização e descrição dos pontos de coleta de água nas diferentes áreas de influência ao longo do Arroio Padre Doutor nas diferentes estações do ano. Laboratório de Genética, DZG/IB, UFPel, Pelotas, RS, 2006/2007. Coleta de água Localização Nascente Capão do Leão 31 46'56,80 S Ponte Jaguarão 52 28'10,66 O Ponte Embrapa 31 44'50,20 S 52 29'13,48 O 31 45'25,99 S 52 29'19,25 O 31 48'30,18 S ,41 O Descrição Localizado na nascente do arroio, na Ponte do Arroio Moreira, região que corta a BR-293, estrada que liga Pelotas a cidade de Bagé (RS) Localizado na Barragem do Arroio Moreira onde ocorre a coleta de água para abastecimento da população da cidade de Capão do Leão (RS) Localizado sob a Ponte sobre o Arroio Teodósio, região que corta a BR-116, estrada que liga Pelotas (RS) a cidade de Jaguarão (RS) Localizado próximo ao Campus da Universidade Federal de Pelotas (UFPel) sob domínio da Embrapa. Zoologia e Genética, Instituto de Biologia da Universidade Federal de Pelotas, onde foram realizadas as análises. Para o teste foram utilizados 10 bulbos de cebola para cada ponto de coleta, com aproximadamente 20 mm de diâmetro e com catáfilo externo retirado. Posteriormente foram acondicionados em tubos de ensaio fixos em estantes (Figura 1), na qual permaneceram durante 72h com a área radicular imersa nas diferentes amostras do arroio (Figura 2) e em água destilada como controle negativo. A água testada foi trocada a cada 24h. Ao final das 72h, as raízes dos bulbos de cebola foram observadas e medidas, com auxílio de uma régua milimetrada, para a análise de morfologia e do comprimento radicular. Para análise das amostras de água, raízes dos bulbos foram escolhidas aleatoriamente e retiradas após 48h, identificadas em frascos de 10 ml, fixadas em Carnoy (3:1, álcool etílico:ácido acético) por um período de 24h à temperatura ambiente e, após, acondicionadas em refrigeração para posterior análise. Figura 1. A. cepa com a área radicular imersa nas diferentes amostras de água de Arroio Padre Doutor. 34

3 mesmo ocorreu no controle crescido na água destilada. Nesse caso não houve ação tóxica das amostras testadas. Tabela 2. Médias das variáveis IM (índice mitótico) e crescimento das raízes, observadas em bulbos de A. cepa submetidas às diferentes amostras de água do Arroio Padre Doutor nas diferentes estações do ano. Laboratório de Genética, DZG/IB, UFPel, Pelotas, RS, Figura 2. Detalhe da raiz de A. cepa submersa na água testada do Arroio Padre Doutor. Para análise citogenética foi empregada a técnica de esmagamento (Guerra & Souza, 2002), hidrolisadas em HCl 5N por quinze minutos em temperatura ambiente, lavadas em água destilada e coradas com orceína acética 2%. A observação das lâminas foi realizada em microscópio óptico a uma magnitude de 400x, através da técnica de varredura, sendo contadas 2000 células por ponto de coleta, observando-se o número de células em cada fase da mitose. Foi também analisado a presença de aberrações cromossômicas para detecção de danos ao DNA a nível qualitativo. Em delineamento inteiramente casualizado, os resultados foram avaliados através da análise de variância e do teste de Duncan para a comparação de médias, utilizando-se o programa estatístico Sanest (Zonta & Machado, 1984). Resultados e Discussão O Allium teste é utilizado para avaliar a qualidade de águas de fundo, superfícies e efluentes, como uma forma simples de estudo de parâmetros macroscópicos, tanto valores de inibição de crescimento de raízes e parâmetros citológicos quanto aberrações celulares em metáfases ou anáfases e inibição de células em divisão (Fiskesjö, 1988; Vesna et al., 1996; Barbério et al., 2011). Durante a realização do Allium teste na primavera, outono e inverno, as cebolas utilizadas nos biotestes com amostras de água dos diferentes pontos de coleta e do controle em observação macroscópica apresentaram crescimento normal e regular de suas raízes, não havendo necrose nem mal formação, não verificando-se toxicidade das amostras de água. Já na coleta de verão, as cebolas apresentaram pouco crescimento radicular, mas não apresentaram nenhuma anormalidade e/ou necrose. O Época do ano Primavera Verão Outono Inverno Coletasde água IM 3,37 a 4,80 a 3,51 a 3,16 a 3,15 a 37,71 8,12 a 6,20 a 7,04 a 9,19 a 8,95 a 18,99 5,45 b 8,18 ab 6,99 b 11,09 a 7,31 b 15,44 7,37 ab 6,92 ab 4,68 b 5,15 ab 7,60 a 15,91 Crescimento das raízes 1,66 b 1,93 ab 2,10 ab 2,73 a 2,29 ab 10,15 0,65 a 0,82 a 0,80 a 1,01 a 0,88 a 18,34 0,77 c 1,82 ab 2,20 a 1,34 bc 1,42 abc 13,37 1,12 a 1,68 a 1,33 a 1,48 a 1,57 a 10,83 Médias seguidas de letras distintas, nas colunas, diferem estatisticamente entre si, pelo teste de Duncan ao nível de 1% de probabilidade. CV = Coeficiente de variação Quando analisados os resultados do índice mitótico (IM) no Allium teste na coleta de primavera não foram observadas diferenças estatísticas significativas (p>0,01) (Tabela 2). Resultados similares foram descritos por Iganci (2006), onde não foi observada uma variação considerável quanto ao efeito citotóxico da água do Rio São Lourenço sobre as células meristemáticas de cebola, uma vez que o IM não diferiu significativamente entre o grupo controle e os tratamentos analisados. Para a variável crescimento das raízes, apenas a amostra do diferiu do controle (p<0,01). Os resultados do controle não diferiram significativamente daqueles dos Pontos 1, 2 e 4, mas diferiu do e as amostras de água do arroio não diferiram entre si. Pode-se assim observar, que no houve um maior crescimento das raízes em 35

4 relação aos demais. De acordo com estudos de Vesna (1996), a toxicidade de líquidos é indicada pela diminuição do crescimento das raízes, onde amostras de água de superfície e de fundo testadas não apresentaram toxicidade. Estes dados corroboram com os observados nesse trabalho, onde nas amostras de água testadas não houve a diminuição do crescimento das raízes, sendo assim não comprovando a toxicidade das mesmas. Os resultados observados no Allium teste na coleta de verão (Tabela 1) indicam que para as variáveis IM e crescimento das raízes, não houve diferença estatística significativa (p>0,01). Comprovando que tanto o controle como as diferentes amostras do Arroio Padre Doutor, não apresentaram efeitos citotóxicos e tóxicos sobre as variáveis testadas. Segundo Grant (1982), o Allium teste é usado na determinação de efeitos citotóxicos e/ou genotóxicos de diversas substâncias, assim como na determinação de efeitos tóxicos em águas de diferentes origens, tanto industriais quanto domésticas (Somashekar & Gurudev, 1985; Nielsen & Rank, 1994; Vesna et al., 1996; Rank & Nielsen, 1998). Tais substâncias e efluentes industriais e domésticos possivelmente não influenciaram na avaliação desses efeitos na estação do ano estudada. Na coleta de outono, os resultados estatísticos para as variáveis IM e crescimento das raízes foram altamente significativos nas diferentes amostras de água testadas do Arroio Padre Doutor, comprovando o efeito tóxico e citotóxico das mesmas (p<0,01). A estação do ano em estudo foi mais sensível aos testes realizados e aos efeitos dos mesmos. Nos resultados obtidos no IM na coleta de outono, o controle não diferiu das amostras do, 2 e 4, diferindo somente do que apresentou um maior número de células em divisão. Esse, por sua vez, nos resultados do índice mitótico não diferiu do e nos resultados do número de metáfases não diferiu do e 4. Os demais tratamento em relação ao houve um decréscimo do número de células em divisão, isso pode ser explicado por Vesna (1996). Em seu estudo, a diminuição do índice mitótico de células meristemáticas de raízes de cebola foi avaliado por ser um mecanismo confiável de determinação da presença de substâncias citotóxicas no ambiente, por monitoramento dos níveis de poluição em ambiente e por valores de poluição na água. Esses parâmetros são sensíveis quando usados no monitoramento de níveis de poluição em águas contaminadas. Para a variável crescimento das raízes, o controle diferiu das amostras do e 2 mas não do 3 e 4. Entre as amostra do arroio apenas os Pontos 2 e 3 diferiram entre si. Podemos avaliar que nessa variável, o crescimento das raízes foi maior no e menor no controle negativo do experimento. Ou seja, a água utilizada para o abastecimento do município do Capão do Leão apresentou um incremento do crescimento das raízes de cebola. Segundo Vesna (1996), o Allium teste pode indicar a presença de substâncias citotóxicas, genotóxicas e mutagênicas no ambiente, no qual representa direta ou indiretamente os riscos para os organismos que necessitam da água. Na coleta de inverno os resultados obtidos através do Allium teste mostraram que a análise de crescimento das raízes não apresentou diferença estatística significativa nos diferentes pontos analisados do Arroio Padre Doutor, não comprovando assim o efeito tóxico das mesmas (p>0,01). Referente a análise do IM, os resultados obtidos foram altamente significativos nos pontos testados (p<0,01). Os resultados para o controle não diferiram dos demais pontos enquanto apenas o diferiu estatisticamente do Ponto 2, onde observa-se uma diminuição no IM. Isso mostra que a citotoxicidade induzida por substâncias presentes nessas amostras interferiram no ciclo celular (Barbério et al., 2009). No inverno pode ser observado um efeito inverso do que ocorreu no outono na variável crescimento das raízes, o apresentou uma diminuição acentuada nas células de cebola em divisão testadas com água da amostra. A inibição da atividade mitótica é sempre usada para detectar vestígios de substâncias citotóxicas (Linnainmaa et al.,1978). Segundo Leme & Marin-Morales (2009), as anormalidades cromossômicas em células de Allium cepa são parâmetros eficientes para a investigação do potencial genotóxico águas contaminadas, pois fornecem informações importantes que devem ser consideradas no biomonitoramento ambiental. Nas células meristemáticas das cebolas, o aparecimento de aberrações cromossômicas nas estações de primavera, verão e inverno não foi significativo. Já na coleta de outono houve o aparecimento de algumas aberrações nos cromossomos das células de cebola do tipo ponte anafásica e quebra de fuso acromático (Figuras 3A e 3B), mas em número não significativos, não comprovando o efeito genotóxico das amostras. Como A Figura 3A. Alterações observadas em células meristemáticas radiculares de cebola submetidas a diferentes amostras de água do Arroio Padre Doutor A. Formação de ponte anafásica. Aumento de 1000X. 36

5 CUCHIARA, C.C. Biomonitoramento de Cursos D Água de Importância Econômica e Social: estudo de caso do Arroio Padre Doutor, Capão do Leão, RS, Brasil f. Monografia de Conclusão de Curso (Bacharelado em Ciências Biológicas) Instituto de Biologia, Universidade Federal de Pelotas, Pelotas, Figura 3B. Alterações observadas em células meristemáticas radiculares de cebola submetidas a diferentes amostras de água do Arroio Padre Doutor B. Quebra de fuso acromático. Aumento de 1000X. mostra a figura, quebras de cromátides ou cromossomos podem ser comprovados pela formação de pontes anafásicas bem como a ocorrência de perdas de fragmentos cromossômicos (Fiskesjö, 1993). Barbério (2009) detectou efeito genotóxico significativo observado no Rio Paraíba do Sul, sendo que a presença de micronúcleos, pontes cromossômicas, c-mitoses, anáfase com multipolaridades, outras aberrações cromossômicas e número total de células anômalas apresentaram aumento significativo. Conclusões Os dados observados nesta pesquisa permitem concluir que através do bioensaio realizado utilizando o teste Allium não foram detectados efeitos genotóxicos significativos nos parâmetros macroscópicos analisados nas diferentes estações do ano; também não foram observados efeitos citotóxicos influenciando o índice mitótico das células meristemáticas de cebola. Referências BARBÉRIO, A.; VOLTOLINI, J.C.; MELLO, M.L.S. Standardization of bulb and root sample sizes for the Allium cepa test. Ecotoxicology, Londres, v. 20, n. 4, p , Disponível em: < content/2m8427v h1/>. Acesso em: 7 fev BARBÉRIO, A.; BARROS, L.; VOLTOLINI, J.C.; MELLO, M.L.S. Evaluation of the cytotoxic and genotoxic potential of water from the River Paraíba do Sul, in Brazil, with the Allium cepa L. test. Brazilian Journal of Biology, São Carlos, v. 69, n. 3, p , Disponível em: < Acesso em: 7 fev B EGITO, L.C.M.; MEDEIROS, M.G.; DE MEDEIROS, S.R.B.; AGNEZ-LIMA, L.F. Cytotoxic and genotoxic potential of surface water from the Pitimbu river, northeastern/rn Brazil. Genetics and Molecular Biology, Ribeirão Preto, v. 30, n. 2, p , Disponível em: < Acesso em: 7 fev EVSEEVA, T.I.; GERAS KIN, S.A.; SHUKTOMOVA, I.I. Genotoxicity and toxicity assay of water sampled from a radium production industry storage cell territory by means of Allium-test. Journal of Environmental Radioactivity, Oxford, v. 68, p , Disponível em: < X >. Acesso em: 7 fev FATIMA, R.A.; AHMAD, M. Genotoxicity of industrial wastewaters obtained from two different pollution sources in northern India: A comparison of three bioassays. Mutation Research, Amsterdam, v. 609, p , Disponível em: < Acesso em: 7 fev FISKESJO, G. The Allium test an alternative in environmental studies: the relative toxicity of metal íons. Mutation Research, Amsterdam, v. 197, n. 2, p , Disponível em: < science/article/pii/ >. Acesso em: 11 fev FISKESJÖ, G. Allium test I: A 2-3 day plant test for toxicity assessment by measuring the mean root growth of onions (Allium cepa L.). Environmental Toxicology and Water Quality, Nova Iorque, v. 8, n. 4, p , Disponível em: < /tox /abstract>. Acesso em: 7 fev GRANT, W.F. Chromosome aberration assays in Allium. A report of the U.S. Environmental Protection Agency Gene- Tox Program. Mutation Research, Amsterdam, v. 99, n. 3, p , Disponível em: < sciencedirect.com/science/article/pii/ x >. Acesso em: 11 fev GRANT, W.F. Higher plant assays for the detection of chromosomal aberrations and gene mutations a brief historical background on their use for screening and monitoring environmental chemicals. Mutation Research, Amsterdam, v. 426, n. 2, p , Disponível em: < >. Acesso em: 11 fev

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